Caco-2 세포 단층 모델을 통한 Cistanche Deserticola의 페닐에타노이드 글리코시드가 풍부한 추출물의 장 수송 평가

소개

인간 결장 선암종에서 유래된 Caco-2 세포주는 장세포와 유사한 특성을 나타냅니다. 정상적인 조건에서 Caco-2 세포는 성숙한 세포에서 자발적으로 분화되어 손상되지 않은 단층을 형성합니다. 인접한 세포는 단층의 정점 측에 형성된 단단한 접합을 통해 부착되며, 이는 수동적으로 구별할 수 있습니다.상피층을 통해 약물을 적극적으로 운반했습니다. 정상적인 장세포와의 형태학적 및 생화학적 유사성으로 인해 Caco{0}} 세포 단층은 장내 흡수 잠재력과 약물의 수송 특성 연구를 위한 시험관 내 모델로 널리 사용됩니다.

화학 물질과 달리 식물 추출물(PE)은 생물학적 활성과 활성 성분이 잘 식별되지 않는 혼합물입니다. 더욱이 PE의 장내 수송 특성은 구성 성분의 특성과 달리 임상 용도와 밀접한 관련이 있습니다. Caco-2 세포 단층 전체의 테스트 샘플에 대한 플럭스 측정에는 일반적으로 HPLC, LC/MS 등과 같은 화학적 방법이 포함됩니다. 이러한 방법은 강력한 도구이지만 복잡하고 시간이 많이 걸리며 비용이 많이 들고 때로는 정교한 장비가 필요합니다. 더 중요한 것은 단일 또는 소수 구성 요소가 PE 전체를 반영할 수 없다는 것입니다. 따라서 PE의 운송 특성을 식별하고 평가하기 위해서는 구성 요소 결정과 무관한 새로운 접근 방식을 확립해야 합니다.

홀로기생식물인 CD(Cistanche Deserticola YC Ma)는 주로 신장결핍, 허약, 변비 치료에 사용되는 흔한 한약재이며, 이러한 용도는 중국약전에 공식적으로 기록되어 있습니다.페닐에타노이드 배당체(PhG)에키나코사이드(EC), 액티오사이드(AC), 아이소액티오사이드(IS) 등을 포함한 폴리페놀 화합물의 일종입니다. 이들은 Cistanche 종의 주요 생리활성 성분 중 하나로 간주됩니다. 약리학적 연구에 따르면 PhG의 생체 활성은 항산화, 항피로, 간 보호, 면역 조절, 항염증 및 신경 보호 효과를 포함하여 다양합니다. 그러나 PhG의 장내 수송 특성은 조사되지 않았습니다. 본 연구에서는 통합 시스템인 CD의 PhG가 풍부한 추출물(PRE)의 장 투과성과 분화된 Caco{4}} 세포에서 세 가지 주요 PhG(AC, IS 및 EC)의 투과성을 조사했습니다. 우리의 결과는 PRE가 유출 없이 농도 구배 아래로 잘 흡수되지 않은 수동 확산을 통해 주로 운반된다는 것을 나타냈으며, 이는 CD에서 PhG의 임상 적용을 위한 약동학적 기초를 제공합니다.

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재료 및 방법

재료

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%)는 Must Biotechnology Co.(중국 청두)에서 구입했습니다. Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 태아 소 혈청(FBS) 및 비필수 아미노산(NEAA)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 생산되었습니다. 6-웰 Transwell™ 플레이트(삽입 막 성장 면적 4.67 cm2)는 Corning(Costar) Inc.(Tewksbury, MA, USA)에서 구입했습니다. 쥐꼬리 콜라겐은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. HPLC 분석을 위한 모든 시약과 화학물질은 분석 등급이었습니다.

CD에서 PRE 준비

공기 건조된 CD 물질을 분말화하고 70% 에탄올로 삼출하여 추출했습니다. PhG가 풍부한 분획은 이전에 설명한 대로 제조되었으며 물 포화 n-부틸 알코올로 추출되었습니다. 추출액을 농축하고 감압하에 건조시켰다. 거대다공성 수지-UV 분광광도법으로 PhG 함량이 78.4%로 측정되었습니다. 최종 샘플은 건조 중량 기준으로 1.75%의 원료 수율을 나타냈습니다. 얻은 샘플은 추가 사용 전까지 -20도에서 보관되었습니다.

