격리된 관류 마우스 신장에서 족세포 손실에 대한 관류 압력의 영향
Mar 13, 2022
추상적인
배경/목적: 족세포는 대부분의 사구체 질환에서 소실되어 사구체 경화증 및 진행성신장병. 일반적으로 족세포는 여과 흐름에 노출되어 사구체 기저막(GBM)에서 분리되는 상당한 전단력에 노출된다고 가정합니다. 이러한 맥락에서 발 돌기 소실은 GBM에 대한 족세포의 부착을 증가시키기 위한 잠재적인 적응 반응으로 제안되었습니다. 방법: 우리는 분리된 관류 쥐에서 광학 클리어링 및 고해상도 3-차원 형태 측정법을 사용하여 이러한 가설을 테스트했습니다.신장.우리는 건강한 젊음 또는 노령 마우스(20주령 대 71주령) 또는 전체 발을 유도하기 위해 항-GBM 혈청을 주사한 마우스에서 다양한 관류 압력(50, 300 및 450mmHg 이상)에서 족세포 분리의 역학을 조사했습니다. 공정 소실. 결과: 결과는 어린 생쥐의 건강한 족세포가 GBM에 단단히 부착되어 있고 극상 압력에서도 유의한 박리를 일으키지 않음을 보여줍니다. 젊은 마우스와 비교하여, 노화된 마우스 및 항-GBM 신염 및 족돌기 소실이 있는 마우스에서, 관류 이전에 족세포의 점진적인 점진적 손실이 이미 발생했습니다. 높은 관류 압력은 나이든 마우스에서 족세포의 상대적으로 경미한 추가 손실을 초래했습니다. 항-GBM 신염이 있는 마우스에서 관류 압력을 300mmHg 이상으로 증가시키면 이 초기 시점에 상당한 추가 족세포 손실이 발생했습니다. 결론: 이 연구는 발세포가 생체 외에서 분리된 급성 관류 압력에 비정상적으로 내성이 있다는 최초의 실험적 증거를 제공합니다.신장관류 모델. 사구체 질환에서만 상당한 수의 손상된 족세포가 관류 압력의 급격한 증가에 따라 분리되었습니다.
키워드:사구체 고혈압; 사구체 과여과; 기계적 응력; 진행; 만성 신장 질환
소개
사구체 고혈압과 과여과(hyperfiltration)는 사구체를 손상시켜 진행성 사구체 질환을 유발합니다. 관류 압력이 증가하면 터프트가 사구체 기저막(GBM)에 대한 족세포의 접착에 도전하는 증가된 기계적 스트레스에 노출되어 분리에 기여한다고 널리 알려져 있습니다[1, 2]. 족세포는 온전한 사구체 여과 장벽에 필수적인 고도로 분화된 유사분열 후 세포입니다. 족세포 손실은 환자의 소변에서 회수된 족세포를 배양하는 것이 가능하기 때문에 세포자멸사 또는 괴사[3-6]보다는 GBM에서 생존 세포가 분리된 결과일 가능성이 높습니다[4]. GBM에서 생존 가능한 족세포의 분리는 손상된 부착 메커니즘 또는 기계적인 힘으로 인해 발생할 수 있습니다. GBM에 대한 손상된 부착은 세포 손상 또는 부착 분자의 감소된 발현으로 인한 것일 수 있으며 주로 염증성 사구체 질환과 관련이 있습니다. 족세포와 관련된 기계적 힘과 관련하여 두 가지 주요 결정 요인이 있습니다. 즉, 여과 압력과 여과액 흐름[7-9]입니다. 여과 압력은 원주 벽 응력을 생성하고 GBM에 팽창력으로 작용합니다. Transmural 정수압의 변화는 GBM이 탄성 막으로 작용하고 표면적에서 팽창하거나 수축하는 능력에 의해 효과적으로 보상됩니다[8, 10]. 다른 한편으로, GBM을 가로지르는 여액 흐름은 족세포의 표면에 접선력, 즉 전단 응력을 가합니다. 우리는 체외 연구에서 족세포가 0.025 Pa 이상의 전단 응력에 노출될 때 기질에서 분리되는 전단 응력에 매우 민감하고 [11] 흐름 유도 힘에 대항하는 데 도움이 될 수 있는 중간 표현형을 채택한다는 것을 알고 있습니다[12]. 사구체 고혈압이 여과 압력 증가 및/또는 여과 증가를 통해 족세포에 영향을 미치는지 여부는 여전히 불분명합니다. 이 연구에서 우리는 생체 외 모델에서 증가된 기계적 힘에 저항하는 족세포의 능력에 대한 첫 번째 분석을 제공합니다. 족세포 손실은 젊고 건강한 마우스에서 조직 제거 및 3-차원적 형태 분석을 사용하여 고해상도로 정량화되었습니다.
