H2O2에 의한 토끼 RTEC 손상에 대한 Cistanches Deserticola 추출물의 효과

추상적인: 토끼 신세뇨관 상피세포를 체외배양하여 H2O2가 세포증식에 미치는 영향과 H2O2에 의해 손상된 세뇨관 상피세포에 Cistanche deserticola 추출물이 미치는 영향을 알아보았다. MTT 방법으로 H2O2가 토끼 신세뇨관 상피세포의 증식에 미치는 영향과 2,20 및 200 mg·L － 1 C．의 보호 효과를 관찰하기 위해 세포 형태를 사용하였다. Deserticola 물 추출물과 알코올 추출물은 LDH 방출에 의해 연구되었습니다． 그 결과 세포의 형태학적 변화가 점차 증가하는 것으로 나타났다. 부착된 세포의 수는 점차 감소하였다． H2O2 ． 고용량의 C． Deserticola 추출물은 H2O2에 의한 ＲTECs 증식 억제 효과를 유의하게 감소시킬 수 있었습니다( P ＜ 0． 01) ． C．의 물 추출 및 알코올 추출물 deserticola는 LDH 방출을 크게 감소시킬 수 있습니다( P ＜ 0． 01) ． H2O2는 토끼의 ＲTECs 증식 반응에 어느 정도 영향을 미쳤으나 C． Deserticola 추출물은 H2O2에 의한 ＲTECs 손상에 대한 보호 효과가 있습니다.

키워드: Cistanches deserticola; 신세뇨관 상피세포; 세포 손상 서문

사막 인삼으로도 알려진 Cistanche deserticola는 Orobaceae 계통의 Cistanche deserticola YC Ma 또는 Cistanche tubulosa(Schenk) Wish의 건조하고 비늘 모양의 엽육 줄기입니다. 신장양을 보하고 정혈을 보하며 장을 촉촉하게 하고 변비를 해소하는 효능이 있다. 전통적으로 신장양허증, 진액허혈, 발기부전 및 불임, 허리와 무릎통증, 근육과 뼈의 허약, 장건조증과 변비에 사용되어 역사상 가장 많이 사용된 신장양약이다.. 

Cistanche Deserticola

활성 산소종의 한 형태인 H2O2는 지질 과산화 유도에 강한 영향을 미치며 거의 모든 세포 성분과 반응하여 사슬 지질 과산화를 일으켜 세포 사멸 및 기능 장애를 유발합니다[2,3]. 실험은 주로 H2O2-로 유도된 토끼 신장 관 상피 세포의 증식 억제 및 손상에 대한 Cistanche deserticola 추출물의 효과를 조사하고 신장 관 상피 세포에 대한 보호 효과를 예비적으로 조사합니다.

1 재료 및 방법

1.1 실험약

Cistanche deserticola ma는 Sichuan Chuannan Pharmaceutical Co., Ltd.(배치 번호 151201)에서 구입했습니다.

사막 생활 cistanche

1.2 동물

동물 허가 번호 SCXK(Guizhou) 2012-001로 Guizhou Livestock Research Institute의 실험 기지에서 구입한 20일 된 뉴질랜드 흰 토끼, 수컷,.

1.3 시약

DMEM/F-12(1:1), Gbico Corporation; 태아 소 혈청, Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd; 디메틸 설폭사이드(DMSO), Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd; H2O2, Sichuan Jinshan Pharmaceutical Co., Ltd; Amresco Company의 트립신; 티아졸 블루(MTT), Genview; 비방사성 세포독성 시험 키트, Promega Corporation; 무수 에탄올, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.

1.4 악기

CO2 인큐베이터, Type 3111, Thermo Fisher Scientific; 효소 마커, 1510형, Thermo Fisher Scientific; 울트라 클린 작업대, SW-CJ-1FD, Suzhou Purification Equipment Co., Ltd; 거꾸로 된 형광 현미경, Ningbo Shunyu; 회전 증발기, RE-52AA, Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory; 동결건조기, LGJ-12, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.

