신장 섬유증의 치료에 STAT6 억제제 AS1517499의 효과
Mar 24, 2022
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파트 I.: STAT6의 약리학적 억제는 신장 섬유증에서 골수성 섬유아세포 활성화 및 대체 대식세포 분극을 개선한다.
Baihai Jiao, Changlong An, Melanie Tran, Hao Du, Penghua Wang, Dong Zhou 및 Yanlin Wang
소개
만성 신장 질환 (CKD)은 중요한 공중 보건 도전이되었습니다 (1). 섬유증은 CKD의 발달을위한 궁극적 인 공통 경로이며 CKD의 모든 형태의 진행을위한 주요 요인으로 간주됩니다 (2).신장 섬유증CKD의 병리학 적 특징으로, 정상적인 신장 조직 구조를 세포 외 매트릭스 (ECM)로 대체하여 신장 기능에 대한 점진적이고 돌이킬 수없는 손상으로 이어집니다 (3). 그러나, 분자 메카니즘에 대한 이해가 증가했음에도 불구하고신장 섬유증, 섬유증을 조절하고 신장 기능을 회복시키는 특별한 치료법은 없습니다. 섬유아세포의 기원 및 기능적 기여가 완전히 이해되지 않았기 때문에, 장기 섬유증에서 섬유아세포를 효과적으로 표적화하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있다.
축적 된 증거는 섬유세포라고 불리는 골수성 근섬유아세포가 섬유증 과정에서 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다 (4-7). 우리와 다른 사람들은 이전에 골수 유래 섬유 아세포의 모집이 진행과 발달을 증가시킨다는 것을 보여주었습니다.신장의섬유 증(8-12). 따라서, 이들 세포를 표적화하는 것은 만성 신장 질환을 치료하기 위한 효과적인 치료 전략으로서 작용할 수 있다. 골수 유래 섬유아세포는 조혈 세포뿐만 아니라 중간엽 세포의 특성을 공유합니다 (13,14). 그러나, 국소 미세환경에서 생산된 다양한 사이토카인은 골수 유래 섬유아세포의 분화를 결정한다. 우리는 이전에 전섬유성 사이토카인으로 간주되는 Th2 사이토카인(I-4 및 IL-13)이 골수 유래 단핵구에서 I형 콜라겐, 피브로넥틴 및 α-SMA의 발현을 향상시킨다는 것을 입증하였다(15, 16).
통계6신호전달은 주로 IL-4 및 IL-13과 같은 Th2 사이토카인에 의해 활성화되며, 폐(17,18), 간(19)의 발병기전과 연관된다.신장의섬유 증(15, 20). 우리는 최근에 JAK3 /통계6골수 유래 섬유 아세포의 활성화와 발달에 중요한 역할을합니다.신장의섬유 증폐쇄성 신증에서(15). 또한, 우리는 IL-4Ro의 녹아웃이 억제된다는 것을 보여주었습니다.통계6활성화, 골수성 섬유아세포의 축적 및 근섬유아세포로의 형질전환, M2 대식세포 분극, 및 발달신장의섬유 증폐쇄성 손상 또는 엽산 투여 후(16). 이러한 발견은통계6신호전달 경로는 신규한 치료 표적으로서 작용할 수 있다.신장의섬유 증.
이 연구에서, 우리는 잠재적 인 치료 역할을 평가했다.AS1517499, 강력하고 선택적인통계6억제제 (21), 골수성 섬유 아세포 활성화 및 발달신장의섬유 증두 가지 실험적인 뮤린 모델에서. 우리의 결과는AS1517499폐지통계6폐쇄성 손상 또는 엽산 신증이있는 신장의 간질 세포에서 활성화. 또한,AS1517499골수성 섬유아세포의 활성화를 억제하고, M2 대식세포 분극을 감소시키며, 감쇠시킨다.신장의섬유 증. 이러한 발견은 억제가통계6와AS1517499섬유성 신장 질환의 치료를위한 잠재력을 가지고 있습니다.
시스탄체 추출물:에서 추출허브 시스탄체신장 질환의 치료를 위해
결과
AS1517499는 폐쇄성 손상으로 신장에서 STAT6 활성화를 억제합니다.