HPLC를 통한 AC, IS 및 EC 측정

LC 솔루션 소프트웨어가 장착된 Shimadzu HPLC 시스템을 사용하여 PRE의 AC, IS 및 EC 함량을 분석했습니다. 역상 Intersil C18 컬럼(4.6mm × 250mm, 5μm)을 사용하고 실온에서 유지했습니다. 이동상은 1.0 ml/min의 유속에서 구배 용리(표 1)를 사용하여 0.1% 인산(v/v)을 함유한 아세토니트릴 및 물이었습니다. UV 분광 광도계 검출기는 334 nm로 설정되었습니다. AC와 IS의 플럭스를 정확하게 결정하기 위해 새로운 HPLC-형광 검출(HPLC-FLD) 방법을 개발했습니다. 구조 분석 및 형광 파장 스캐닝(데이터는 표시되지 않음) 후 AC(예: 338 nm, Em: 448 nm) 및 IS(예: 320 nm, Em: 434 nm)에 대한 최적의 형광 검출 조건을 얻었습니다.

HPLC 분석 방법은 안정성, 선형성, 민감도, 정밀도(일중 및 일일 변동성) 및 정확성과 같은 성능 특성을 사용하여 검증되었습니다. 운반 완충액의 분석물을 25도 암소에서 24시간 동안 보관하고 안정성을 측정했습니다. 피크 영역의 상대 표준 편차(RSD) 값이 < 3.5%였기 때문에 분석물은 비타민 C(0.4%) 존재 하에서 매우 안정적이었습니다. AC, IS, EC에 대한 선형 회귀 방정식, 상관 계수, 선형성 범위, LOD 및 LOQ는 표 2에 나와 있습니다. LOD(18–30 nM) 및 LOQ(60–100 nM) 값은 HPLC-FLD 및 HPLC-UV 방법이 매우 민감하다는 것을 보여줍니다. 방법의 정밀도를 나타내는 RSD 값은 일중 및 일간 변동성이 모두 2% 미만으로 정밀도가 양호함을 나타냅니다. 회수율 평가를 위해 AC, IS 및 EC를 수송 완충액에 첨가하여 3가지(고, 중, 저) 농도 수준을 산출했습니다. 분석물질에 대한 분석법의 회수율 값은 표 3에 요약되어 있습니다. 평균 회수율은 90.0%~96.4% 범위로 정확도가 우수함을 나타냅니다. 결론적으로 확립된 HPLC 방법은 수송 완충액의 AC, IS 및 EC 정량화에 대한 선형성, 민감도, 정밀도 및 정확도 측면에서 만족스럽습니다.

생물검정 시스템에 의한 PRE 결정

생물학적 분석(총 항산화 능력)은 이전에 설명한 FRAP(철 환원/항산화력) 분석을 기반으로 했으며[16] 선형성과 정밀도(일내 및 일일 변동성) 측면에서 검증되었습니다. 생물학적 검정 방법의 선형성은 검량선을 기반으로 결정되었습니다. 선형성의 농도 범위는 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996)입니다. 확립된 생물학적 분석 방법의 정확성은 PRE(10.0ug/ml) 분석에 대한 일내 및 일간 변동성 측면에서 결정되었습니다. 방법의 일중 반복성은 같은 날에 5번 연속 측정을 기반으로 결정되었습니다. 일간 반복성은 서로 다른 3일 동안 5회 연속 측정을 기반으로 측정되었습니다. 방법의 정밀도에 대한 RSD 값은 일일 변동성과 일일 변동성에 대해 각각 1.014%와 4.72%로 우수한 정밀도를 나타냅니다. 따라서, 확립된 생물학적 분석법은 수송 완충액 내 PRE의 정량화에 대한 선형성, 정밀도 및 정확성 측면에서 만족스럽습니다.

