Streptozotocin-Nicotinamide로 유발된 당뇨병 쥐의 남성 생식 기능에 Cistanche Tubulosa 추출물이 미치는 영향-II
Sep 04, 2024
3.2. 생체 내 분석
3.2.1. CTE가 체중과 칼로리 섭취량에 미치는 영향
6주간의 실험 결과, 당뇨병군(HFD-DM)이 대조군에 비해 더 높은 체중을 나타내었다. HFD-DME4 그룹은 HFD-DM 및 HFD-DMER 그룹보다 체중이 낮았습니다 (그림 7a). 대조군의 칼로리 섭취량은 다른 그룹에 비해 현저히 낮았습니다. 다른 5개 그룹의 칼로리 섭취량에는 유의미한 차이가 없었습니다(그림 7b).
3.2.2. 당뇨병의 성공적인 유도를 결정하기 위한 경구 포도당 내성 검사(OGTT)
경구당내성검사(OGTT)는 당뇨병을 진단하는 유망한 도구로 사용됩니다. 혈액 내 포도당 수치가 증가하면 당뇨병 상태를 나타냅니다. 그림 8a에서 볼 수 있듯이 혈장 포도당 수준은 0, 30, 90, 120분에서 DM 그룹에 비해 CTE 그룹에서 더 낮았습니다. 또한, 혈장 포도당 농도의 곡선 아래 면적(AUC)은 CTE 및 RSG 그룹에서 혈당 흡수율이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 8b).
3.2.3. 총 혈장 포도당, 콜레스테롤, 중성지방 함량
혈장 공복혈당 수치는 다른 군에 비해 DM군에서 높았고, DME2군(대조군 제외)에서는 낮았다. 총콜레스테롤은 DME4군을 제외하고는 두 군간 유의한 차이가 없었다. DME4 그룹에서는 콜레스테롤 수치가 다른 그룹보다 낮았습니다. 중성지방 함량은 DM군에서 높았고 DME4군에서 낮았으며, CTE 농도가 증가함에 따라 중성지방 함량이 감소하였다(표 2). 그 결과 혈장 포도당, 콜레스테롤, 중성지방 수치는 DM군에서 높았고 CTE 치료군에서는 수치가 유의하게 감소한 것으로 나타났다.
3.2.4. 혈장 인슐린 수준, 혈장 렙틴 수준 및 항상성 모델 평가 - 인슐린 저항성(HOMA-IR) 값
혈장 인슐린, 렙틴 및 HOMA-IR 값은 표 3에 나와 있습니다. DM 그룹은 대조군보다 혈장 인슐린 및 혈장 렙틴 수준이 더 높았습니다. HOMA-IR 지수도 DM 그룹에서 유의하게 높았습니다. 혈장 인슐린, leptin 및 HOMA-IR 값은 CTE 농도가 증가함에 따라 감소했습니다. 혈장 leptin은 CTE군에서 유의하게 감소하였으나 RSG 약물군(DMR)에서는 DM군과 유의한 차이를 보이지 않았다.
3.2.5. 당뇨병 쥐의 혈장 LH 및 테스토스테론 수준에 대한 CTE의 효과
표 4에 나타난 바와 같이 당뇨병 쥐(DM)의 테스토스테론 농도는 유의하게 감소한 반면,테스토스테론 농도가 크게 증가했습니다.다양한 용량의 CTE. 또한, 결과는 DMR, DME1, DME2 및 DME4에 비해 DM 그룹의 LH 수준이 약간 감소한 것으로 나타났습니다. LH 생산량은 DME4 그룹에서 더 높았습니다.
3.2.6. 당뇨병 쥐의 정자 매개 변수에 대한 CTE의 영향
실험 결과, DM군은 대조군에 비해 정자 수와 운동성이 유의하게 감소한 반면, 정자 이상 비율은 DM군에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 흥미롭게도 DMR군의 정자수, 정자 운동성, 정자 이상율은 개선되었으나 정자 운동성은 DME4에 비해 유의한 수준에 도달하지 못했다. DME2는 모든 그룹보다 더 좋은 정자수를 보였고 DME4 그룹의 운동성도 유의하게 증가했습니다. RSG 처리군과 CTE 처리군 간 비정상 정자 수에는 유의한 차이가 없었습니다(표 5).