우리는 JAK3 /통계6신호 전달은 폐쇄성 손상 또는 엽산 투여 후 섬유성 신장의 간질성 세포에서 활성화된다(15,16). 여부를 평가하려면통계6의 치료를 위한 치료 표적으로서 작용할 수 있다.신장의섬유 증야생형 마우스는 폐색성 손상을 입었고, 그 후 비히클로 처리되거나AS1517499, a통계6- 특정 억제제, 10 일 동안 이틀마다. 면역조직화학 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 조사하였다.통계6신장에서 활성화. 면역조직화학 염색은 양성 형광체-통계6염색은 주로 폐쇄성 신증이 있는 신장의 간질성 세포에서 검출되었으며, 이는AS1517499치료 (도 1A, B). 이러한 결과와 일관되게 웨스턴 블롯 분석은 포스포 수준을 보여주었습니다.통계6다음과 같은 폐쇄성 신증으로 신장에서 억제되었다.AS1517499치료 (도 1C, D). 이들 데이터는통계6와AS1517499방지통계6폐쇄성 신증이있는 신장에서의 활성화.AS1517499폐쇄성 신증에서 골수성 섬유아세포 축적을 손상시킨다 축적 증거는 골수성 섬유아세포의 모집이 다음의 병인에 유의하게 기여한다는 것을 나타낸다.신장의섬유 증. 여부를 조사하려면AS1517499골수성 섬유아세포 축적에 영향을 미치고, 신장 절편은 조혈 마커 CD45 및 중간엽 마커 PDGFR-β에 대해 염색되었다.
그림 1| AS1517499는 폐쇄성 손상으로 신장에서 STAT6 활성화를 억제합니다.(A) 인산화를 위해 염색된 UUO의 10일째에 신장 절편의 대표적인 현미경 사진통계6(갈색) 및 헤마톡실린(파란색)으로 역염색하였다. 스케일 바, 50um. (B) 인산화의 정량분석통계6-신장에 있는 양성 세포.***P<0.001 vs.=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" levels="" of="">통계6그리고통계6UUO의 10 일째에 신장에서. (d) 정량분석 p-통계6신장의 단백질 수준,***P<0.001 vs=""><0.05 vs="" vehicle-uuo;="">< 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
CD45 및 PDGFR-β 이중 양성 세포의 수는 폐쇄된 신장에서 유의하게 강화된 반면,AS1517499처리는 현저하게 감소된 CD45 및 PDGFR-βdual 양성 세포이다(도 2A, B). 이러한 데이터는통계6억제제AS1517499골수성 섬유아세포가 폐쇄성 손상 후 신장에 축적되는 것을 개선합니다.AS1517499폐쇄성 신증에서 M2 대식세포 분극을 감쇠시킨다 단핵구가 골수 유래 섬유아세포로의 형질전환은 M2 대식세포 분극에 의해 매개된다.통계6M2 대식세포 분극에 중요한 역할을 한다. 따라서, 저해가 있는지 여부를 조사하였다.통계6와AS1517499대식세포 분극을 매개한다. 신장 절편은 CD206 (M2 대식세포 마커) 및 PDGFR-β.CD206 및 PDGFR-β 이중 양성 세포에 대해 염색하였고, 폐쇄성 손상이 있는 마우스의 신장에서 현저하게 증가하였다. 대조적으로,AS1517499폐쇄성 신증이 있는 신장에서 CD206+ 및 PDGFR-β+ 세포의 수를 유의하게 감소시켰다(도 2C, D). 이러한 데이터는AS1517499단핵구가 골수성 섬유아세포로의 전환을 상당히 약화시키고 M2 대식세포 분극을 감소시킨다.