세포 배양

Caco{0}} 세포는 5% CO2 및 DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-글루타민, 페니실린으로 구성된 배지를 포함하는 분위기에서 37도, 95% 상대 습도에서 배양되었습니다. (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 ug/ml). 세포 성장과 분화 동안 배지는 격일로 교체되었습니다. 세포를 75-cm2 플라스틱 플라스크에서 배양하고 0.05% EDTA-트립신으로 3~5일마다 수확했습니다. 수송 실험을 위해 세포를 콜라겐으로 코팅된 Transwell 삽입물에 1×105개 세포/cm2의 밀도로 접종했습니다. 파종 후 약 21일 후에 단층을 수송 실험에 사용했습니다. ENDOHM-SNAP(World Precision Instruments, Inc., USA)이 장착된 EVOM을 사용하여 단층 전체에 걸쳐 상피 전기 저항(TEER)을 측정하여 이들의 무결성을 결정했습니다. Caco-2 세포 단층의 TEER 값은 500 O∙cm2를 초과해야 했습니다.

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운송 실험

단층을 수송 완충액(10 mM HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 mM 포도당, 3 mM CaCl2 및 145 mM NaCl을 함유하는 P-완충액, pH 7.4)으로 세척한 후 20분 동안 사전 배양했습니다. 37도에서. 수송 완충액을 제거한 후, 시험 샘플을 함유한 새로운 수송 완충액을 AP에서 기저측면(BL) 방향 연구의 근단(AP) 챔버(1.5ml) 또는 BL에서 AP 방향 연구의 BL 챔버(2.5ml)에 첨가했습니다. HPLC를 사용한 AC, IS 및 EC 분석의 경우, 서로 다른 시간 간격(30, 60, 90 및 120분)으로 각 수용기 챔버에서 분취량(300ul)을 제거했습니다. 리시버 챔버는 각 샘플링 후에 동일한 부피의 새로 예열된(37도) 운송 완충액으로 보충되었습니다. 수집된 샘플은 추가 사용을 위해 -20도에 보관되었습니다. 생물학적 검정을 사용한 PRE 측정의 경우 120분의 샘플만 채취했습니다. PRE, AC, IS, EC의 불안정성으로 인해 시료를 안정화시키기 위해 0.4%(w/v) 비타민 C를 첨가하여 HPLC로 AC, IS, EC 함량을 측정하였으며, PRE 생물검정용 시료는 샘플링 후 즉시 분석됩니다. 각 샘플의 겉보기 투과도 계수(Papp 또는 'Papp) 값을 계산했습니다.

데이터 분석

AC, IS 및 EC의 AP BL 또는 BLAP 방향의 Papp 값은 다음 방정식을 기반으로 계산되었습니다. Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), 여기서 Papp은 HPLC에 의해 결정된 겉보기 투과성 계수(cm/s)입니다. (4Q/4t)는 수용체 측에서 테스트 화합물(AC, IS 또는 EC)이 나타나는 속도(μmol/s)입니다. A는 인서트의 표면적(cm2)입니다. C0는 기증자 측의 초기 시험 화합물 농도(μmol/ml)입니다. 구체적으로는 'Papp 값을 계산할 때 'μmol' 대신 질량 단위 'ug'를 사용했다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.

결과

CD의 PRE에 있는 AC, IS, EC의 구성

AC, IS, EC가 주요 생리 활성 물질로 간주되기 때문에Cistanche 종의 PhG, 우리는 HPLC-UV를 통해 PRE의 내용을 분석했습니다. 대표적인 크로마토그램은 그림 1에 나와 있습니다. 이러한 성분의 식별은 334nm 파장에서 머무름 시간과 UV ​​스펙트럼을 실제 표준과 비교하여 확인되었습니다. PRE의 AC, IS, EC 함량은 각각 26.60%, 1.84%, 32.83%였다. 따라서 이 세 가지 화합물은 PRE의 61.27%를 차지합니다. 또한, 위의 결과는 PRE의 PhG 함량이 78.4%임을 나타냅니다. 따라서 AC, IS, EC가 PRE에서 PhG의 약 80%를 차지합니다.

