추상적인장미 꽃잎 추출물의 항 피부 염증 활성은 이전 연구에서 설명되었습니다. 피부 염증은 피부 노화와 밀접한 관련이 있기 때문에 우리 연구에서는 Rosa gallica 꽃잎이 피부 미백 및 주름 방지 특성과 같은 피부 노화 관련 활동에 미치는 영향을 조사했습니다. 각 샘플은 산업적 응용을 위한 최적의 추출 조건을 평가하기 위해 서로 다른 에탄올 비율을 사용하여 추출을 통해 준비되었습니다. R. gallica 꽃잎의 수성 50%(v/v) EtOH 추출물은 티로시나제 활성, 멜라닌 생성 및 주름 형성의 특징인 태양 UV 유도 매트릭스 메탈로프로테이나제-1를 상당히 억제했습니다. 또한, 수성 50%(v/v) EtOH 추출물이 가장 높은 항산화 효과를 보였고, 플라보노이드 함량이 가장 높아 보고된 노화 방지 효과와 일치했습니다. 전반적으로 우리의 발견은 R. gallica 꽃잎 추출물이 노화 방지 효과를 나타냄을 시사합니다. 또한, 특히 50% EtOH 추출은 가장 높은 플라보노이드 함량을 얻을 뿐만 아니라 최고의 항노화 및 항산화 효과를 나타내기에 최적이었습니다.

관련 연구에 따르면, Cistanche는 "생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주성분은 시스타노사이드(cistanoside)로 항산화, 항염증, 면역기능 촉진 등 다양한 효능이 있다. cistanche와 피부 미백 사이의 메커니즘은 citanche glycosides의 항산화 효과에 있습니다. 인간 피부의 멜라닌은 티로시나제에 의해 촉매되는 티로신의 산화에 의해 생성되며, 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 라디칼이 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche는 산화 방지제인 cistanoside를 함유하고 있으며 신체의 자유 라디칼 생성을 감소시켜 멜라닌 ​​생성을 억제할 수 있습니다.

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키워드Rosa gallica 피부노화 플라보노이드 항산화 효과

소개

피부는 유전 및 유전학, 환경 문제, 호르몬 변화 및 대사 과정과 관련된 유해 요인에 대한 보호 장벽으로서 중요한 역할을 합니다(Mukherjee et al., 2006). 이 중 태양 자외선(UV) 노출과 같은 환경 요인은 조기 노화에 기여하는 핵심 매개체 역할을 합니다(Laga and Murphy, 2009). 광노화로 인해 발생하는 피부노화의 주요 증상은 깊은 주름, 비정상적인 색소침착, 탄력 등이었다(Farage et al., 2013; Wlaschek et al., 2001).

색소침착은 노화에 따른 증상으로 멜라닌의 비정상적 생성으로 인해 주근깨, 기미, 검버섯, 기타 과색소침착 증후군 등 다양한 피부질환을 유발한다(D'Mello et al., 2016; Seo et al., 2003). 멜라닌 생성 경로에서 티로시나아제는 L-티로신을 L-DOPA로 전환하고 L-DOPA를 산화시켜 DOPA-퀴논을 형성하는 속도 제한 효소로서 중요합니다(Akhtar et al., 2015). 따라서 티로시나아제의 억제는 멜라닌 합성과 밀접한 관련이 있습니다. 또한, 콜라겐 피브릴과 엘라스타아제의 소실로 인한 주름 형성은 광노화의 또 다른 특징입니다. 인간 피부 섬유아세포에서 분비되는 매트릭스 금속단백분해효소-1(MMP-1)는 주로 광노화 과정 동안 콜라겐 분해를 담당합니다(Pandel et al., 2013). 콜라겐 분해를 억제하는 MMP-1 발현의 하향 조절은 주름 개선 기능을 향상시킬 수 있습니다.

상기 언급한 이유로, 티로시나제 억제제 또는 MMP 억제제의 사용은 피부 광노화 완화를 위한 유망한 전략으로 간주된다. 이전 연구에서는 레티놀, 마늘 추출물(카페인산 및 S-알리 시스테인)과 피토세라마이드, 코직산, 알부틴 및 비타민 C가 피부 노화 억제제로 작용할 수 있음을 나타냈습니다(Couteau and Coiffard, 2016; Kim et al., 2013). . 그러나 이들 물질의 사용에는 세포독성, 냄새, 착색 등의 각종 부작용 등 일정한 한계가 있다(Yamakoshi et al., 2003). 따라서 현재 연구는 효과적인 피부 광보호를 제공하는 보다 안전하고 자연 유래 성분의 개발에 초점을 맞추고 있습니다.