3.2.7. 당뇨병 쥐의 정세관 형태에 대한 CTE의 영향
그림 9는 고환 단면의 H&E 염색을 보여줍니다. 검은색 화살표는 Leydig 셀을 나타내고 흰색 화살표는 Sertoli 셀을 나타냅니다. DM군의 Leydig 세포와 Sertoli 세포 모두 상당한 위축을 보였고 내강에 공동이 보였습니다. Leydig 세포와 Sertoli의 구조는 CTE 및 RSG 처리 그룹에서 복원되었습니다. 정세관의 두께는 DM군에 비해 CTE군과 RSG군에서 더 높았다.
3.2.8. 당뇨병 쥐의 시상하부에서 CTE가 KiSS1, GPR54, SOCS-3 및 SIRT1 mRNA에 미치는 영향
KiSS1(그림 10a), GPR54(그림 10b), SOCS-3(그림 10d) 및 SIRT1(그림 10c)의 발현은 그림 10에 나와 있습니다. 당뇨병 쥐에서 KiSS1 및 수용체 GPR54의 mRNA 발현은 대조군에 비해 현저히 낮았다. DMR, DME1, DME2 및 DME4에서 KiSS1 및 GPR 54 mRNA 발현 수준이 크게 증가했습니다. 특히, GPR54 mRNA 발현은 DME4에서 유의하게 증가하여 대조군과 거의 유사하였다.
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이 실험에서는 쥐의 시상하부에서 SOCS-3 및 SIRT1 mRNA의 양을 추가로 조사했습니다. 당뇨병 쥐에서 SOCS-3 mRNA의 발현이 크게 증가했는데 이는 렙틴 임피던스가 더 심각하다는 것을 나타냅니다. DMR, DME1, DME2, DME4 그룹은 당뇨병 그룹과 비교했을 때 상당한 개선을 보였습니다. DM 그룹에서 SIRT1 mRNA 발현은 유의하게 감소하였고, DME1 및 DME4 그룹에서는 유의하게 증가하였다.
3.2.9. 당뇨병 쥐의 혈장 및 고환에서 CTE가 항산화 효소에 미치는 영향
표 6은 당뇨병 쥐의 혈장 SOD 활성, GPx 활성 및 카탈라아제 활성이 크게 감소하고 CTE 및 RSG 처리군에서 활성이 증가함을 보여줍니다. 이 외에도 DME4는 다른 것보다 GPx 활동이 크게 향상되었습니다. 결과는 당뇨병 쥐의 SOD와 카탈라아제 활성이 6주 후에 크게 감소한 것으로 나타났습니다. DMR 그룹의 SOD 및 카탈라아제 활성은 유의한 수준에 도달하지 않습니다. CTE 처리 그룹은 SOD 및 카탈라아제 활성이 크게 개선된 것으로 나타났습니다. CTE 그룹에서 카탈라아제와 SOD의 활성 증가는 고환에서도 나타났습니다(표 7). SOD와 카탈라아제의 가장 높은 활성은 각각 DME1 그룹과 DME2 그룹에서 관찰되었습니다.
3.2.10. 당뇨병 쥐의 혈장과 고환에서 CTE가 산화 스트레스와 염증에 미치는 영향
혈장(그림 11a)과 고환(그림 11b)에서의 산화질소(NO) 생성은 그림 11에 나와 있습니다. DM 그룹의 NO 생성은 대조군에 비해 고환과 혈장 모두에서 크게 증가했습니다. DME1, DME2 및 DME4 그룹(혈장 내)에서 NO 생성의 점진적인 감소가 관찰되었습니다. DMR 그룹은 또한 NO 생성의 상당한 감소를 보여주었습니다. 고환의 경우 CTE 그룹에서는 NO 생성이 약간 감소한 반면 DMR 그룹에서는 NO 생성이 크게 감소하지 않았습니다.
