Cistanche Deserticola의 다양한 추출 부위가 Db/Db Black Mice의 혈당 강하 효과에 미치는 영향 Ⅱ

2 실험 방법

2.1 시스탄체 데저티콜라 가공 제품의 제조 시스탄체 데저티콜라:

시스탄체데데티콜라 약재를 취하여 불순물을 씻어내고 냄비에 넣어 상압으로 2시간 쪄서 6mm로 자르고 70도에서 건조시킨다. 시스탄체 데저티콜라: 시스탄체 데저티콜라 음편을 취하여 막걸리 적당량을 넣고 잘 섞은 후 8시간 동안 적시고(황주:물= 1:1) 고압으로 4시간 쪄서 100℃에서 건조시킨다. 70도. (시스탄체 데저티콜라 100g당 막걸리 30mL를 사용하세요.)

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2.2 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 다양한 추출 부위 농축

시스탄체데데티콜라/타마로코커스데세르티콜라분말 30g을 취하여 10배량의 물과 열을 가하고 2시간씩 2회 환류추출하고 추출물을 합하여 농축한 후 알코올도수 60%가 될 때까지 에탄올을 첨가하여 침전시킨다. 12시간 동안 저온에서 건조시킨 후 흡입하여 여과합니다. , 침전물은 조 다당류 부분입니다. 상등액을 적절한 농도로 농축한 후 D101 거대다공성 흡착수지에 적용한 후 농도가 다른 물과 에탄올을 순차적으로 사용하여 용출합니다. 물 용출액을 수집하고 감압 하에서 전체 올리고당 분획인 걸쭉한 페이스트로 농축합니다. 40% 에탄올로 씻는다. Cistanche Deserticola의 총 배당체 분율인 감압 하에서 탈액, 농축 및 건조합니다.

2.3 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 추출 부위별 함량 판별

2.3.1 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 총 다당류 함량 측정.

포도당 샘플 20의 무게를 측정합니다. 50 mL 용량 플라스크에 00 mg을 넣어 0를 만듭니다. 4mg·mL-1포도당 표준용액의 경우, 3, 4, 5, 6, 7mL를 각각 50mL 메스플라스크에 피펫팅하고 물로 희석하여 2.0mL를 피펫팅합니다. 각 농도 구배 포도당 용액을 시험관에 넣습니다. 공시험액으로 다시 동량의 증류수를 취하여 각 시험관에 5% 페놀 1mL를 넣고 잘 흔들어 준 후 재빨리 진한황산 5mL를 넣고 10분간 방치한 후 40도 수욕조에 넣어 1분간 방치한다. 15분 후 꺼내서 급히 상온으로 식힌 후 490nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도(A)를 세로축으로, 포도당 농도(C)를 가로축으로 하여 표준곡선을 그려 다음을 얻는다. 회귀 방정식 Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). 원료 및 제품의 총 다당류 분말 1.0 g을 정밀히 달아 50 mL 메스플라스크에 각각 넣고 물을 넣어 녹인 후 표시선에 맞춰 2.0 mL를 정확하게 시험관에 뽑아 시험관에 계량한다. 표준곡선 작성 방법과 동일합니다. , 그게 다야.

2.3.2 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 베타인 함량 측정

2.3.2.1 참조 용액 준비:

베타인표준액 1.17 mg을 정밀하게 달아 5 mL 메스플라스크에 넣고 50% 메탄올을 넣어 녹이고 부피만큼 희석하면 완성이다.

2.3. 2． 2 크로마토그래피 조건

크로마토그래피 컬럼은 Ecosil {{0}}AMINO 크로마토그래피 컬럼(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 이동상: 아세토니트릴-물(99.5 ∶ 0.5) , 컬럼 온도: 30 도, 검출 파장: 194 nm, 유속: 0.6 mL·min-1, 주입량 10 μL, 크로마토그램은 그림 1과 같습니다. 2.3.2.3 시험 용액의 조제 정확하게 원제품과 완제품의 전체 올리고당 분획분말 1.0g을 각각 5mL 메스플라스크에 넣고 증류수를 넣어 녹이고 묽혀서 잘 흔들어 0.45μL 미세다공성 여과막을 통과시키면 완성된다.