재료 및 방법
모든 동물 실험은 동물 복지를 위한 독일 법률 지침에 따라 수행되었으며 Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen(Az 84-02.04. 2015.A469)의 승인을 받았습니다. 마우스는 음식과 물에 무료로 접근할 수 있고 12-시간의 낮/밤 주기가 있는 병원체가 없는 특정 시설에 수용되었습니다. 표준 절차에 따라 번식 및 유전자형 분석을 수행했습니다. FVB/N 유전적 배경에 대한 Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP 마우스는 이전에 설명되었습니다[13]. Pod-rtTA-eGFP의 이식유전자 발현을 활성화하기 위해, 마우스는 이전 보고서에 따라 7일(2g/l, 5% 자당, 빛으로부터 보호됨) 동안 식수를 무제한으로 독시사이클린을 받은 후 1주일의 휴약 기간을 받았습니다. 항-GBM 신염은 이전에 기술된 바와 같이 5 mg/g 체중 신독성 혈청의 단일 복강 주사에 의해 유도되었습니다[14].
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신장 관류
고립된신장관류 모델은 다른 곳에서 설명한 대로 사용되었습니다[15]. 간단히 말해서, 마우스에 자일라진/케타민(0, 1ml/10g 체중 ip)을 복강내 주사하여 마취시킨 다음, 실험 동안 생리학적 환경을 모방하기 위해 37도에서 퍼센트 소 혈청 알부민(BSA). 최대 혈관 확장신장1. 마취 유도 직후에 베라파밀(50μl)을 피하 주사하고 2. 관류 용액에 파파베린을 첨가하여 혈관 구조를 유도했습니다. 50 mmHg에서 5분 동안 초기 관류 후, 형광 표지된 렉틴(Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL{8}}; 986 ul의 식염수 중 4 ul)을 내피 세포를 표지하기 위해 주입했습니다.신장5% BSA가 포함된 수정된 Krebs-Henseleit 용액으로 추가 5분 동안 관류했습니다. 그 후, 왼쪽신장모든 실험에서 paired control 역할을 하는 왼쪽 부분을 조심스럽게 결찰한 후 제거했습니다.신장용기를 조각으로 자르고 인산완충식염수(PBS)의 3% 파라포름알데히드(PFA)에 직접 담그십시오. 권리신장 was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300mmHg, 여과 압력은 400mmHg를 훨씬 초과하는 것으로 추정됨), 수동으로 적용한 총 부피 50ml의 관류 용액. 그만큼신장압력 제어 펌프(Universal Perfusion Systems UP{3}}, Hugo-Sachs Electronics, Germany)를 사용하여 50mmHg 또는 300mmHg의 일정한 압력으로 관류했습니다. 그럼 오른쪽신장제거하고 2mm 조각으로 자르고 인산염 완충 식염수(PBS)의 3% 파라포름알데히드(PFA)에 담그십시오.