그림 2 | AS1517499는 폐쇄성 손상으로 신장에서 골수성 섬유아세포 축적 및 대식세포 분극을 약화시킵니다.(a) CD45 (적색), PDGFR-β (녹색) 및 DAPI (파란색) 스케일 바, 50μm에 대해 염색된 UUO의 10일째에 어린이 절편의 대표적인 현미경 사진. B) 신장에서 CD45* 및 PDGFR-β* 섬유아세포의 정량적 분석.**P<0.001 vs=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)representative="" photomicroaraphs="" of="" the="" kidney="" at="" day="" 10ofuuo="" stained="" for="" cd206="" (red).pdgfr-b="" (green).and="" dapiblue).scale="" bar.,50um.(d)="" quantitative="" analysis="" of="" cd206t="" and="" pdgfr-b+="" fibroblasts="" in=""><0.01 ys=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (e)quantitative="" analysis="" of="" mrnaexpression="" of="" m2="" macrophage="" markers="" (mrc.fzz1.arg1.ccl17="" in="" the="" kidney="" of="" vehide="" or="">AS1517499치료된 마우스.*P<><><0.05 vs=""><><0.05 vs=""><><0.05vs as-uuo.n="6" per="">
의 효과를 더 평가하기 위해통계6억제제AS1517499M2 대식세포 분극 상에서, M2 대식세포 마커의 mRNA 발현을 검출하기 위해 실시간 RT-PCR을 수행하였다.AS1517499치료는 폐쇄된 신장에서 Argl, MRCl, Fizzl 및 CCL17의 풍부한 mRNA 발현을 억제하였다(도 2E). 이러한 데이터는통계6신호전달 면역형광염색 및 웨스턴 블롯 분석. 면역 형광 염색 및 웨스턴 블롯 분석은 피브로넥틴과 콜라겐 I의 수준이 폐색 된 신장에서 현저하게 증가한 반면,AS1517499치료는 폐색된 신장에서 콜라겐 I 및 피브로넥틴의 단백질 수준을 유의하게 약화시켰다(도 4C-H).
그림 3 | AS1517499는 폐쇄성 손상으로 신장에서 근섬유아세포 형성을 감소시킵니다.(A) UUO 처리된 신장 절편의 대표적인 현미경 사진으로 a-SMA(녹색)로 염색하고 DAPI(파란색)로 역염색하였다. 스케일 바, 50mm. (B) 신장에서 a-SMA 양성 영역의 정량 분석. P< 0.001="" vs="" vehicle-con,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="">< 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" western="" blots="" show="" a-sma="" protein="" levels="" in="" the="" kidney.="" (d)="" quantitative="" analysis="" of="" a-sma="" protein="" expression="" in="" the="" kidney.="" ***p="">< 0.001="" vs="" vehicle-con,="" ##p="">< 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="">< 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
그림 4 | AS1517499는 폐쇄성 손상으로 신장에서 신장 섬유증 및 ECM 단백질 생산을 감쇠시킵니다.(A) 신장에서의 총 콜라겐 침착의 평가를 위해 시리우스 레드로 염색된 신장 절편의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바, 50mm. (B) 신장에서의 간질성 콜라겐 침착의 정량적 분석. P<0.001 vs="" vehicle-con.="" ##p="">< 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="">< 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" fibronectin="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (d)="" quantitative="" analysis="" of="" the="" fibronectin-positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="">< 0.001="" vs="" vehicle-con.="" ##p="">< 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" +="" p="">< 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (e)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" collagen="" i="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (f)="" quantitative="" analysis="" of="" collagen="" i="" positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="">< 0.001="" vs="" vehicle-con.="" #="" p="">< 0.05="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="">< 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (g)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" expression="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" (h)="" quantitative="" analysis="" of="" protein="" levels="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" ***p="">< 0.001="" vs="" veh-con;="" ##p="">< 0.01,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" veh-uuo;="" ++p="">< 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
AS1517499 억제통계6엽산 신증의 활성화
엽산 신증은 또 다른 일반적으로 사용되는 뮤린 모델입니다.신장의섬유 증. 따라서 우리는 여부를 조사했다.AS1517499억제 할 수있다.통계6활성화 및 병인신장의섬유 증엽산 신증에서. 신장 절편은 포스포-염색되었다.통계6.통계6인산화는 FA 신증이 있는 신장의 간질성 세포에서 유의하게 유도된 반면,AS1517499처리는 포스포-STAT6의 발현을 현저하게 억제하였다(도 5A, B). 이들 발견은 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 확인되었다 (도 5C, D). 이러한 데이터는통계6엽산 신증으로 손상된 신장의 간질 세포에서 활성화되며, 이는 다음과 같이 현저하게 억제됩니다.AS1517499치료.