전 세계적으로 재배되는 Rosa 종은 식이 보조제의 좋은 공급원으로 간주됩니다. 페놀산, 플라보놀 및 안토시아닌과 같은 성분을 함유하는 장미 꽃잎 추출물(RPE)은 다른 생물학적 역할 외에도 항 피부 염증 활성과 같은 많은 유익한 효과를 나타내는 것으로 보고되었습니다(Bitis et al., 2 017; Lee et al., 2018; Masek et al., 2017; Navarro-Gonzalez et al., 2015). RPE의 이러한 특성은 피부 노화와 관련이 있는 것으로 알려져 있기 때문에 피부 보호를 위한 잠재적 후보로 제안되었습니다. 그러나 RPE가 피부 노화에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 또한 물과 에탄올은 극성 차이와 사용 안전성 때문에 최고의 추출 용매로 간주됩니다(Abarca-Vargas et al., 2016). 따라서 물과 에탄올의 비율이 다른(0, 10, 30, 50, 70, 90 및 100% 에탄올 RPE) 샘플을 추출을 통해 준비했습니다.

본 연구의 목적은 RPE가 피부 미백 및 주름 개선에 미치는 영향을 조사하는 것이다. 다양한 추출 용매 비율(0, 10, 30, 50, 70, 90 및 100% 에탄올/물 용매)을 사용하는 RPE 추출물을 테스트하여 추출을 위한 최적의 용매 비율을 결정했습니다.

재료 및 방법

시약

Rosa gallica 꽃잎은 지엔바이오(경기도, 대한민국)를 통해 터키에서 수입되었습니다. Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), Penicillin-streptomycin-neomycin 및 0.5% trypsin-EDTA는 GIBCO Invitrogen(Auckland, NZ, USA)에서 구입했습니다. Tyrosinase와 b-actin에 대한 특정 항체는 Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했습니다. MMP-1의 1차 항체는 R&D 시스템에서 입수했습니다. 알파 멜라닌 세포 자극 호르몬(a-MSH), 버섯 티로시나제 및 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)를 포함한 다른 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich Co., LLC(St. 미국 미주리주 루이스).

샘플 준비

장미 꽃잎을 0, 10, 30, 50, 70, 90 및 100%(v/v) EtOH(절대 에탄올) 100mL와 혼합했습니다. 이어서 환류 응축기를 사용하여 80도 물에서 가용성 성분을 추출하였다. 추출액을 2호 여과지(Whatman, Maidstone, England)로 여과한 후 진공 농축한 후 증류수에 녹여 동결건조하여 기능분석 시험용 시료로 사용하였다.

세포 배양

B16F10 흑색종 세포는 대한세포주은행(서울, 한국)에서 구입하였다. HDF(Human dermal fibroblast) 세포는 정진호 박사(서울대학교 의과대학)로부터 입수하였다. 두 세포 모두 37도 및 5% CO2 조건에서 10% 태아 소 혈청(v/v) 및 1%(v/v) 페니실린이 보충된 DMEM에서 배양되었습니다.

세포 생존력

세포 생존율은 MTS [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-({{7 }}설포페닐)-2H-테트라졸륨]분석. 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고 융합될 때까지 성장시켰습니다. 그런 다음, 세포를 무혈청 DMEM으로 밤새 굶기고 표시된 농도의 샘플로 24시간 동안 처리했습니다. 샘플에 노출된 후, MTS 용액 20 μL를 세포와 1시간 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Sunrise-Basic Tecan, Tecan Austria GmbH Gro¨dig, Austria)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

체외 버섯 티로시나제 활성

in vitro tyrosinase assay는 앞서 설명한 방법에 따라 수행하였다(Kim et al., 2015). 요약하면, 각 시료 40 lL를 분석 완충액(20 μL의 0.1 M 인산칼륨)에 첨가한 다음 20 μL의 버섯 티로시나제(0.02 mg/mL)와 함께 30분 동안 배양했습니다. 그 다음, 기질(L-DOPA) 40㎕를 각 혼합물에 첨가하였다. 반응을 실온에서 15분 동안 진행시킨 후 마이크로플레이트 판독기(Infinite 2000 PRO, Tecan, Switzerland)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하여 도파크롬의 형성을 분석하였다.