PRE, AC, IS, EC의 총 항산화 능력

연구PhG의 항산화 활성CD의 PhG가 보고되었으며 AC, IS, EC가 PRE의 PhG의 약 80%를 차지합니다. 따라서 PRE, AC, IS 및 EC의 총 항산화 능력을 분석하고 FRAP 값(× 10-6 mmol)을 사용하여 표현했습니다. 그림 2에서 보는 바와 같이 FRAP 값이 8×10-6 mmol일 때 PRE, AC, IS, EC의 최종 농도는 6.20 ug/ml, 3.14 ug/ml, 22.92 ug/ml, 4.89 ug로 나타났다. /ml는 각각 이 4개 샘플의 총 항산화 능력이 AC > EC > PRE > IS로 순위가 매겨졌음을 나타냅니다. PRE의 생체 활성은 활성 성분 그룹(AIG)에 기인합니다. PRE의 약 60%에서 AC와 EC가 PRE와 IS보다 총 항산화 활성이 더 강한 것으로 나타났습니다. IS(1.84%)는 PRE의 매우 작은 부분을 구성하기 때문에 약한 항산화 IS와 같은 다른 구성 요소도 PRE에서 분명히 활성화됩니다. 놀랍게도 총 항산화 활성은 AC와 그 이성질체 IS 사이에서 거의 7-배 달랐으며, 이는 페놀성 수산기의 수뿐만 아니라 분자 내 페놀성 수산기의 위치도 항산화 효과에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. .

Caco-2 단층 검증

Caco-2 세포 단층 시스템을 검증하기 위해 Caco-2 단층을 가로질러 AP에서 BL까지 프로프라놀롤(잘 전달되는 마커)과 Lucifer yellow(잘 전달되지 않는 마커)의 Papp 값을 측정했습니다. 각각 1.51 × 10-5 cm/s 및 2.8 × 10-7 cm/s로 결정되었으며 이 값은 이전 보고서에 발표된 값과 일치했습니다. 알칼리성 포스파타제 활성 분석을 통해 Caco{11}} 세포 단층이 소장 상피와 질적으로 유사하다는 사실도 확인되었습니다.

AC, IS, EC의 투자율

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), 반면에 흡수가 잘 안되는 약물의 경우는 낮았습니다(< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

PRE의 투자율

위의 결과는 PRE의 전체 항산화 능력이 적어도 PRE의 AIG 61.27%에 기인함을 나타냅니다. 따라서 우리는 총 항산화 능력의 농도-효과 곡선을 기반으로 PRE의 TR을 평가하고 PRE의 수송 특성을 반영하는 'Papp 값'을 계산했습니다. AP!BL 및 BL!AP에 대한 PRE의 'Papp 값은 (2.16 ± 0.26) × 10-7 cm/s 및 (3.13 ± 0.29) × 10-7 cm/s였습니다. s는 각각 이 화합물이 투과성이 좋지 않음을 나타냅니다. 또한, PRE에 대한 'Papp BL 대 AP / 'Papp AP 대 BL' 비율이 1.45이기 때문에 유출 또는 능동 수송이 분명하지 않았습니다. 더욱이, PRE의 양방향 TR은 약 300~900ug/ml 사이에서 선형적으로 증가했습니다(그림 5). 결과의 방향 선호도가 부족하다는 것은 수동 확산이 PRE의 주요 전송 메커니즘임을 시사합니다.

면역력 향상을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

논의

고도로 정제된 의약품에 비해 PE는 일반적으로 다양한 물리화학적 특성을 지닌 수백 가지 성분으로 구성된 혼합물입니다. 따라서 PE는 복잡한 AIG로 인해 체계적, 다중 표적 및 다중 채널 시너지 작용을 발휘하며[21], 이는 PE의 운송 특성 분석을 방해합니다. PE의 수송 특성을 보다 과학적으로 평가하기 위해 일부 연구자들은 PE에서 단일 구성 요소가 아닌 여러 구성 요소를 식별했습니다[22-24]. 그럼에도 불구하고 제한된 수의 구성요소가 PE 전체를 반영할 수는 없습니다. 그러나 PE의 모든 구성 요소를 결정하는 것은 불가능합니다. 더욱이 PE의 다양한 구성 요소가 완전히 다른 운송 특성을 나타내는 경우 PE의 전체적인 운송 특성을 식별하기 어려울 것입니다.