3D 이미징 및 전산 분석 PFA 침지신장슬라이스를 실온에서 5일 동안 기계적 진탕기에서 인큐베이션하였다. 그 후, 고정된 샘플을 1x PBS로 세척하고 실온에서 밤새 기계적 진탕기에 두었다.신장그런 다음 슬라이스를 실온에서 1시간 동안 고급 100% 에탄올(Merck; 100983)에 넣고 부드럽게 흔들어(신선한 에탄올로 최소 1회 변경), Ethyl Cinnamate(ECi)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) 빛 보호 하에 실온에서 부드러운 진탕기에서 밤새 방치하였다. 조직 투명도는 1시간 이내에 달성되었습니다. 직립 현미경의 경우 이전에 설명한 대로 일회용 자체 제작 챔버를 사용했습니다[16]. 대부분의 실험은 2-광자 현미경(LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facility)을 사용하여 수행되었습니다. 피지 이미징 소프트웨어는 직렬 광학 섹션의 각 스택의 Z축을 통해 이동하는 데 사용되었습니다. 3D 자르기를 통해 개별 사구체를 분리합니다[16].신장(20개의 피질하 및 20개의 척수 옆)이 분석을 위해 선택되었습니다. 따라서, 본 연구에서는 총 1200개의 사구체를 분석하여 충분한 정밀도로 결과를 얻었다. 족세포는 eGFP 플러스 세포로 확인되었습니다. 3D 렌더링 및 분석 소프트웨어(Imaris v9.1; Bitplane AG, Zurich, Switzerland)를 사용하여 모세관 용적, 사구체 용적 및 핵 수(도트) 및 용적의 정량화는 다음을 사용하여 계산되었습니다. Bitplane XTension "가장 가까운 지점. 거리". 족세포의 자동 정량화는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[17]. 이미지 분석은 Imaris(Biplane AG Zurich, Switzerland)를 사용하여 수행되었습니다. 각 사구체는 렉틴으로 표지된 구심성 세동맥에 의해 정의되었습니다. 20개의 피질하 및 20개의 juxtamedullary(피질 표면으로부터의 거리에 의해 정의됨).
CISTANCHE는 신장/신장 통증을 개선합니다
광학현미경 및 면역형광
광학현미경의 경우 4% 완충된 포르말린 고정신장조각을 탈수하고 파라핀에 묻힌 다음 과요오드산-쉬프(PAS)로 염색했습니다. 비정상적/손상된 사구체의 백분율은 전체를 가로질러 체계적으로 걷는 동안 선택된 마우스당 50개의 대표적인 사구체 단면의 식별을 기반으로 계산되었습니다.신장피질. 우리의 표준 면역형광 프로토콜[18]은 2μm 파라핀 내장 절편에서 수행되었습니다. 다음 항체가 사용되었습니다: 닭 다클론 항-GFP(ab13970; Abcam), 마우스 단클론 항-시냅토포딘(sc{6}}; Santa Cruz Biotechnology), 다클론 토끼 항-마우스 p57(sc{9}}, Santa -Cruz Biotechnology), 토끼 폴리클로날 항-WT1(sc{13}}; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 당나귀 항-닭(703-225-155; Dianova, Hamburg, Germany), Alexa Fluor546 염소 항-마우스 IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), 다클론 당나귀 항토끼 AF555(A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).
전자현미경
피질의 작은 조각을 Karnovsky-solution에 고정하고 Epon(Serva, Heidelberg, Germany)에 삽입했습니다. 초박형 섹션은 60kV에서 투과 전자 현미경 ZEISS Leo 906으로 3597-6000x 배율로 검사했습니다. 샘플을 0.1M Soerensen's phosphate(Merck, Darmstadt, Germany)로 세척하고, 17% 자당 완충액(Merck, Darmstadt, Germany)에서 1% OsO 4(Roth, Karlsruhe, Germany)로 후고정하고 오름차순 에탄올 시리즈( 각각 10분 동안 30, 50, 70, 90 및 100%). 마지막 단계를 3회 반복했습니다. 탈수된 표본을 프로필렌 옥사이드(Serva, Heidelberg, Germany)에서 30분 동안, Epon 수지(Serva, Heidelberg, Germany)와 프로필렌 옥사이드(1:1)의 혼합물에서 1시간 동안, 마지막으로 순수한 Epon에서 1시간 동안 배양했습니다. 에폰 중합을 90도에서 2시간 동안 수행하였다. 초박형 섹션(70-100 nm)을 울트라마이크로톰(Reichert Ultracut S, 다이아몬드 나이프(Leica)이 있는 라이카)으로 절단하고 Cu/Rh 그리드(HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Germany)에서 픽업했습니다. 0.5% 우라닐 아세테이트 및 1% 시트르산납으로 염색(둘 다 EMS, 뮌헨, 독일) Zeiss Leo 906(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 투과 전자 현미경을 사용하여 60kV의 가속 전압에서 샘플을 관찰했습니다.