1.5 방법

1. 5.1 Cistanche deserticola 추출물의 제조

Cistanche deserticola의 말린 약초를 가져다가 작은 조각으로 갈아줍니다. 각 분말 100g을 정밀히 달아 10배의 증류수와 75% 에탄올을 넣고 가열 환류하여 3회 추출한다. 1차는 3시간, 2차는 1 5시간, 3차는 1시간, 여과액 3개를 합하고 감압농축하여 추출액 수율을 22 30퍼센트로 계산하고, 에탄올 추출물 21 70퍼센트 , 휘발성 잔류 알코올, Cistanche deserticola에서 물과 알코올 추출물을 얻기 위한 동결 건조 메커니즘, 밀봉, 건조 및 향후 사용을 위해 어두운 곳에 보관.

1. 5. 2 세포 배양

Zhao Dan et al.에 의해 기술된 방법을 사용하여 신장 관형 상피 세포 모델을 구축합니다. [4], 20-일된 토끼로부터 일차 신세뇨관 상피 세포를 분리 및 배양하고 세포가 배양 접시의 90% 이상으로 성장할 때까지 기다린 다음 트립신으로 소화합니다. DMEM/F-12 1% fetal bovine serum을 포함하는 완전배양배지를 이용하여 12×104 세포를 96 well plate에 접종하고 37도, 5% CO2에서 배양하였다.

1. 5. 3 3H2O2로 유도된 토끼 신세뇨관 상피세포 손상 모델 구축

1 5을(를) 참조하십시오. 2 세포를 접종하고 48시간의 안정적인 세포 배양 후 손상을 위해 H2O2를 사용합니다. 각 그룹에서 4회 반복하고 세 번 반복하여 실험 그룹과 빈 제어 그룹을 설정합니다. 실험군: H2O2의 농도를 달리하여 완전 배양 배지를 H2O2 농도가 각각 550, 500, 450, 400 및 350 μ Mol · L-1로 교체, 블랭크 대조군: 완전 배양 배지를 교체, 37도, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 계속 배양하여 현미경 검사를 하고 사진을 수집한다. H2O2 작용 후 세포의 증식을 측정하기 위해 MTT[5] 방법을 사용하였으며, 흡광도 값(OD 값)은 490 nm에서 측정하였다. 비방사성 세포독성 검출 키트를 사용하여 H2O2 처리 후 세포 LDH 방출의 변화를 확인하여 LDH 방출(백분율)=상층액 LDH 양/(상층액 LDH 양 더하기 용해물 LDH 양) × 100%. AO/EB 형광 염색[6]: 각 μL에 각각 100μG/mL AO 용액과 100μ 100g/mL EB 용액을 취합니다. 잘 혼합하고 각 웰에 10μL를 추가합니다. 즉시 역위상 대조에 놓습니다. 관찰용 형광현미경을 사용하여 관찰 시야를 5분 이내로 유지하고 청색광 450±10nm, 녹색광 532±10nm에서 영상을 수집한다. 형광 합성을 위한 형광 수집 시스템을 사용하여 형광 염색 이미지를 얻습니다.

1. 5. 4 토끼 신세뇨관 상피세포에 대한 H2O2- 유발 손상에 대한 4 Cistanche 추출물 분말의 효과

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1 5에 따르면. 2 세포를 접종하고 안정적인 세포 배양 24시간 후 Cistanche deserticola 추출물이 포함된 완전 배양 배지 200ul를 각 웰에 추가하여 24시간 동안 세포를 사전 보호합니다. 그룹당 세 번 반복하여 실험 그룹, 모델 그룹 및 빈 제어 그룹을 설정합니다. 실험군 및 모델군: mol · L-1 H2O2가 포함된 400 μ 완전 배양 배지로 교체; 블랭크 대조군: 완전 배양 배지. 24시간 동안 계속 배양한다. 세포 증식은 MTT 방법을 이용하여 측정하였고, 세포 LDH 방출의 변화는 비방사성 세포독성 분석 키트를 이용하여 측정하였다.