1990년대에는 항균제의 TR을 평가하기 위해 생물학적 검정 시스템이 사용되었습니다[25]. 2005년까지 Eguchi와 그의 동료들은 분화된 Caco{5}} 세포의 BL 배지를 사용하여 당근 추출물의 항산화 활성을 평가했습니다. 이 접근법은 생체 내 상황을 반영하는 데 더 적합합니다.

PhG의 활성에 대한 이전 보고서와 결과(그림 2)를 기반으로 PRE에서 AIG의 TR은 수용기 챔버에서 매체의 총 항산화 용량을 결정하여 평가할 수 있습니다. 수송 실험 후, 우리는 PRE의 TR이 양방향에서 유사하다는 것을 발견했으며, 이 수송은 불포화되고 잘 흡수되지 않았으며('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), 그렇지 않았습니다. 유출을 나타내며, 이는 농도 구배 아래로의 수동 확산이 PRE의 주요 수송 메커니즘임을 시사합니다(그림 5). 또한, PRE의 수송 특성은 PRE에서 항산화 활성을 나타내는 유효 성분인 AC, IS 및 EC의 수송 특성과 일치합니다(그림 4 및 표 4). 이러한 결과는 예상되었으며, 현재의 생물검정 시스템이 분화된 Caco{10}} 세포에서 PRE의 AIG 수송 특성을 평가하는 데 적합하고 신뢰할 수 있음을 나타냅니다.

단일 화합물의 이동을 반영하는 데 일반적으로 사용되는 표준 Papp 값과 달리 농도-효과 곡선을 기반으로 TR에서 얻은 'Papp 값은 손상되지 않은 구조로 단층을 관통하는 구성 요소를 반영할 뿐만 아니라 또한 구성 요소의 대사 산물, 화학적으로 분해된 산물, 심지어 표적 생체 활성에 영향을 미칠 수 있는 자극에 반응하여 Caco{1}} 세포에서 분비되는 일부 사이토카인과 같은 표적 활성과 관련된 다른 요인도 포함됩니다. 따라서 운송된 온전한 구성 요소뿐만 아니라 위에서 언급한 다중 요소가 'Papp 값을 결정합니다. 따라서 'Papp은 표준 Papp 값보다 생체 내 상황과 더 강한 상관관계가 있을 수 있습니다. 본 연구에서는 PRE의 'Papp value'를 기반으로 PRE의 수동적 확산 및 흡수 불량 특성을 밝혔으며, 이러한 특성은 CD의 고용량 및 긴 임상 치료 기간과 관련이 있을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 발견은 PhG뿐만 아니라 대부분의 CD 내 AIG의 수송 특성만 확인된 경우 CD 적용에 있어 임상의에게 보다 체계적인 지침을 제공할 것입니다.

그러나 선택된 생체 활성 항목은 수용기 챔버의 매체에서 검출될 만큼 충분히 민감해야 하며, 이는 PE의 수송 특성을 평가하기 위한 생물학적 검정 시스템을 확립하는 데 어려움을 겪습니다. 또한, 생체활성은 가능한 한 많은 구성요소에 따라 달라져야 합니다. 우리 연구에서는 총 항산화 능력 분석이 다른 여러 방법보다 더 적합했습니다(그림 S1). 그러나 그럼에도 불구하고 우리의 분석은 120분에만 PRE의 TR을 감지할 수 있습니다.

종합적으로, 본 연구에서는 분화된 Caco{0}} 세포에서 PRE의 장 투과성을 평가하기 위한 새로운 생물검정 시스템을 구축했습니다. 얻은 결과는 유출 없이 농도 구배 아래로 흡수가 잘 되지 않는 수동 확산이 PRE의 주요 수송 메커니즘임을 보여 주며(그림 5), 이는 CD에서 PhG의 임상 적용을 위한 약동학적 기초를 제공합니다. TR을 평가하고 이를 통해 PE에서 AIG의 장내 수송 특성을 평가하기 위한 'Papp 값을 계산하는 새로운 생물검정 시스템을 사용하는 것이 가능합니다. 이 접근법은 적절한 생체활성이 주어지면 다른 PE에도 적합할 수 있습니다.

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