도 12 및 13에 나타난 바와 같이, 당뇨병 쥐의 TNF- 및 IL{3}} 수준이 (혈장 및 고환 모두에서) 유의하게 증가하여 염증이 더욱 심각함을 나타냅니다. 혈장에서 TNF- 수준은 CTE 처리군과 RSG 처리군에서 유사합니다(그림 12a). CTE 그룹(특히 DME2)은 고환에서 TNF- 수준을 크게 감소시켰습니다(그림 12b). IL-6 수준은 CTE 및 RSG 그룹의 혈장에서 크게 감소했습니다(그림 13a). 고환에서는 IL-6 수준이 감소하는 경향이 있었지만 이는 유의미한 수준에 도달하지 못했습니다(그림 13b).
3.2.1.1. 고지 방식으로 유도된 당뇨병 쥐의 정자에서 CTE가 산화 스트레스 및 염증에 미치는 영향
그림 14는 쥐 정자 내 과산화물 음이온 함량을 보여줍니다. 그 결과 당뇨병 쥐의 정자에서 과산화물 음이온 생성이 크게 증가한 것으로 나타났으며 DMR 그룹에서는 유의미한 개선이 관찰되지 않았습니다. DME1 및 DME4 그룹은 과산화물 음이온 생성이 크게 감소한 것으로 나타났습니다.
3.2.12. 고지 방식으로 유도된 당뇨병 쥐의 정자에서 지질 과산화에 대한 CTE의 효과
연구에 따르면 제1형 당뇨병 환자와 제2형 당뇨병 환자 모두에서 지질 과산화가 증가한 것으로 나타났습니다[19]. 혈장, 정자 및 고환의 말론디알데히드(MDA) 수준은 표 8에 나와 있습니다. DM 그룹의 혈장, 고환 및 정자 내 MDA 수준은 유의하게 높았으며 CTE 및 RSG 처리는 MDA 생성을 감소시켰습니다. 혈장 내 DME4 및 DMEI 그룹에서 상당한 감소가 관찰되었습니다. 이번 연구에서는 당뇨병 쥐의 혈장 내 지질 과산화 정도가 증가했을 뿐만 아니라 고환과 정자에서도 증가한 것으로 나타났습니다. 다양한 용량의 CTE에서 상당한 개선이 관찰되었습니다.
4. 토론
당뇨병은 혈액 내 높은 당 수치와 관련된 만성 질환입니다. 항산화제와 ROS 수준 사이의 불균형은 산화 스트레스라는 상태로 이어집니다. 과산화물, 수산기 라디칼, 과산화수소, 산화질소 및 일중항 산소는 산화 스트레스를 통해 당뇨병 상태에 기여하는 ROS의 일부 예입니다[20].시스탄체 튜불로사다음과 같은 활성 성분을 함유한 사막 식물입니다.다당류, 올리고당, 페닐에타노이드 배당체(에키나코사이드, 베르바스코사이드), 팔미트산, 리놀레산, 이리도이드, 알디톨 및 리그난. 이 식물은 항염증, 신경 보호, 항균, 항바이러스, 항산화, 항종양 및 면역 조절 효과를 생성할 수 있습니다[21]. 문헌 연구에 따르면 Cistanche tubeulosa의 페닐에타노이드 글리코사이드가 항산화 활성의 주요 원인인 것으로 나타났습니다[22]. 레스베라트롤(RES)과 로시글리타존(RSG)은 각각 시험관 내 및 생체 내 연구의 양성 대조군으로 사용되었습니다. RSG는 강력한 인슐린 증감제이며 퍼옥시솜 증식인자 활성화 수용체(PPARc)의 이소형에 대한 친화성을 가지고 있습니다. 당뇨병 환자의 고혈당증을 조절합니다 [23]. RES는 천연 항산화 활성을 가지며 혈관 확장제 역할을 하여 지단백질 대사를 조절하고 혈소판 응집을 억제하며 암을 예방합니다[24,25]. 우리의 조사에 따르면 ECH는 CTE 및 RES보다 더 나은 라디칼 소거 활성을 나타냅니다(그림 1). 또한 ECH는 LC-540 및 TM3 Leydig 세포에 심각한 독성을 유발하지 않는 것으로 이해됩니다(그림 2).