그림 5 | AS1517499는 엽산 신증에서 STAT6 활성화를 억제합니다.(A) 인산화된 면역조직화학 염색의 대표적인 이미지통계6차량 후 2 주 신장에서 또는AS1517499치료. 스케일 바, 50mm. (B) 인산화의 정량 분석통계6비히클 후 2 주 후에 신장에 있는 양성 세포 또는AS1517499치료. P< 0.001="" vs.="" con;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" western="" blot="" of="">통계6그리고통계6신장에. (d) 정량분석 p-통계6신장의 단백질 수준. P< 0.001="" vs.="" con;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="">
AS1517499엽산 신증에서 골수성 섬유아세포 축적을 억제하여 의 역할을 조사하기 위해AS1517499엽산 신증으로 신장에 축적된 골수성 섬유아세포에서, CD45 및 PDGFR-β에 대한 이중 면역형광 염색을 수행하였다. CD45 및 PDGFR-β 이중 양성 세포의 수는 엽산 신증과 함께 신장에서 증가하였다.AS1517499엽산 신증으로 신장에서 CD45 및 PDGFR-β 이중 양성 세포의 수를 상당히 억제하였다 (도 6A, B).
AS1517499엽산 신증에서 M2 대식세포 분극을 약화시킨 다음, 약리학적 억제가 있는지 조사하였다.통계6와AS1517499FA 신증에서 M2 대식세포 분극화를 조절한다. 면역형광염색 분석으로 확인한 바와 같이,AS1517499FA 투여를 받은 비히클 처리된 마우스와 비교하여 CD206 및 PDGFR-β 이중 양성 세포의 수를 유의하게 억제하였다 (도 6C, D). 또한, M2 대식세포 마커인 Argl, MRC1, Fizzl, 및 CCL17은 엽산 신증에서 유도되었다. 이들 M2 대식세포 마커는 다음과 같이 감소되었다.AS1517499치료(도 6E). 이들 데이터는 약리학적 억제가통계6와AS1517499FA 신증으로 신장에서 M2 대식세포 분극을 약화시킵니다.
그림 6 | AS1517499는 엽산 신증에서 골수성 섬유아세포 축적 및 대식세포 분극을 약화시킨다.(A) 비히클 후 2주 후 신장 절편의 대표적인 현미경 사진 또는AS1517499CD45 (적색), PDGFR-b (녹색) 및 DAPI (청색)에 대해 처리하여 염색하였다. 스케일 바, 50mm. (B) 신장에서 CD45+ 및 PDGFR-b+ 섬유아세포의 정량적 분석. **P< 0.01="" vs="" con.="" #="" p="">< 0.05="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" photomicrographs="" of="" kidney="" sections="" 2="" weeks="" after="" vehicle="" or="">AS1517499CD206 (적색), PDGFR-b (녹색) 및 DAPI (청색)에 대해 처리하여 염색하였다. 스케일 바, 50mm. (D) 신장에서 CD206+ 및 PDGFR-b+ 섬유아세포의 정량적 분석. P< 0.001="" vs="" con.="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (e)="" quantitative="" analysis="" of="" mrna="" expression="" of="" m2="" macrophage="" makers="" (mrc,="" fizz1,="" arg1,="" ccl17)="" in="" the="" kidney="" 2="" weeks="" after="" vehicle="" or="">AS1517499치료. P< 0.001="" vs="" con;="" ###p="">< 0.001="" vs="" fa+veh;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="">
AS1517499엽산 신증에서 근섬유아세포 형성을 감쇠시켜 여부를 결정하기 위해AS1517499근섬유아세포 형질전환에 영향을 미치고, α-SMA 발현을 신장 절편 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 조사하였다. UUO 모델에서의 우리의 발견과 일치하여, α-SMA 양성 근섬유아세포 및 α-SMA 단백질의 발현은 비히클 처리된 마우스와 비교하여 FA로 처리한 후 신장에서 강화되었다. 또한, FA의 공동 투여와AS1517499FA 공동투여된 비히클 그룹과 비교하여 신장에서 α-SMA 양성 세포 및 α-SMA 단백질 수준이 유의하게 감소하였다(도 7A-D). 이러한 결과는AS1517499엽산 신증으로 신장에서 근섬유아세포 형성을 억제합니다.
