수면 부족 모델 쥐의 인지 및 시냅스 가소성 학습에 대한 시스탄체 글리오사이드의 효과
Aug 21, 2024
추상적인
목표:'시스탄체 배당체개선할 수 있다수면 부족의 학습 및 인지 기능모델 쥐시냅스 가소성 조절. 방법: 50마리의 수컷 Wistar 쥐를 무작위로 공백 대조군(Control), 플랫폼 대조군(PC), 모델군(Model),시스탄체 그룹의 배당체( GC) 및 estazolam 그룹 ( Est). 쥐의 수면박탈 모델은 변형된 다중 플랫폼 수환경 방법으로 제작되었다. 모리스 수중 미로(Morris water maze)와 개방형 현장 테스트(open field test)를 사용하여 쥐의공간인지 기능넷째, 감정적 변화. Nissl 염색을 사용하여 변화를 관찰했습니다.신경세포의 형태와 양쥐의 해마 CA1 영역에서. 웨스턴 블롯과 R'T - PCl을 사용하여 시냅토파이신(SYN), 시냅스후 막 밀도 물질 95( PSD - 95 ) 및 뇌 유래 신경영양 인자( BDNF)의 발현 수준을 검출했습니다. 결과: Morris 수중 미로 결과는 대조군과 비교하여학습 및 인지 능력모델 그룹의 쥐 수가 크게 감소했습니다(P<0. 05 ), and the쥐의 학습 및 기억 기능개선된 GC 처리(P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).
결론: 시스탄체 배당체시냅스 관련 마커의 발현을 조절하여 시냅스 가소성에 영향을 미쳐 수면 부족 모델 쥐의 학습 및 인지 기능을 향상시킬 수 있습니다.
핵심 단어시스탄체 배당체; 해마; 수면 부족; 학습과 기억; 불안; 시냅스 가소성
수면 장애(SD)는수면 기능 장애불면증, 잦은 꿈, 쉽게 깨는 등 일련의 복합적인 요인으로 인해 발생합니다. 최근 SD의 발병률이 점차 증가하고 있습니다. 관련 연구에서는 SD가 다음을 유발할 수 있다고 보고했습니다.심혈관 질환, 대사 장애, 면역질환, 알츠하이머병 등 중추신경계 퇴행성 질환 등이 있다[1]. SD는 해마 뉴런에 산화적 손상을 일으키고, 인지 기능 장애를 일으키고, 불안과 우울증과 같은 기분 변화를 일으킬 수 있습니다[2]. 시스탄체 데저티콜라는 약재와 식품으로 활용될 수 있는 귀한 한약재입니다. 신장을 튼튼하게 하고 기(氣)를 보충하며, 장을 촉촉하게 하고 배변을 촉진하며 양(陽)을 강화하는 효능이 있습니다. 시스탄체 배당체(GCs)인 시스탄체 데저티콜라의 주요 추출물은 항산화, 항세포사멸, 간 보호 및 신경 보호 효과를 가지고 있습니다[3]. 우리의 이전 연구에서는 GC가 항산화 및 항세포사멸 역할을 수행하여 SAMP8 마우스의 학습 및 인지 기능을 향상시킬 수 있음을 발견했습니다[4]. 관련 연구에 따르면 SD로 인한 인지 기능 장애는 시냅스 가소성과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다[5]. 그러나 GC가 시냅스 가소성을 조절하고 수면 부족으로 인한 쥐의 학습 및 기억 손상과 인지 저하를 개선하는 메커니즘에 대한 보고는 거의 없습니다. 따라서 본 연구에서는 시냅스 관련 마커의 발현을 조절하여 GC가 시냅스 가소성에 영향을 미치는지 알아보고, 이를 통해 수면 부족 모델에서 쥐의 학습 및 인지 기능을 향상시키고, 학습 및 장애 치료를 위한 새로운 치료 아이디어 및 계획을 제공하는 것을 목표로 합니다. GC로 인한 수면 장애로 인한인지 장애.
1 재료 및 방법
1. 1 실험동물
6~8주령의 수컷 Wistar 쥐, 체중 280~300g을 베이징 시베이푸(Beijing Sibeifu)에서 동물 생산 허가증[SCXK(Beijing) 2019-0010]으로 구입했습니다. 모든 동물은 온도(24±1)도, 습도 50%~55%, 12시간 명암 및 12시간 암흑 조건으로 바오터우 의과대학 동물실험센터에 보관되었으며, 음식과 물에 대한 제한은 없었습니다. 이 실험은 학교 윤리위원회 [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)]의 승인을 받았습니다.