1.6 통계 처리

데이터 결과는 SPSS 19 0 통계 소프트웨어를 사용하여 x ± s로 표현되며 통계 분석에 사용되었습니다. 그룹 간 비교에는 단일 요인 분산 분석이 사용되었고 그룹 간 다중 비교에는 LSD 방법이 사용되었으며 P<0 05 indicating statistical significance.

2 결과 및 분석

2.1 H2O2에 의해 유도된 토끼 신세뇨관 상피세포의 형태학적 변화

토끼 신세뇨관 상피세포를 24시간 동안 다양한 농도의 H2O2로 처리한 후 토끼 신세뇨관 상피세포의 형태를 현미경으로 관찰하였다. 형태적 변화가 점차 증가하면서 정수리 세포에 부착하는 세포의 수가 점차 감소하고 일부 세포는 길어지고 세포 광택이 감소하며 크기가 감소합니다. H2O2의 농도가 550μMol·L-1에 도달하고, 축삭이 사라지고, 세포막이 파열되고, 세포가 수축되고, 세포 간극이 증가하고, 세포 패치 사이에 간극이 나타납니다.

그림 1 토끼의 형태에 대한 H2O2 농도의 영향RTEC( 100 × )

2.2 토끼 신세뇨관 상피세포의 증식에 대한 2.2 H2O2의 영향

각각 350, 400, 450, 500, 550 μ Mol · L-1 H2O2 처리된 토끼 신세뇨관 상피세포를 사용하여 24시간 동안 MTT 방법을 이용하여 흡광도를 측정하였다. 결과는 다양한 농도의 H2O2가 토끼 신장 세뇨관 상피 세포의 증식에 억제 효과를 갖는 것으로 나타났으며, IC50 값은 439 07 μ mol·L － 1,500 μ mol·L에 따른 H2O2의 억제 효과 세포 증식에 ​​대한 -1은 24시간 후에 50% 이상에 도달할 수 있으므로 후속 연구를 위해 이 농도를 선택했습니다.

2.3 토끼 신세뇨관 상피 세포에서 LDH의 방출에 대한 2.3 H2O2의 효과

토끼 신세뇨관 상피 세포에 H2O2 처리 24시간 후, 비방사성 세포독성 검출 방법을 사용하여 세포 상층액과 세포 용해물의 LDH 반응의 OD 값을 측정하고 세포에서 LDH의 방출을 계산했습니다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. H2O2 농도에 따라 토끼 신세뇨관 상피세포에서 LDH 방출이 증가할 수 있으며, H2O2 농도가 높을수록 농도 의존적으로 LDH 방출이 증가한다. 400mmol · L-1 농도의 H2O2는 세포 LDH 방출이 빈 그룹을 50% 이상 초과하여 심각한 세포 손상을 초래합니다.

탭. 1 토끼 RTEC에서 LDH 방출에 대한 H2O2의 영향

참고: 빈 대조군과 비교하여 * P<0 05; ＊＊ P ＜ 0. 01

2.4 2.4 H2O2로 처리한 토끼 신세뇨관 상피세포의 AO/EB 형광염색 결과

토끼 신세뇨관 상피세포를 H2O2로 24시간 처리한 후 그림 2와 같이 세포를 AO/EB 형광으로 염색하였다. 괴사를 일으킴. H2O2의 농도가 다르면 H2O2 농도가 400 μ 미만인 토끼 신장 세뇨관 상피 세포에서 다양한 정도의 괴사를 유발할 수 있습니다. 초기 아폽토시스. H2O2 농도가 증가함에 따라 450 μ 이상 mol·L-1에서 세포는 주황색-적색의 비둥글한 비드 형태를 보였고 괴사 세포의 수는 농도 의존적으로 증가하였다.