그림 7 | AS1517499는 엽산 신증에서 근섬유아세포 형성을 감소시킨다.(A) 비히클 후 2주 후 신장 절편의 대표적인 현미경 사진 또는AS1517499a-SMA (녹색)에 대해 염색하고 DAPI (파란색)로 역염색하였다. 스케일 바, 50mm. (B) 신장에서 a-SMA 양성 영역의 정량 분석. P< 0.001="" vs="" con;="" ###p="">< 0.001="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" western="" blots="" showing="" a-sma="" protein="" levels="" in="" the="" kidney="" 2="" weeks="" after="" vehicle="" or="">AS1517499치료. (d) 신장에서의 a-SMA 단백질 발현의 정량적 분석. P< 0.001="" vs="" con,="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="">
마카 인삼 시스탄체
AS1517499 개선신장의섬유 증엽산 신증에서 신장 기능을 보존합니다.
의 효과를 평가하려면AS1517499on신장의섬유 증, picrosiriusred 염색은 신장 절편에 대해 수행되었다. FA 처리 마우스는 콜라겐 침착 수준이 현저하게 상승한 반면,AS1517499치료는 신장에서 콜라겐 침착의 양을 유의하게 감소시켰다 (도 8A, B). 추가적으로, 면역형광 염색 및 웨스턴 블롯 분석은AS1517499엽산 신증으로 신장에서 ECM 단백질 (피브로넥틴 및 콜라겐 I)의 발현을 유의하게 억제합니다 (그림 8C-H). 이러한 데이터는AS1517499신장에서 ECM 생산과 발달을 억제합니다.신장의섬유 증엽산 신증에서.
의 효과를 평가하기 위해통계6엽산 신증에서 신장 기능에 대한 결핍, 혈청 크레아티닌을 측정하였다. 엽산-처리된 마우스는 혈청 크레아티닌의 유의한 상승을 나타내었다(도 8I). 대조적으로, 치료된 마우스는AS1517499엽산 신증에서 훨씬 낮은 혈청 크레아티닌을 나타내었다. 이러한 결과는통계6와AS1517499엽산 신증으로부터 신장을 보호합니다.
그림 8 | AS1517499는 신장 섬유증을 감소시키고 엽산 신증에서 신장 기능을 보존합니다.. (A) 비히클 후 2주 후 신장 절편의 대표적인 현미경 사진 또는AS1517499신장에서의 총 콜라겐 침착의 평가를 위해 시리우스 레드로 염색된 치료. 스케일 바, 50mm. (B) 신장에서의 간질성 콜라겐 침착의 정량적 분석. P< 0.001="" vs="" con,="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" photomicrographs="" of="" kidney="" sections="" stained="" for="" fibronectin="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (d)="" quantitative="" analysis="" of="" the="" fifibronectin-positive="" area="" in="" fa="" treated="" kidneys.="" ***p="">< 0.001="" vs="" con,="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (e)="" representative="" photomicrographs="" of="" kidney="" sections="" stained="" for="" collagen="" i="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (f)="" quantitative="" analysis="" of="" collagen="" i="" positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="">< 0.001="" vs="" con,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (g)="" representative="" western="" blots="" showing="" protein="" expression="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" (h)="" quantitative="" analysis="" of="" protein="" levels="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" ***p="">< 0.001="" vs="" con;="" ##p="">< 0.01="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="" group.="" (i)="" effect="" of="">AS1517499혈청 크레아티닌에. **P< 0.001="" vs="" con;="" #="" p="">< 0.05="" vs="" fa+veh.="" n="6" per="">
중국 전통 약초 :시스탄체
참고 : 중국 전통 약용허브 시스탄체( "용의 허브"와 "사막 인삼"이라고도 함)은 건조하고 따뜻한 사막에서만 자랍니다. 아홉 가지 불멸의 허브 중 하나로서,시스탄체(cistanche tubulosa/시스탄체 데저트리콜라/사막 생활 cistanche/시스탄체 살사)에키나코사이드, 액테오사이드, 토탈페닐에타노이드 배당체, 플라보노이드, 다당류 등 유효성분이 풍부한 성분으로 함유한 함량으로 시스탄체는 사람의 면역력, 내기관, 뇌세포, 뉴런 등을 위한 귀중한 영양허브와 식품소재로 자리매김했다. 현대 약리학 연구는 다음을 확인했습니다.시스탄체의 효과(시스탄체의 장점): 면역력을 향상시킨다; 성적 기능과 신장 기능을 향상; 안티 피로; 노화 방지; 기억력 향상; 항 파킨슨 병; 항알츠하이머병; 항산화; 편의-변비; 항염증제; 뼈 성장을 촉진, 미백 피부; 간을 보호; 등.
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