통계 분석
GraphPad Prism v8 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 모든 값은 평균 ± SD로 표시됩니다. 두 그룹의 비교를 위해 t-검정을 사용했습니다. 분산 분석을 사용하여 여러 그룹을 비교했습니다. 사후 Tukey 수정은 다중 비교에 사용되었습니다. 모든 테스트는 2-꼬리되었고 통계적 유의성은 P < 0.05로="">
결과
사구체당 족세포 수를 결정하기 위한 반자동 방법 세 그룹, 즉 건강한 젊고 오래된 마우스와 항-GBM 사구체신염이 있는 마우스(♂:♀ 1:1)를 연구했습니다. 젊고 건강한 생쥐는 15-21주 된 반면 늙은(노인) 생쥐는 74주였습니다. 격리된 관류를 설정하기 3일 전에 항-GBM 혈청의 단일 주사를 통해 14-20주 생쥐에서 전체 발 돌기 소실이 유도되었습니다.신장모델(그림 1A), 앞서 설명한 대로 [19].
족세포에 대한 신장내 관류압의 영향을 결정하기 위해,신장격리된 공간에서 서로 다른 관류 압력을 받았습니다.신장관류 모델. 먼저 둘 다신장항상 50mmHg에서 5분간 관류시켰다. 우리의 관류 용액이 생존 가능한 고정되지 않은 사구체의 무결성을 보존하는지 여부를 테스트하기 위해신장, 2마리의 마우스를 90분 동안 100mmHg의 일정한 압력에서 관류시켰다. 관류, 소변 흐름(25 µl/min/gr 체중) 및 이눌린 제거율(22 µl/min)은 전체 시간 동안 안정적으로 유지되었습니다(보충 그림 1 – 모든 보충 자료 참조www.cellphysiolbiochem.com).실험 쥐에서 50mmHg에서 초기 관류 후 왼쪽신장 was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300mmHg; 약 450 – 500 mmHg의 초극대여과압)이 나머지 오른쪽에 적용되었습니다.신장5분 동안 (그림 1B). 고립된 관류 속에서신장, 족세포는 포도신 프로모터(eGFP:Pod-rtTA 마우스) 하에 eGFP를 발현하는 형질전환 마우스에서 eGFP-히스톤으로 핵 표지를 사용하여 식별되었습니다. 발세포 수는 이 생체 내 대사 표지와 3D 형태 측정법의 조합을 사용하여 정량화되었습니다(그림 1C).
건강하고 나이든 쥐의 족세포 손실
Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>기준선과 비교하여 각각 300mmHg는 더 높은 압력으로 족세포 손실이 약간 증가하는 것이 우연의 일치가 아님을 시사합니다. PAS 섹션에서 기준선에서 나이 든 마우스에서 가벼운 사구체 변화가 관찰되었습니다(간막 확장 및 간헐적 경화, 그림 2F). ㅏ
급성 손상 후 족세포 손실
항-GBM 혈청을 젊고 건강한 마우스에 적용하여 족세포에 대한 중요하고 특정한 손상을 유도했습니다. 항-GBM 사구체신염 유도 후 매우 초기 시점(즉, 3일)에 투과전자현미경에 의해 모든 사구체에서 일반화된 족돌기 소실이 관찰되었다(도 3A-D). 고립된 관류에서신장obtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300mmHg는 소수의 사구체에서 80% 이상의 족세포 손실을 야기했습니다(그림 3E). 이것은 항-GBM 질병 모델의 초점적 성격과 일치합니다. juxtamedullary glomeruli 내에서 podocyte loss는 subcortical glomeruli(각각 56.66 ± 16.9 및 47.35 ± 17.07)에 비해 더 두드러졌습니다(그림 3F).