2.3.2.4 샘플 함량 결정

원료 및 제조된 시스탄체데세르티콜라의 총올리고당 시험용액을 정밀하게 흡수시켜 "2.3.2.2"의 조건에 따라 측정하여 검체중 베타인 함량을 구한다.

2.3.3 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 에키나코사이드, 베르바스코사이드, 헤테로사이미시푸가린 함량 측정

2.3.3.1 참조 용액 준비

에키나코사이드 4.50 mg, 베르바스코사이드 4.80 mg, 이종 코미미신 5.05 mg을 5 mL 메스플라스크에 정밀하게 달아 50% 메탄올을 넣어 녹이고 표시선까지 희석한 후 각 대조액을 취하여 검액 200 μL를 주사액에 넣는다 바이알에 50% 메탄올 400μL를 넣고 잘 섞어 혼합표준액을 만든 후 잘 흔들어주면 완성됩니다.

2.3.3.2 크로마토그래피 조건

크로마토그래피 컬럼은 Ecosil C18(4.6mm×250mm, 5μm), 메탄올은 이동상 A, 0.1% 포름산은 이동상 B, 기울기 용리, {{ 12}}~45분, 30% A→ 70% A, 유속은 1.0mL·min-1, 컬럼 온도는 30도, 검출 파장은 330nm, 주입량은 10μL, 크로마토그램은 그림 2에 나와 있습니다.

2.3.3.3 시험용액의 조제

원료 및 제품의 총배당체분말 1.0 g을 정밀히 달아 100 mL 메스플라스크에 넣고 50% 메탄올을 넣어 녹여 눈금에 맞춰 부피를 맞춘 후 흔들어 준다. 잘. 각 시료 5mL를 10mL 메스플라스크에 정확하게 취하고 50% 메탄올을 첨가하여 부피를 채우고 잘 흔들어 0.45μm 미세다공성 필터막을 통과시켜 얻습니다.

2.3.3.4 샘플 함량 결정

Cistanche Deserticola 총배당체 샘플을 정확하게 추출하고 "2.3.3.2"의 조건에 따라 측정합니다. 샘플 내 에키나코사이드, 베르바스코사이드 및 이종 공모자의 함량을 계산합니다.

2.4 동물 그룹화, 모델링 및 약물 투여

동물실은 빛이 12시간, 암기가 12시간, 상대습도는 50~70%, 실내온도는 18~22도를 유지한다. db/db 검정쥐와 db/m 검정쥐(정상대조군)에는 일반사료를 정상적으로 급여하였고, 9주령에 실험을 시작하였다. 정상대조군을 제외하고 나머지 db/db 흑마우스를 혈당치 및 체중에 따라 무작위로 선정하였다. 모델군, 양성대조군, Cistanche Deserticola 총다당류군, Cistanche Deserticola 총올리고당군, Cistanche Deserticola 총글루코시드군, Tartschistanche Deserticola 총다당류군, Tarthouse Deserticola 총올리고당군, Tartschistanche Deserticola 총글루코시드군 등 8개 그룹으로 나누어집니다. 일반 통제를 제외하고

모델군과 모델군을 제외한 다른 군의 쥐에게는 2mL/100g의 용량을 연속 4주 동안 위내 투여하였다. 액체의 농도는 4.1g·kg-1이었습니다. 일반대조군과 모델군도 동일하게 처리하였다. 위장에 일정량의 생리식염수를 줍니다.

2.5 Cistanche Deserticola의 다양한 추출 부위가 db/db 검은 쥐의 혈당 수치에 미치는 영향

2.5.1 경구당내성(OGTT) 테스트

투여 26일 후 12시간 동안 금식하였고, 다음날 투여 후 6{4}}분 동안 각 군의 흑색쥐에게 2.0 g·kg-1 포도당을 투여하였다. 각각 0, {{1{12}}}}.5, 1.0 및 2입니다. .0 h 꼬리 정맥혈을 채취하여 혈당치를 측정했습니다. 세로축에 혈당값, 가로축에 시간을 두고 혈당 변화표를 작성하고, 다음 식에 따라 각 실험군의 혈당곡선하 면적을 계산하였다(AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{2{22}}}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. 공식에서 A, B, C, D는 각각 0, 0.5, 1.0, 2.0시간의 혈당 값입니다.