2.5 토끼 신세뇨관 상피세포의 H2O2-유도 증식에 대한 2.5 Cistanche deserticola의 영향

Cistanche deserticola에 대한 실험적 연구

Cistanche deserticola의 물과 알코올 추출물의 다양한 농도(2, 20, 200 mg! L-1) 하에서 토끼 신세뇨관 상피 세포의 생존율은 개입 없이 정상적인 조건에서 배양된 세포와 비교하여 큰 차이를 보이지 않았습니다. Figure 3에 나타난 바와 같이, Cistanche deserticola의 알코올 및 물 추출물의 고농도 그룹은 모델 그룹에 비해 토끼 신세뇨관 상피 세포의 증식에 대한 H2O2의 억제 효과를 유의하게 감소시켰다(P<0 01).

그림 2 토끼의 AO/EB 염색R다양한 농도의 H2O2로 처리된 TECs( 100 × )

참고: 모델 그룹과 비교하여 * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

그림 3 C．의 효과 H2O2 억제에 대한 deserticola - 유도 토끼RTEC 확산

2.6 H2O2 유도 손상에 대한 2.6 Cistanche deserticola의 토끼 신세뇨관 상피 세포에 대한 영향

세포에서 LDH의 방출에 대한 영향의 결과는 그림 4에 나와 있습니다. Cistanche deserticola의 에탄올 추출물과 물 추출물의 고, 중, 저농도 그룹은 H2O2 후 토끼 신장 세뇨관 상피 세포에서 LDH 방출을 상당히 낮췄습니다. 모델군(P<0 01), the results are concentration-dependent, with higher concentrations leading to lower cell LDH release.

참고: 모델 그룹과 비교하여 * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

그림 4 C．의 효과 H2O2에 대한 deserticola － 토끼로부터 유도된 LDH 방출RTEC

3 토론

"사막 인삼"으로 알려진 Cistanche deserticola는 약용 가치가 매우 높으며 유명한 중국 강장제입니다. "신농본초본"[7]은 최상급 의학을 다음과 같이 설명합니다. 맛이 달고 온도가 온화하여 일류약으로 등재되어 있다. "유명한 의사 목록"[8]은 Cistanche deserticola가 "신맛, 짠맛, ​​무독성"이라고 지적합니다. 이후 한약의 여러 왕조에서 Cistanche deserticola의 성질, 맛 및 자오선에 대한 기록은 일관됩니다. 성질은 약간 따뜻하며 맛은 달고 시고 시고 짜며 신장과 대장 경락에 속한다. 전통적으로 신장양결핍, 허리와 무릎의 통증, 근육과 뼈의 허약에 사용되었으며, 그 약리학적 효과와 메커니즘은 항상 연구의 초점이었습니다. 현대 약리학 연구에 따르면 Cistanche deserticola는 노화에 저항하고 학습 및 기억 능력을 향상시키며 면역 기능을 조절할 수 있습니다. 중국 전통 의학, 전통 중국 특허 의약품, 간단한 제제 및 건강 관리 제품의 임상 처방에 널리 사용됩니다.

내 근처의 Cistanche 보충제

산화 스트레스는 일부 주요 질병의 주요 유발 요인이며, 이는 체내에서 활성 산소종의 형성과 제거 사이의 불균형으로 인해 조직구에 어느 정도의 산화적 손상을 초래합니다. 따라서 스트레스 반응의 메커니즘에 대한 심층 연구를 통해 과민성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 제거할 수 있는 합리적인 방법을 찾을 수 있습니다. 산화 스트레스는 신체의 다양한 세포 및 단백질 과산화를 유발할 수 있으며 [9], H2O2는 연구에서 손상을 위한 외인성 물질 중 하나로 선택되었습니다. 그것은 지질 과산화 유도에 강한 영향을 미치고 연쇄 지질 과산화 반응을 일으켜 세포 사멸 및 기능 장애로 이어집니다. 현재 이 외인성 물질의 신독성 및 길항작용에 대한 연구는 주로 동물 모델 구축에 의존하고 있으며, 관련 연구를 위한 in vitro 모델 구축에 대한 문헌 보고는 상대적으로 적다. 신독성 동물모델과 비교하여 in vitro 신독성 세포모델은 명확한 작용표적, 짧은 투약주기, 저용량 등의 장점이 있다.