By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300mmHg); 내피는 유의한 변화를 나타내지 않았다. PAS 염색으로 세뇨관 확장이 확인되었습니다. 항-GBM 혈청을 주사한 지 3일 후, 아직 초승달 병변이 발생하지 않았다(도 3G-I). 수컷은 암컷에 비해 더 높은 정도의 족세포 손실을 보였으며(사구체당 63.71 ± 2.11 대 75.81 ± 3.83 발세포), 이는 수컷 마우스가 항-GBM 항혈청에 더 민감하고 그 과정에서 더 많은 세포 초승달 모양을 형성한다는 관찰과 일치합니다. 질병(그림 3J). 그러나 높은 관류 압력 후 족세포의 추가 손실은 남성과 여성에서 유사했습니다(그림 3J).
그림 3. 급성 손상 후 발세포 손실. (AB) 대조군의 투과 전자 현미경신장 per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300mmHg). 다중 비교의 경우 ANOVA. ****피<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">
세뇨관에서 잃어버린 족세포 추적하기
eGFP와 족세포는 근위 세뇨관 세포의 브러시 경계에 부착되는 것으로 보이는 근위 세뇨관의 내강 내에서 정기적으로 관찰되었습니다(그림 4A). 이 족세포는 과관류로 씻어내지 않았습니다.신장s, 대신 매우 높은 관류 압력에서 일차 소변의 비정상적인 흐름을 견디기 위해 브러시 경계에 다소 단단히 부착되었습니다. 그들의 정체성을 확인하기 위해 족세포는 유전적 혈통 추적 마커 핵 eGFP 외에 족세포 특이적 마커(즉, p57, 시냅토포딘 및 WT{3}})로 공동 염색되었습니다(그림 4B). 족세포 수는 관련된 근위 세뇨관에 족세포가 부착되어 있는 사구체에서 유의하게 낮았고, 세뇨관에 족세포의 존재는 사구체당 족세포 수와 반비례하는 상관관계가 있었습니다(그림 4C).
주변 위치에서 족세포의 우선적 손실
Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg에서 젊고 건강한 마우스에서 족세포의 공간적 분포에 큰 변화가 관찰되지 않았습니다. 나이든 마우스에서, 혈관 극으로부터의 족세포 거리는 일반적으로 증가하여 대부분 사구체 비대를 반영하는 반면, 과관류는 혈관 극에 가까운 족세포의 우선적인 분리를 초래했습니다(나이 든 마우스에서 1사분위수가 11.5%에서 4.9%로 감소됨, 그림 4E ). 유사하게, 혈관 극에 가까운 족세포의 우선적인 분리가 소실된 족세포에서 관찰되었습니다(항-GBM, 1사분위수가 25%에서 5%로 감소됨).
논의
이 연구에서 우리는 족세포 수를 결정하기 위해 현재 가장 정확한 방법을 사용하여 격리된 관류 쥐 신장에서 족세포 손실에 대한 상승된 여과 압력 및 여과 흐름의 급성 효과를 조사했습니다. 우리 연구의 첫 번째 주요 발견은 건강한 족세포가 이전에 세포 배양 연구[11]에서 제안된 바와 같이 생체 내에서 급성 전단 응력에 민감하지 않다는 것입니다. 놀랍게도, 극도의 생리학적 압력(450mmHg 이상)도 상당한 족세포 박리를 유발하지 않았습니다. 오히려 투과 전자 현미경은 여과 장벽의 3개 층 모두가 비교적 잘 보존된 상태로 남아 있음을 보여주었습니다. 나이든 마우스는 감소된 족세포 수(이전에 보고된 바와 같이)를 나타내었고 이것은 높은 관류 압력에 대한 증가된 감수성 증가와 매우 제한적이었습니다. 두 번째 주요 발견은 이전의 족세포 손상으로 인해 높은 관류 압력에서 족세포가 분리되기 쉬웠다는 것입니다. 항-GBM 마우스는 항-GBM 항혈청 주사 후 3일에 전체적인 발 돌기 소실을 보였고 높은 관류 압력에서 상당한 수가 분리되었습니다. 나이 든 쥐에서 우리는 족세포 생리학이 비교적 잘 보존되어 분리에 덜 취약하게 만든다고 가정합니다. 반자동 계수 접근법을 적용하여 각 사구체를 개별적으로 분석했습니다(총 1200개의 사구체 분석). 우리는 juxtamedullary glomeruli가 subcortical glomeruli보다 부피가 더 크다는 것을 확인했습니다. 흥미롭게도, 족세포 수는 동일하여 족세포 밀도가 인접 사구체에서 감소됨을 보여줍니다. 또한, juxtamedullary glomeruli는 subcortical glomeruli에 비해 증가된 여과 압력에 더 취약했습니다. 이러한 발견은 FSGS 병변이 더 큰 사구체에서 더 높은 빈도로 관찰될 수 있는 이유를 부분적으로 설명할 수 있습니다[22, 23].