2.5.2 인슐린저항성지수 및 동맥경화지수 계산

인슐린 저항성 지수는 문헌방법[20]에 따라 계산하였다: HOMA-IR=Glucose × Insulin / 22. 5. HOMA - =20 × Insulin / (Glucose - 3.5) × 100%. IR은 인슐린 저항성, (%)는 -세포 기능입니다. 포도당의 몰 단위는 mmoL·L-1입니다.

. 인슐린은 mU·L-1 단위로 제공됩니다. 단식 중에 포도당과 인슐린 수치를 측정합니다. 동맥경화 지수(Atherogenic index)는 Zheng et al.에 의해 기술된 방법에 따라 계산되었다. [21]. 계산 방법: Atherogenic i index=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 다양한 추출 부위가 db/db 검정 쥐의 혈청 INS 및 HbA1c에 미치는 영향

냉동 혈청 샘플을 채취하여 INS 및 HbA1c 효소 결합 면역분석 키트로 테스트하는 데 사용하기 전에 실온으로 가져옵니다. 키트 지침의 방법과 단계를 엄격히 따르십시오.

2.6 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 다양한 추출 부위가 db/db 검정 쥐의 간 산화 스트레스 수준에 미치는 영향

MDA 및 SOD 효소 결합 면역분석 키트로 테스트하기 위해 냉동 혈청 샘플을 채취하여 실온에 보관하십시오. 키트 지침의 방법과 단계를 엄격히 따르십시오.

2.7 Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola의 다양한 추출 부위가 db/db 검정 쥐의 간 지방 대사에 미치는 영향

쥐 혈청 TG, TC, HDL-C 및 LDL-C 수준은 관련 키트를 사용하여 측정되었습니다. 구체적인 측정 단계는 키트 지침을 참조하세요.

2.8 Cistanche Deserticola/Ratiana 장뇌의 다양한 추출 부분이 db/db 검정 쥐의 혈장 및 소변 내 UA, Cr 및 mALB에 미치는 영향

UA, Cr 및 mALB 효소 결합 면역분석 키트 테스트에 사용하기 전에 냉동 혈장 및 소변 샘플을 채취하여 실온에 보관하십시오. 키트 지침의 방법과 단계를 엄격히 따르십시오.

2.9 HE 염색을 통한 췌장 및 신장의 병리학적 절편 관찰

10% 파라포름알데히드 고정액에 24시간 동안 담가두었던 췌장과 신장 조직을 꺼내어 증류수로 세척한 후 70% 에탄올에 보관하였다. 조직 샘플을 제거하고, 등급별 에탄올로 탈수시키고, 투명화하고, 파라핀에 포매하고, 절개한 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다(H&E 염색). 섹션 접착제가 건조된 후 고해상도 디지털 이미징 시스템을 사용하여 섹션을 관찰하고 사진을 찍습니다.

2.10 면역조직화학에 의한 신장 조직 IV형 콜라겐 측정

발현을 위해 신장 절편을 물로 탈랍한 후 항원 검색을 실시했습니다. 이를 10% 염소 혈청으로 차단하고 1차 항체와 함께 밤새 4도에서 배양했습니다. 세척 후 2차 항체를 배양했습니다. 현재 솔루션은 컬러 개발을 위한 DAB였습니다. 광학현미경을 이용하여 세척, 탈수, 밀봉을 실시하였다. 신장 조직에서 IV형 콜라겐 단백질 발현을 관찰합니다.

2.11 통계적 방법

GraphPad Prism 버전 5.01(2007, GraphPad Software re inc) 소프트웨어를 사용하여 데이터 및 결과 분석

결과는 평균±SEM입니다. 두 그룹 간의 차이가 일원적임을 나타냅니다.

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ 한 쌍의 열 테스트) 방법, P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.