중국 허브 시탕슈

세포 형태의 변화, 세포 증식에 ​​대한 외인성 물질의 억제 효과 및 세포 LDH 방출의 변화를 통해 외인성 물질에 의해 유도된 in vitro 신독성 세포 모델을 연구합니다. 다른 농도의 H2O2는 세포의 형태학적 변화에 상당한 영향을 미칩니다. 외인성 물질의 농도가 증가함에 따라 세포 변형의 횟수가 증가함을 알 수 있다. MTT 분석은 살아있는 세포의 수를 검출하기 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다. 다양한 농도의 Cistanche deserticola가 토끼 신장 세뇨관 상피 세포를 H2O2 손상으로부터 보호하는 실험에서 다양한 농도의 Cistanche deserticola는 토끼 신장 세뇨관 상피 세포에 대한 H2O2의 억제율을 상당히 감소시켰으며 이는 농도 의존적입니다. 세포막이 손상되면 세포 내 LDH가 배양 배지로 방출됩니다. 세포 배양 배지의 LDH 함량은 세포 사멸을 감지하는 중요한 지표입니다. 이 연구는 H2O2-가 토끼 신장 세뇨관 상피 세포에 대한 손상을 유발한 모델 그룹의 세포 배양 배지에서 LDH 수준이 유의하게 증가한 반면, 다양한 농도의 Cistanche deserticola로 처리된 실험 그룹의 LDH 수준이 크게 증가했음을 발견했습니다. 농도 의존적으로 감소한다.연구 결과는 H2O2-로 인한 토끼 신세뇨관 상피세포 손상 모델을 확립하고 Cistanche deserticola 추출물이 신장세뇨관 상피세포에 미치는 보호 효과를 사전 탐색함으로써 산화적 스트레스에 의해 영향을 받지만 Cistanche deserticola의 개발 및 활용을 위한 기본 데이터를 제공합니다.

참조:

［1］ Ch. P(2015) Vol Ⅰ［S］． 2015: 135.

［2］ 김정호, 최우, 이정호 외. 아스타잔틴은 p38 및 MEK 신호 경로의 조절을 통해 마우스 신경 전구 세포에서 H2O2 - 매개된 세포사멸을 억제합니다[J]． Microbiol Biotechnol,2009,19( 11) : 1355 － 1363.

［3］ Siu PM, Wang Y, 항상 SE. 분화된 C2 Cl2 근관에서 산화 스트레스 매개 H2 O2에 의해 유도된 세포사멸 신호[J]． Life Sci,2009,84( 13) : 468 － 481. ［4］조단, 장쉐, 관징 등 여러 한약재가 토끼의 일차 신세뇨관 상피세포 증식에 ​​미치는 영향에 관한 연구 ［ J ]. 산악 농업 생물학 저널, 2017, 36 (4): 76-79

［5］ Chen Lizhen, Feng Tingting, Huang Junfei 등 ipriflavone이 파골세포 활성과 조골세포 증식 및 분화에 미치는 영향에 관한 연구 ［ J ］. 산악 농업 생물학 저널, 2015, 34(3): 042-047

［6］ Chen Meng, Li Huatao, Li Xiang 등 AO/EB 이중 염색 방법을 사용하여 in vitro에서 개의 유방 종양 세포에서 파클리탁셀 유도된 세포사멸의 검출[J]. Guangdong Livestock and Veterinary Science and Technology, 2011, 36 (1): 39-42

［7］ Gu GG, Yang P J. Shen Nong Ben Cao Jing［M］． 베이징: Xueyuan Press,2013: 73.

［8］ Tao HJ,Shang Z J. Ming Yi Bie Lu［M］． 베이징: People's Medical Publishing House,1986: 51.

［9］ Cash TP,Pan Y,Simon M C.Ｒ활성산소종과 세포산소감지［J］． Free Ｒadic Biol Med,2007,43( 9) : 1219 － 1225．