쥐의 조골세포에 의한 in Vitro N Vitro Ccytokine 발현에 대한 Cistanche의 초본 식물 준비가 Cistanche의 초본 식물 준비의 영향에 미치는 영향

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

요약

조골세포(OB)는 골 재형성에 중요한 역할을 합니다. 조골세포(OB)는 gh와 같은 사이토카인의 방출을 통해 골 재형성에 중요한 역할을 합니다. B 리간드(RA PG), 핵 인자 카파-B 리간드 NKL) 및 오스테오폰틴(OPN)의 수용체 활성화제. 우리 연구의 목적은 한약재 추출물의 효과를 평가하는 것이었습니다.시스탄체(Cistanche Deserticola) 쥐 OB 세포 배양에서 이들 사이토카인의 시험관내 발현에 관한. 1차 OB는 트립신 및 콜라게나제 소화에 의해 쥐의 두개골에서 분리되었습니다. 세포 표현형은 스위스 염색법, 알칼리성 포스파타제 염색, Von Kossa 염색 및 Alizarin red 염색으로 결정하였다. OPG, RANKL 및 OPN의 유전자 발현은 정량적 실시간 PCR로 분석하였다. Cistanche의 초본 식물 추출물로 처리한 모든 처리는 배양 72시간, 특히 5×10-2 mg/mL 농도에서 OPG 및 RANKL의 유전자 발현을 증가시켰는데, 이는 대조군 배양과 비교하여 유의하게 달랐다. 처리는 배양 48시간에서 OPG/RANKL 비율의 발현 및 배양 72시간에서 OPN mRNA의 발현을 유의하게 감소시켰다. Cistanche 식물 제제에 대한 OB의 시험관 내 노출은 OPG 및 RANKL의 유전자 발현을 촉진하고 OPG/RANKL 및 OPN의 유전자 발현을 감소시켜 골 대사 동안 골 형성 및 흡수의 균형을 유지할 수 있었다.

키워드:Cistanche, 조골세포, osteoprotegerin, RANKL, osteopontin, rat

항 조골 세포:시탕슈 허브

소개

뼈의 강도는 구조와 구성에 의해 결정됩니다. 뼈 조직은 성장 단계 동안 모델링하고 평생 동안 리모델링하여 다양한 부하를 수용하도록 적응합니다. 골 재형성은 기본 다세포 단위에서 형성되는 골의 부피 감소, 성호르몬 결핍 및 골막 골 형성 감소로 인해 노화와 함께 감소합니다(SEEMAN, 2008). 뼈 재형성의 불균형은 골다공증과 같은 뼈 관련 질병과 골절 위험을 증가시킬 수 있습니다.

골절, 통증 및 운동 장애를 일으키는 골다공증은 미국에서 수백만 명의 개인에게 영향을 미칩니다(NAYAK et al., 2012; SILVERMAN, 2010). 뼈 관련 질병의 발병을 예방하는 핵심 과정은 뼈 재형성 능력을 유지하는 것입니다.

뼈 리모델링은 뼈 형성과 흡수의 역동적 균형입니다(SEEMAN and DELMAS, 2006). 이러한 과정은 주로 성인 뼈의 조골세포(OB)와 파골세포, 그리고 사이토카인, 성장 인자 및 호르몬의 발현에 의해 조절됩니다(PARFITT, 2000). 원시 중간엽 세포에서 파생된 OB는 뼈 표면에서 발견됩니다. OB는 뼈 형성을 담당하고 간접적으로 뼈 흡수에 영향을 미칩니다(MACKIE, 2003). 오스테오프로테게린(OPG), 핵인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제(RANKL), 오스테오폰틴(OPN)과 같은 OB에 의해 발현되는 사이토카인은 골절 치유를 촉진하고 골다공증에서 골 형성을 증가시킬 수 있습니다(LINKHART et al., 1996). . OB 발달은 골전구세포 증식, 기질 성숙 및 세포 광물화를 포함하는 순차적 과정입니다(GIUSTINA et al., 2008). 이 과정은 여러 OB 관련 유전자에 의해 조절되며 뼈 형성의 발달과 밀접한 관련이 있습니다(HUNG et al., 2010). osteogenic mineralization의 진행은 골절 치유 동안 뼈 형성을 자극합니다. 따라서 뼈 관련 질병의 예방을 위한 혁신적이고 효과적인 천연 유래 치료제를 찾기 위해서는 골형성 사이토카인의 발현과 뼈 광물화에 미치는 영향에 대한 연구가 필수적입니다.