1. 2 주요 시약 및 기기
Cistanche Deserticola의 총 배당체는 Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd.에서 구입했습니다(배치 번호: KSM20220609011). Estazolam 정제는 CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical(배치 번호: 044220343)에서 구입했습니다. 단백질 로딩 완충액(P1015), RIPA 용해 완충액(R0010), 화학 발광 용액(PE0010) 등은 모두 Beijing Solebao에서 구입했습니다. 시냅스후 밀도 물질 95(PSD-95) 항체(AB192757), 시냅토파이신(SYN) 항체(ab32127), 미국 Abcam에서 구매함; 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)(48503-2), -actin(52901), 미국 SAB에서 구매함; 염소 항-토끼 IgG 2차 항체(SA00001-20)(Proteintech, USA에서 구입); 래트 멜라토닌(MT), ELISA 키트(MM-0657R1), Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. 파라핀 슬라이서(독일 라이카)에서 구입; 광학현미경(독일 라이카); Morris 수중 미로, 개방형 현장 테스트 박스(Shanghai Xinruan); 수직 전기영동 기기
(베이징 류이 컴퍼니); 탈색 진탕기(Beijing Liuyi Company); 단백질 영상화 분석 시스템(Shanghai Tanon Technology); 형광 정량 PCR 장비(Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).
1. 3 실험방법
1. 3. 1 동물군 분류 및 약물투여
50마리의 수컷 Wistar 쥐를 무작위로 블랭크 대조군(Control group), 플랫폼 대조군(Plat-form control, PC group), 모델군(Model group), Cistanche Deserticola의 총배당체군(GCs group)으로 나누었다. , 50 mg/kg) 및 estazola 그룹(Est 그룹, 0.54 mg/kg), 각 그룹에 쥐 10마리. 대조군과 PC군에는 위관 영양법으로 0.9% 식염수를 투여했습니다. 모든 그룹은 모델링이 시작된 후 매일 오전 7시에 위관영양을 받았고, 위관영양은 21일 동안 지속되었습니다.
1. 3. 2. 수면부족 동물모델의 제작
수면박탈 모델은 수정된 다중 플랫폼 수환경 방법을 이용하여 구축되었다[6]. 실험장비는 130 cm × 50 cm × 45 cm 직사각형 폴리에틸렌 수지 수조였다. 직경 5cm, 높이 20cm의 작은 플랫폼을 물탱크에 배치했습니다. PC 그룹의 플랫폼은 직경 10cm, 높이 20cm였습니다. 물탱크에는 약 18cm 깊이까지 물을 채우고, 수온은 (20±1)도로 유지하였다. 실험 시작 일주일 전, 쥐를 매일 60분 동안 수면박탈 상자에 넣어 환경에 익숙해지도록 하였다. 모델이 확립된 후, 대조군을 제외한 각 그룹의 쥐를 매일 오전 8시부터 오후 8시까지 정해진 시간에 맞춰 소형 플랫폼에 배치하여 21일 연속 수면을 박탈하였다. 모든 쥐는 매일 12시간 동안 빛과 어둠이 교대로 플랫폼에서 자유롭게 먹고 마시고 자유롭게 움직일 수 있었습니다.
1.3.3 모리스 수중 미로 실험
모리스 수중미로는 4개 구역으로 나누어 물을 채우고 플랫폼은 4사분면에 배치하였다. 수면은 플랫폼 위 약 2cm에 있었습니다. 물에 식품등급의 식용 멜라닌을 첨가하였고, 수온은 (25±1)도로 유지하였다. (1) 포지셔닝 네비게이션 실험: 각 영역의 중심을 선택하고 쥐를 물 속에 부드럽게 배치했습니다. 그들은 자유롭게 탐색할 수 있었습니다. 쥐가 60초 이내에 목표 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간을 기록했습니다. 플랫폼을 찾지 못한 쥐는 플랫폼으로 안내되어 20초간 머물렀다. 훈련은 5일 동안 계속됐다. (2) 공간 탐색 테스트: 6일째 플랫폼을 제거하고 쥐를 물의 2사분면 중앙에서 벽에 기대어 놓았습니다. 쥐가 120초 이내에 플랫폼을 통과한 횟수와 4사분면에 머무른 시간을 기록했습니다.