그림 4. 인접 근위부에서 족세포 검출. 세뇨관. (A) 세관에서 eGFP 플러스 족세포(녹색)를 보여주는 대표적인 이미지. (B) 이식유전자 히스톤 eGFP(녹색) 및 내인성 족세포 마커 p57(빨간색), wt-1(빨간색) 및 시냅토포딘(보라색)에 의해 공동 표지된 족세포의 면역형광 염색. (C) 사구체당 족세포 수와 세뇨관에서 확인된 족세포 수의 연관성(대조군 마우스의 n=81 사구체, 나이든 마우스의 n= 41 사구체 및 n= 81 항 GBM 마우스의 사구체). 다중 비교를 위해 ANOVA를 사용했습니다. ****피<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">
이 연구의 한계는 증가된 여과 압력에 대한 족세포의 장기적 적응에 관해 결론을 내릴 수 없기 때문에 관찰 기간이 짧다는 것입니다. 전단 응력에 노출된 족세포의 첫 번째 반응은 보호 구조적 변화를 겪는 것으로 제안되었습니다[8, 24]. 이러한 변화에는 여과 슬릿(즉, FPE)의 손실과 폐쇄 또는 밀착 접합에 의한 슬릿 다이어프램 교체가 포함됩니다. 폐쇄 접합부는 여러 사구체 질환 모델[25-28]에서 이전에 설명되었습니다. 그러나 우리 연구에서는 FPE가 있는 족세포가 더 높은 관류 압력에 더 취약하다는 것을 관찰했습니다.{5}} 따라서 우리의 결과는 이러한 적응적 변화가 분리로부터 보호하기에 충분하지 않거나 잠재적으로 그 반대의 경우에도 족세포를 분리에 더 취약하게 만드는 것으로 나타났습니다. 다음으로, 고립된 관류가 있다고 주장할 수 있다.신장는 생리학적 시스템이 아니며 적용된 압력이 생체 내 조건보다 훨씬 더 높았습니다. 우리가 아는 한 온전한 실행 가능한 모델을 사용하는 다른 모델은 없습니다.신장증가된 관류 압력의 영향을 직접 조사할 수 있는 존재. 관류 전과 관류 중에 혈관 확장제를 사용하여 제한되지 않은 흐름(과여과)을 허용하고 사구체로 증가된 관류 압력을 최대로 전달할 수 있도록 유도된 사구체 전 혈관의 최대 확장. 현재 연구에서는 더 높은 관류 압력의 급성 효과를 연구했습니다. 병리학적 과관류의 장기적인 영향은 더 해로울 수 있으며, 이는 훨씬 더 많은 족세포 손실을 초래할 수 있습니다. 그러나, 우리의 연구는 족세포의 이러한 만성 손실이 여과 흐름 자체의 순전한 힘에 의해 구동되는 것이 아니라 오히려 GBM에 대한 부착을 감소시키는 족세포의 (잘못된) 적응적 변화에 의해 유발된다는 것을 시사합니다. 사구체 질환이 있는 환자는 족세포의 (mal-)적응 구조적 변화를 예방함으로써 항고혈압 치료의 이점을 얻습니다.
결론
이 연구는 건강한 족세포가 건강한 마우스 신장에서 GBM에 비정상적으로 단단히 부착되어 있으며 매우 높은 관류 압력에도 견딜 수 있다는 생체 내 증거를 제공합니다. 노화 또는 전체적인 소실을 동반한 더욱 현저한 급성 족세포 손상은 증가된 관류 압력에서 족세포가 박리에 취약하게 만듭니다.