전통 중국 의학은 뼈 관련 질병의 치료에 수천 년 동안 사용되어 왔습니다. 신장 기능을 강화하고 뼈 질환 치료에 널리 사용되는 초본 식물 Cistanche는 Orobanchaceae과에 속합니다. Cistanche 종의 구성성분은 페닐에타노이드 배당체(PhG), 이리도이드, 리그난, 알디톨 및 올리고당인 것으로 보고되었습니다(JIANG 및 TU, 2009; LI et al., 2010). Cistanche 식물은 다년생 기생충 허브로 주로 사막이나 불모의 소금물에서 자라며 주로 중국 북서부의 건조하고 따뜻한 사막에 분포합니다. 중국 전통 의학에서 Cistanche는 특별한 강장제로 간주되며 "사막의 인삼"으로 불립니다. 난소 절제된 쥐에서 수행된 연구(LIANG et al., 2011)에 따르면시탕슈 추출물경구 투여 시 용량 의존적으로 골밀도와 골밀도가 크게 향상되었습니다. 그러나 뼈 형성에 대한 Cistanche의 작용에 대한 자세한 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 따라서 이 연구의 목적은 쥐 OB 세포 배양에 의한 OPG, RANKL 및 OPN 사이토카인 유전자의 시험관 내 발현에 대한 Cistanche의 효과를 평가하고 Cistanche가 뼈 치유를 촉진하거나 예방/조절하는 메커니즘을 평가하는 것이었습니다. 뼈 관련 질병.

뼈 관련 질병 예방을 위한 시스탄체 허브

재료 및 방법

쥐 조골세포의 준비. 쥐 OBs는 신생아 쥐 calvarias에서 준비되었습니다 (<24 hours)="" and="" processed="" by="" the="" trypsin="" (sigma,="" usa)="" and="" collagenase="" ii（sigma,="" usa）digestion="" methods.="" the="" cells="" were="" cultured="" in="" dulbecco's="" modified="" eagle="" medium="" (dmem,="" gibco,="" usa)="" supplemented="" with="" 15="" %="" inactivated="" fetal="" calf="" serum,="" penicillin="" (100="" iu/ml),="" streptomycin="" (100="" iu/ml)="" and="" l-glutamine="" in="" 6="" well="" culture="" plates,="" and="" incubated="" at="" 37="" °="" c="" with="" 5="" %="" co2="" in="" the="" air.="" the="" cellular="" phenotype="" was="" determined="" by="" the="" swiss="" dyeing="" method,="" alkaline="" phosphatase="" staining,="" and="" von="" kossa="" and="" alizarin="" red="" dye="">

연속 희석에서 Cistanche의 물 추출물의 제조. 이 연구에 사용된 Cistanche는 중국 Tongrentang 약국에서 제공되었습니다. Cistanche의 마른 조각을 가루로 만들었습니다. Cistanche 액체 추출물은 50g의 허브 분말을 1시간 동안 달여 준비했습니다. 다음으로, 회전 증발기를 사용하여 제제를 100mL로 농축하고 0.22mm 필터를 통해 여과했습니다. 여액을 암실에서 4도에서 보관하였다. Cistanche의 액체 추출물은 DMEM 유체를 사용하여 5x10 -1 ~ 5x10-4 mg/mL 범위의 연속 농도로 희석되었습니다.

RNA 분리 및 역전사 PCR 3세대 배양된 OB는 24시간, 48시간 및 72시간 동안 다양한 농도의 Cistanche 추출물로 처리되었습니다. OB 세포 배양 처리를 3회 수행하였다. PBS(Phosphate buffered saline)로 세포를 2회 세척하고 제조사의 지시에 따라 TransZol 시약(Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, China)으로 세포로부터 RNA를 분리하고 클로로포름으로 추출하고 이소프로필로 침전시켰다. 알코올을 75% 에틸알코올로 세척한 다음 물에 녹입니다. RNA(5μL)의 역전사를 TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix(Trans, Beijing, China)를 사용하여 수행했습니다.

Real-Time PCR 산물 확인. 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, PCR 산물이 쥐 OB에서 OPG, RANKL 및 OPN의 인코딩 유전자 세그먼트임을 증명하기 위해 DNA 시퀀싱을 수행했습니다.