멜라닌 생성 평가

멜라닌 생성 분석은 이전에 기술된 프로토콜(Friedmann and Gilchrest, 1987; Gordon et al., 1989)에 따라 수행되었습니다. B16F10 세포(8 9 103 세포)를 2mL 배양 배지가 있는 6-웰 플레이트에 시딩했습니다. 24시간 후, 샘플을 세포로 1시간 동안 전처리한 후, α-MSH(100 nM)를 세포에 노출시켰다. 72시간 후 세포를 수집하고 마이크로플레이트 판독기(Infinite 2000 PRO, Tecan, Switzerland)를 사용하여 495 nm에서 멜라닌 생성을 측정하였다.

웨스턴 블롯

단백질 샘플은 19 Cell Lysis Buffer(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)를 사용하여 세포에서 얻었습니다. PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, San Jose', CA, USA)를 사용하여 단백질 농도를 추정했습니다. 단백질 샘플을 전기영동을 위해 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)에 로딩한 다음 Immobilon P 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼습니다. PVDF 멤브레인을 5% 무지방 우유로 1시간 동안 차단하고 멤브레인을 4도에서 밤새 특정 1차 항체로 처리했습니다. 단백질 밴드는 HRP가 결합된 2차 항체(Cell Signaling)와 혼성화한 후 화학발광 검출 키트(GE Healthcare, NJ, USA)를 사용하여 검출하였다.

DPPH 라디칼 소거 분석

DPPH 라디칼 소거 활성은 다음과 같이 측정하였다. {0}}.2 mL의 추출물을 각각 3 mL의 α-에탄올에 첨가하고 여기에 에탄올에 녹인 0.8 mL의 400 lM DPPH를 첨가하였다. 이 혼합물을 10초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분 동안 유지하고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Wang et al., 1999). DPPH 라디칼 소거능은 DPPH를 첨가하지 않은 군의 흡광도를 백분율로 나타내었다. 모든 실험은 최소 3회 반복되었습니다.

총 플라보노이드 함량

추출물의 총 플라보노이드 함량은 카테킨으로 변형된 염화알루미늄법(Jia et al., 1999)을 사용하여 측정하였다. 추출물 100 μL에 증류수 500 μL와 NaNO2 30 μL를 첨가하고 6분 후에 AlCl3 60 μL를 첨가하였다. 5분 후, 200 μL의 1 M NaOH를 첨가하고 증류수로 1 mL로 만들었다. 용액을 잘 혼합하고 15,928g에서 4도에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액 200 ㎕를 취하여 마이크로플레이트 리더기(Infinite 2000 PRO; Tecan, Switzerland)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

실험은 3회 수행되었으며 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 스튜던트 t 테스트는 단일 통계 비교에 사용되었습니다. 통계적 유의성은 (#) {0}} p\ 0.05 및 (##)=p\ 0.001로 설정되었습니다. 처리되지 않은 대조군과의 비교; (*)=p\ 0.05 및 (**)=p\0.001은 a-MSH 처리 그룹과의 비교입니다.

결과 및 토론

용제비에 따른 Rosa gallica의 꽃잎 추출

이전에 RPE는 수성 70%(v/v) EtOH 추출을 통해 생산되었습니다(Lee et al., 2018). 그러나 RPE가 산업적 응용을 목적으로 하는 경우 추출 조건이 최적이어야 합니다. 항피부노화 활성을 위한 RPE의 최적 추출 조건을 알아보기 위해 RPE에 다양한 용매를 사용하였다(Fig. 1A). 흥미롭게도 육안 관찰에 따라 각 추출물의 색상이 다양했습니다(그림 1B). 90% 이상의 EtOH 추출물의 색은 맑았고, 50%(v/v) EtOH 추출물은 가장 붉은 색을 띠는 것으로 나타났다. 색도계 분석 결과 50% EtOH의 redness는 a*값을 나타내어 추출물 중 가장 높은 수치를 보였다(Fig. 1C).