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AGE는 Leydig 세포에서 스트레스 조건을 유도하는 데 사용되었습니다. AGE의 생성, 염증, 산화 스트레스 및 당뇨병은 서로 연결되어 있습니다. 당뇨병의 고혈당 상태는 AGE 생성과 산화 스트레스를 통해 세포 손상을 촉진합니다. AGE는 세포 독성을 유발하여 면역 세포 모집과 세포 사멸을 더욱 촉진합니다. AGE 수치가 높아지면 RAGE와 AGER1이라는 두 가지 유형의 수용체 발현이 촉진됩니다. 산화 스트레스 동안 미토콘드리아 호흡 사슬에서 분자 산소로 전자가 떨어지는 것과 그에 따른 전자 전달로 인해 초산화물 음이온이 형성됩니다. 우리의 결과는 AGE에 의해 유도된 과산화물 음이온의 생성이 대조군에서 증가했으며 ECH와 RES 처리 모두에서 추가 개선이 관찰되었음을 보여줍니다. 우리의 연구에 따르면, AGE에 의해 유도된 과산화물(그림 3)과 H2O2(그림 4) 생성은 ECH와 RES의 존재 하에서 감소하는 것으로 이해되었습니다.
NF-κB는 당뇨병과 관련된 염증의 중요한 매개자로 알려져 있습니다 [27]. NF-κB의 발현은 세포 기능 장애 및 세포 사멸을 유발합니다. 산화 스트레스에 의한 NF-κB의 활성화는 전 염증 반응, 엔도텔린의 상향 조절 및 세포 사멸을 자극합니다 [28]. RAGE 및 NF-κB의 발현은 AGE 자극 그룹에서 증가했으며 ECH 및 RES 처리 세포에서는 후속 감소가 관찰되었습니다 (그림 5).
테스토스테론단백 동화 스테로이드이며 주요남성호르몬콜레스테롤로부터 합성됩니다. 이 과정은 콜레스테롤 측쇄 절단 유전자(CYP11A)에 의한 콜레스테롤 측쇄의 산화적 절단으로 시작됩니다. 이 유전자는 미토콘드리아 막에 위치하며 콜레스테롤을 프레그네놀론으로 전환시킵니다. 다음으로, 소포체의 CYP17A1 유전자는 두 개의 추가 탄소 원자를 제거하고 여러 C19 스테로이드를 생성합니다. 이 외에도 프레그네놀론은 하이드록시스테로이드 탈수소효소(3- -HSD)에 의해 산화되어 안드로스텐디온/프로게스테론을 형성합니다. 마지막으로 테스토스테론은 17-베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소(17- -HSD)에 의해 안드로스텐디온의 17번째 탄소 위치에 있는 케토 그룹이 환원되어 생성됩니다. 라이디히 세포는 테스토스테론의 주요 생산에 관여합니다. 콜레스테롤을 미토콘드리아 내부 막으로 전달하려면 스테로이드 생성 급성 조절 단백질(StAR)의 작용이 필요합니다. 현재 연구에 따르면 StAR, CYP11A1, CYP17A1 및 HSD17 3의 발현은 AGE 처리 세포(대조군)에서 감소했으며 ECH 및 RES 처리 세포에서는 엄청난 증가가 나타났습니다(그림 6). . 따라서 결과는 생산이테스토스테론은 ECH 및 RES 치료 그룹에서 증가했습니다.