표적 유전자를 포함하는 플라스미드의 확립. 2% 아가로스 겔의 DNA 서열을 EZNA 겔 추출(Kangweishiji, 중국)에 의해 정제 및 회수하고 pEASY-T3 클로닝 키트(Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, China)로 옮겼다. 세포 형질전환은 표적 유전자를 포함하는 구축된 플라스미드를 통해 달성되었다. 양성 콜로니는 청백색 반점 스크리닝 테스트에 의해 스크리닝된 후 시퀀싱되었습니다. 표적 유전자를 포함하는 양성 콜로니에서 추출한 플라스미드를 탈이온수로 비례적으로 희석하여 표준 곡선을 얻었다. 정량적 실시간 PCR(RTQ PCR). 공개된 유전자 서열(NCBI, Nucleotide Database)에 따라 특정 프라이머를 구성하고 표 1과 같이 Liuhe-Nuada Gene(Beijing, China)에서 합성했습니다.

샘플에서 mRNA의 발현은 위에서 설명한 특정 플라스미드 표준 곡선을 사용하여 정량화되었습니다. 제품을 하우스키핑 유전자 -액틴과 비교하였다. 표적 유전자의 양은 제조사의 프로토콜에 따라 SYBR Green RealMaster Mix(TIANGEN, China)를 사용하여 RTQ PCR로 정량하였다. PCR 조건은 94도 1분, 58도 30초, 68도 1분으로 40회 반복하였다. 데이터는 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems; Waltham, MA, USA)을 사용하여 계산되었습니다.

통계 분석. 데이터는 상용 통계 소프트웨어(SPSS 17.{2}}, IBM Corporation; Armonk, NY, USA)를 사용하여 일원 분산 분석에 의해 처리되었습니다. 결과는 표적 유전자의 평균 ± 표준편차와 -액틴 비율로 표현하였다. 차이는 P에서 유의한 것으로 간주되었습니다.<0.05>

시스탄치 허브의 효능: 뼈 질환 예방

결과

쥐 OB의 식별. OB는 특정 세포 염색 방법으로 식별되었으며 그림 1과 같이 표현형으로 입증되었습니다. (A, B, C 및 D)

표적 유전자의 확인. 표적 유전자의 밴드 크기는 2% 아가로스 겔에서 분석되었으며 예상 크기와 일치하는 것으로 나타났습니다(그림 2).

표적 유전자 플라스미드 서열을 포함하는 OPG, RANKL, OPN 및 -액틴 유전자 절편에 대해 얻은 결과는 이전에 GENBANK에 BLAST-N 분석에 의해 공개된 해당 유전자 서열과 비교되었으며, 다음과 같은 것으로 밝혀졌습니다: 100%, 100% , 각각 100% 및 99% 동일합니다.

Cistanche의 액체 추출물이 OPG, RANKL 및 OPN 발현에 미치는 영향. OPG mRNA의 수준은 OB가 24시간 및 48시간 동안 적용된 모든 농도의 Cistanche에 노출되었을 때 하향 조절되었습니다(표 2).

24시간 후 5×10-1, 5×10-2 및 5×10-4 mg/mL 농도와 5×10-1 및 5 농도에서 유의한 차이가 관찰되었습니다. ×{10}} 48시간 배양 후 mg/mL(P<0.05). however,="" when="" compared="" with="" control="" cultures,="" the="" expression="" of="" opg="" was="" significantly="" increased="" after="" treatment="" with="" cistanche="" for="" 72="" hours,="" cistanche="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml="" and="" 5×10-3="" mg/ml="" had="" particularly="" increased="" opg="" expression=""><0.01). in="" contrast,="" the="" rankl="" mrna="" expression="" was="" down-regulated="" after="" 24="" hours="" with="" the="" concentration="" of="" 5×10-1="" mg/ml="" and="" 5×10-2="" mg/ml="" cistanche="" extracts="" compared="" to="" the="" controls.="" however,="" rankl="" mrna="" was="" up-regulated="" after="" culturing="" with="" cistanche="" extracts="" for="" 48="" hours="" and="" 72="" hours,="" especially="" the="" cistanche="" extract="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml,="" 5×10-3="" mg/mland="" 5×10-4="" mg/ml="" (table="" 3).="" the="" rankl="" content="" continued="" to="" increase="" signifi="" cantly="" after="" 72="" hours="" of="">