1.3. 4 야외 실험
100 cm × 100 cm × 50 cm 크기의 실험 상자를 사용하였고, 상자의 바닥을 9개의 격자로 나누었다. 각 그룹의 쥐를 미리 야외 실험실에 배치하여 60분 동안 실내 환경에 적응시켰다. 실험 시작 시 실험용 쥐를 개방형 실험상자의 고정된 모서리에 차례로 배치하고, 행동분석 소프트웨어를 이용하여 쥐가 5분 이내에 서 있는 횟수, 이동 거리, 정적 시간을 기록하였다. . 실험 중에는 환경을 조용하게 유지해야 했으며, 이전 쥐의 냄새가 다음 쥐의 행동 판단에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해 두 번의 실험 사이에 실험 장치를 각각 깨끗한 물과 알코올로 닦았습니다.
1. 3. 5 효소면역측정법(ELISA)
래트의 혈청 MT 수준 검출 래트를 복강내 주사로 마취시키고, 복부 대동맥으로부터 5 mL의 혈액을 채취하였다. 실온에서 30분 동안 기다린 후 혈액을 원심분리하여 혈청을 얻었다. 각 웰에 시료희석액 40μL를 첨가한 후, 테스트할 시료를 10μL씩 첨가하였다. 밀봉 필름으로 밀봉한 후 37도에서 30분 동안 배양합니다. 5회 세척 후 효소표지용액 50μL를 첨가하고 밀봉필름으로 밀봉한 후 37도에서 30분간 배양합니다. 5회 세척한 후 발색액과 반응정지액을 차례로 첨가한다. 각 웰의 OD 값은 450 nm의 파장에서 효소 라벨링 기기로 측정되었습니다.
１. ３. ６ Nissl 염색
각 그룹에서 3마리의 쥐를 채취하고, 목을 베어 뇌 조직을 제거하였다. 뇌 조직을 4% 폴리메틸메타크릴레이트 용액으로 고정한 후 조직을 탈수시킨 후 왁스 용액에 담가 포매한 후 통상적인 방법으로 조직을 절단하였다. 슬라이스를 5 μm의 두께로 유지하고 PBS로 헹구고 0로 염색했습니다. 0에 대한 1% 톨루이딘 블루. 5시간, 95% 알코올로 분화, 100% 알코올로 탈수, 자일렌으로 투명화, 중성 검으로 밀봉. 쥐의 해마 CA1 부위의 뉴런의 형태와 수의 변화를 현미경으로 관찰하고 영상을 수집하였다.
１. ３. 7 웨스턴 블롯 실험
각 그룹에서 4마리의 쥐를 선택하였고, 해마를 참수하여 분리하였다. 해마 조직을 얼음조 환경에서 RIP A 용해 완충액과 혼합하고 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질 농도는 BCA 방법으로 검출되었습니다. 전기영동을 위해 단백질 로딩 완충액과 함께 20ug의 단백질을 첨가했습니다. 단백질 전기영동이 완료된 후, 막을 300 mA 일정한 흐름으로 옮기고, 5% 탈지분유로 차단한 후, 1차 항체를 4도에서 밤새 배양하고, 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 발색액을 사용한 후 화학발광 영상분석 시스템을 이용하여 단백질 밴드의 통계분석을 실시하였다.
1. 3. 8 RT-PCR 실험
해마 조직 균질액을 제조하기 위해 각 그룹에서 3마리의 쥐를 선택했습니다. 조직액 내 총 RNA를 Trizol 방법으로 추출하여 농도를 측정하였다. 역전사를 위해 공복 cDNA 합성 키트를 사용하였고, 형광 정량 키트를 이용하여 시냅스 관련 단백질 mRNA의 상대적인 발현 수준을 검출하기 위해 형광 정량 증폭 반응을 사용하였다. 결과는 2-ΔΔCt를 이용하여 분석하였으며, 프라이머 서열은 표 1과 같다.
1.4 통계적 방법
정규분포를 따르는 데이터 결과는 평균±표준편차(x±s)로 표현하였으며, 통계분석은 GraphPad Prism 9.5 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 여러 표본 간의 비교를 위해 단일 요인 분산 분석을 사용했으며 P < 0.05는 차이가 통계적으로 유의하다는 것을 나타냅니다.