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당뇨병 상태에서는 포도당이 장기로 이동하는 것이 제한되어 결과적으로 포도당 수치가 증가합니다[29]. 따라서 고혈당 상태는 당뇨병 진단의 중요한 지표 중 하나입니다. 우리의 연구에 따르면 당뇨병 그룹에서 혈장 포도당 수준이 증가했으며 DM 그룹의 AUC가 다른 그룹보다 유의하게 높았습니다(그림 8). 혈장 포도당과 함께 총 콜레스테롤 및 중성지방 함량은 DM 그룹에서 유의하게 증가했습니다(표 2). 죽상동맥경화증은 콜레스테롤과 중성지방 수치가 증가하면 촉진됩니다. 그러나 CTE 및 RSG 처리군에서는 콜레스테롤과 중성지방 수치가 감소했습니다. DME4군의 트리글리세리드 함량은 대조군과 거의 유사한 수치에 도달했습니다.
인슐린은 췌장 세포에서 생성되는 호르몬으로 체내 혈당 수치를 조절하는 기능을 갖고 있으며, 렙틴은 지방 세포에서 생성되어 음식 섭취와 에너지 이용을 조절할 수 있는 호르몬입니다. 연구에 따르면 렙틴은 비만의 병태생리학에 관여하며 렙틴과 인슐린 사이에 긍정적인 상호 작용이 있는 것으로 나타났습니다[31]. 우리의 연구에 따르면 혈장 이눌린과 렙틴 수준은 DM 그룹에서 더 높았으며 CTE 농도가 증가함에 따라 인슐린 수준이 감소했습니다. RSG 그룹은 DM 그룹과 큰 차이를 보이지 않습니다. 인슐린 저항성과 세포 기능은 HOMA-IR 방법으로 평가되었습니다. HOMA-IR 값은 DM 그룹에서 증가했으며 다른 그룹과 유의미한 차이를 보였습니다(표 3).
DM은 HPG 축의 호르몬 변화를 통해 생식 기능에 영향을 미치며 연구에 따르면 고환의 인슐린 발현도 당뇨병의 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 이는 Sertoli 세포 공포화, DNA 단편화 증가, 정자 형성 장애 및 생식 세포 고갈 증가를 특징으로 합니다. 산화 스트레스는 또한 생식 기능의 이상에 기여합니다 [32]. 남성 생식 기관(고환)에서 정자가 형성되는 과정을 정자 형성이라고 합니다. 고환은 정세관이라고 불리는 단단히 감겨진 세관으로 구성됩니다. 세르톨리 세포는 정세관의 벽에서 볼 수 있으며 미성숙 정자에게 영양을 공급합니다. 정자 매개변수를 조사한 결과 DM군에서 정자 수와 운동성이 감소하고 이상이 증가하는 것으로 나타났습니다(표 5). CTE 및 RSG 처리 그룹에서는 반대 효과가 관찰되었습니다. DM 그룹의 Leydig 세포와 Sertoli 세포 모두 상당한 위축을 보였고 내강에 공동이 보였습니다. DM군에서는 정세관의 두께도 감소하였다. CTE 및 RSG 처리 그룹에서 개선된 결과가 관찰되었습니다(그림 9). 이 외에도 DM군에서는 LH와 테스토스테론 수치가 감소했고, CTE 투여군에서는 수치가 증가했다(표 4). 남성의 경우 낮은 혈청 테스토스테론과 낮은 LH 맥박 빈도는 비만 및 제2형 당뇨병과 관련이 있는 경우가 많습니다[33].