논의

조골세포(OBs)는 파골세포 활성을 조절함으로써 뼈 구조를 생성하는 데 필수적인 역할을 할 뿐만 아니라 칼슘 항상성에도 중요한 역할을 합니다(MACKIE, 2003). 골다공증과 같은 OB 기능 또는 기능 장애와 관련된 특정 뼈 질환이 있습니다. OB 출현의 표현형 마커는 일차적으로 이들의 증식 및 분화이며, 이차적으로 골 결절의 광물화입니다(PAN et al., 2005). OPG 및 RANKL은 사이토카인의 종양 괴사 인자(TNF) 계열의 구성원이며 골량의 조절 및 유지에 중요한 OB 유래 단백질입니다(HUMPHREY et al., 2006; REINHOLZ et al., 2002). RANKL은 파골세포 분화, 활성화 및 생존을 조절합니다. RANKL은 또한 파골세포막의 수용체와 상호작용하여 골 흡수를 증가시킬 수 있습니다(SODEK et al., 2000). OPG는 RANKL에 대한 미끼 수용체이며 RANKL이 수용체(RANK)에 결합하는 것을 방지합니다. RANK/RANKL/OPG 관계는 OB와 파골세포 활성을 조절하여 뼈 형성과 흡수 사이의 균형을 제어합니다(SODEK et al., 2000; HUMPHREY et al., 2006; MAZZIOTI et al., 2012). 따라서, 감소된 OPG/RANKL 비율은 파골세포 활성화를 증가시켜 골흡수를 유도할 수 있다고 결론지을 수 있다.

이 연구에서, Cistanche의 초본 제제를 사용한 모든 처리는 72시간, 특히 5×{2}} mg/mL 및 5×10-3 mg/mL 농도에서 OPG 및 RANKL의 발현을 증가시켰습니다. 통제 문화에 비해 확연히 다르다.

대조적으로, OPG 발현은 Cistanche 추출물과 함께 배양 24시간 및 48시간 후에 유의하게 하향 조절되었다. OPG/RANKL 비율의 발현은 산부인과를 Cistanche로 24시간 및 48시간 처리했을 때 유의하게 하향 조절되었다. 또한 Cistanche 추출물은 처리 72시간 후 산부인과 배양에 유의한 영향을 미치지 않았습니다. 우리는 Cistanche의 액체 추출물이 조절된 OPG/RANKL 발현을 통해 24시간 및 48시간 후에 파골 세포 활성화를 개선할 수 있지만 72시간 후에는 파골 세포 활성화에 영향을 미치지 않을 수 있다고 가정합니다. OPN은 숙주 방어 및 조직 복구에서 OPN의 기본적인 역할과 관련하여 뼈 형성 및 리모델링에서 몇 가지 기능적 다양성을 가지고 있습니다. OPN의 주요 역할은 전신적 수준에서 음의 되먹임 조절, 산부인과 세포 부착 촉진, 조기 석회화 현상의 유도, 광물 결정의 크기와 모양의 조절인 것으로 보입니다(SODEK et al., 2000). 또한, OPN이 브리지 단백질을 나타낼 수 있고, 염증 시 동맥 경화를 증가시킬 수 있으며, 결과적으로 류마티스 관절염 환자에서 관절 손상을 유발하고 심혈관 위험을 증가시킬 수 있다는 것이 확인되었습니다(BAZZICHI et al., 2009).

우리 연구에서 우리는 Cistanche의 액체 추출물이 OPN의 발현을 하향 조절한다는 것을 보여주었습니다. 24시간 및 48시간 배양에서 관찰된 대조군 배양과 비교하여 OB 배양에서 OPN 농도가 감소하는 경향과 72시간에서 기록된 현저히 낮은 수준은 Cistanche가 시험관 내 실험에서 입증된 바와 같이 골 형성을 개선할 수 있음을 시사합니다.

Cistanche에 대한 OB 배양물의 체외 노출은 72시간 후에 OPG 및 RANKL의 유전자 발현을 유의하게 촉진시켰고, 24시간 및 48시간 후에 OPG/RANKL의 유전자 발현을 감소시켰고, 배양 72시간 후에 OPN의 발현을 감소시켰다.

그만큼시탕슈 허브는 항상 여러 한약재로 구성된 처방으로 사용되기 때문에 본 연구에 사용된 시탕슈와 액상 추출물의 성분이 복잡하고 아직 명확하지 않습니다. 본 연구 결과는 Cistanche 추출물이 rat OB에 세포 배양 시 OPG 및 RANKL 발현에 영향을 미치지만, Cistanche 추출물의 농도와 배양 기간에 따라 발현 수준이 달라진다는 것을 보여주었다. 쥐의 OB에 대한 적절한 노출 기간과 함께 Cistanche Deserticola의 액체 추출물의 적절한 농도는 뼈 대사 동안 뼈 형성과 흡수의 균형을 유지할 수 있습니다.

Cistanche의 생리 활성 성분과 제제 내 농도에 대한 지식을 개선하고 뼈 복원 및 복구를 위한 사이토카인 조절제로 검증하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

cistanche 보충제: 뼈 손실 방지

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