KiSS1 유전자에 의해 암호화된 Kisspeptin은 HPG 축의 강력한 자극제로 알려져 있으며, Kisspeptin 유전자의 돌연변이로 인해 성 스테로이드와 성선 자극 호르몬 수치가 낮아집니다. 연구에 따르면 STZ로 유발된 당뇨병 쥐에서 Kiss1 mRNA 수준이 감소한 것으로 나타났습니다[33]. 포유류 불임의 시작과 유지는 G-단백질 결합 수용체 54(GPR54)와 연결되어 있습니다. GPR 54의 돌연변이는 성적 성숙이 없고 성선 자극 호르몬(LH 및 FSH) 수치가 낮은 것이 특징입니다. IL-6 및 TNF-와 같은 전염증성 사이토카인은 간 및 지방세포에서 염증 매개 인슐린 저항성과 관련된 SOCS3(사이토카인 신호 전달 3 억제 인자)의 발현을 상향 조절합니다[34]. SIRT 1은 여러 노화 질환의 조절과 관련된 유전자입니다. 이 유전자는 췌장 세포에서 두드러지게 발현되며 인슐린 분비를 조절하고 세포사멸을 예방합니다. 현재 연구에 따르면 DM 그룹에서는 KiSS1, GPR54 및 SIRT1의 발현이 감소했지만 CTE 처리 그룹에서는 발현이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 10). DM 그룹에서 SOCS-3 표현의 증가는 염증 상태를 나타냅니다. 비만과 염증 사이에서 확인된 첫 번째 분자 연결은 TNF-입니다. 따라서 TNF- 수치의 증가는 염증의 지표입니다. TNF- 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인의 수준 감소는 CTE 치료 그룹에서 나타났습니다(그림 12 및 13).
ROS와 항산화제 사이의 불균형은 당뇨병 상태를 유발합니다. SOD(과산화물 디스뮤타제), CAT(카탈라제) 및 GPX(글루타티온 퍼옥시다제)는 최적의 ROS 수준을 유지하는 주요 항산화제로 알려져 있습니다[35]. 그 결과, 항산화제 활성이 DM군에서 현저히 낮은 것으로 나타났다. CT 치료군에서는 항산화제 생산이 개선된 것으로 나타났습니다. RSG 처리군에서는 항산화 활성이 크게 향상되지 않았습니다(표 6 및 7).
산화질소(NO)는 염증에 기여하는 중요한 ROS로 알려져 있습니다. 우리의 연구에 따르면 CTE 치료 그룹에서는 NO 수준이 감소한 것으로 나타났습니다(그림 11). 연구 결과, 당뇨병 쥐의 정자 내 과산화물 음이온 함량이 유의하게 증가한 것으로 나타났으며, RSG 투여 후 유의미한 개선이 나타나지 않았습니다. CTE 그룹에서는 과산화물 생성이 감소했습니다.
MDA 측정은 지질 과산화를 평가하는 데 매우 유용합니다. 지질 과산화는 지질의 산화 과정이며 최종적으로 세포 손상을 초래합니다. MDA는 다중불포화지방산의 지질 과산화의 결과로 생성됩니다. 연구에 따르면 MDA 수준은 연령 및 공복 혈당 수준과 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다[36]. 현재 연구에서는 CTE가 혈장, 고환 및 정자의 지질 과산화를 개선하는 것으로 나타났습니다(표 8).
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5. 결론
당뇨병 상태의 산화 스트레스는 정자 손상 및 생식선 기능 장애를 통해 남성 생식 기관을 방해합니다. Cistanche tubeulosa는 약리학적 효과로 인해 한의학에서 널리 인정되는 사막 식물입니다.에키나코사이드(ECH)항산화 및 항염증 활성을 담당하는 CTE의 주요 구성성분입니다. 우리의 시험관 내 결과는 ECH가 테스토스테론 합성 경로를 복원하고 NF-κB 및 RAGE 단백질 발현 수준을 낮추는 것으로 나타났습니다. ECH는 레이디히(Leydig) 세포에서 과산화물 음이온과 H2O2의 생성을 효과적으로 억제했습니다. 생체 내 연구에서는 ECH가 콜레스테롤, 트리글리세리드, TNF- 및 IL-6 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 또한, 당뇨병 쥐의 시상하부에서 mRNA 발현이 크게 개선되었습니다. ECH가 당뇨병 수컷 쥐의 지질 과산화를 감소시키고 인슐린 저항성을 개선했다는 점도 주목할 만합니다. 혈장과 고환 모두에서 항산화 활성이 증가했습니다. 따라서 우리의 연구는 ECH가 STZ 유발 당뇨병 수컷 쥐의 생식 기능 장애에 대한 효과적인 보호를 제공한다고 제안했습니다.