장미 꽃잎 추출물이 피부 미백 활성에 미치는 영향

티로시나아제는 멜라닌 생성을 통한 과색소침착에 관여하는 주요 효소이기 때문에(Chang, 2009), 우리는 체외에서 추출물의 티로시나아제 활성에 대한 억제 효과를 분석했습니다. 100% EtOH를 제외한 대부분의 추출물은 시험관 내 티로시나제 활성에 대한 용량 의존적 회귀를 나타냈습니다(그림 2A). 또한 30%와 50% EtOH 추출물은 ascorbic acid보다 더 강한 억제 효과를 보였다. 아스코르빈산은 이전 문헌에서 피부 미백제로 기술되었다(Chang, 2009). 세포 모델에서 추출물의 피부 미백 활성을 평가하기 위해 각 추출물을 처리한 B16F10 흑색종 세포에서 멜라닌 생성을 평가했습니다. a-MSH의 100 nM 부분은 멜라닌 생성을 증가시켰고 장미 꽃잎의 모든 추출물은 멜라닌 생성을 억제했습니다(그림 2B). 또한, 30% 및 50% EtOH 추출물은 시험관 내에서 각각 티로시나제 활성 및 멜라닌 생성에 대해 가장 강력한 억제 효과를 나타냈다. 유사한 조건에서 각각의 추출물이 티로시나제 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, α-MSH는 티로시나아제 발현을 증가시켰고, 100 ㎍/mL의 각 추출물은 티로시나아제 발현을 약화시켰다(도 2C). 100 ㎍/mL의 추출물을 사용한 처리는 B16F10 흑색종 세포에서 세포 독성을 일으키지 않았습니다(그림 2D). 따라서, RPE에 의한 멜라닌의 억제는 티로시나제 활성의 이중 기능과 세포독성의 부재에 기인한다.

인간 진피섬유아세포에서 태양자외선(sUV) 유도 MMP-1 발현에 대한 RPE의 영향

MMP-1의 억제제는 주름 방지제로 간주될 수 있습니다(Park et al., 2018; Yang et al., 2018). 이는 MMP-1가 피부 노화 과정에서 주름 형성을 담당하는 핵심 효소이기 때문입니다(Pittayapruek et al., 2016). RPE의 주름 개선 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1 발현을 평가했습니다. MMP-1 발현은 sUV 조사(30 kJ/cm2 )에 의해 극적으로 증가하였고, 모든 추출물은 sUV에 의한 MMP-1 발현을 억제하였다(도 3A). 100% EtOH 추출물은 약한 효과를 보인 반면, 50% EtOH 추출물은 sUV 유도 MMP-1 발현에 대해 가장 강력한 억제 활성을 나타냈습니다. 다음으로 MMP-1는 콜라겐 분해를 위한 분비 단백질이기 때문에 배양 배지에서 MMP-1 생산 수준을 조사했습니다. 도 3A에 나타낸 것과 유사하게, 배양 배지에서의 MMP-1 수준은 각각의 추출물에 의해 억제되었다(도 3B). 특히, 50% EtOH 추출물은 sUV에 의한 MMP-1 발현 억제 활성이 가장 높았고, 100% EtOH 추출물은 다른 추출물에 비해 약한 효과를 보였다.

장미 꽃잎 추출물의 항산화 활성 및 총 플라보노이드 함량

ROS 생성을 억제하는 항산화제는 과색소침착을 감소시키거나 UV-유도 멜라닌 생성을 방지하는 것으로 알려져 있다(Yamakoshi et al., 2003). 추출물의 항산화 활성을 비교하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 흥미롭게도, 모든 추출물은 과감하고, 용량 의존적이며, 라디칼 소거 활동을 보여주었습니다. 500 lg/mL 시료는 비타민 C와 유사한 항산화 활성을 보였다. 추출물 중 50% EtOH 추출물은 가장 낮은 농도(50 lg/mL)에서 가장 강력한 항산화 활성을 보였다(Fig. 4A).

장미 꽃잎에는 테르펜, 플라보노이드 및 안토시아닌과 같은 다양한 화합물이 있습니다(Knapp et al., 1998; Kumar et al., 2008; Oka et al., 1998; Schieber et al., 2005). 이러한 화학 물질은 많은 생물학적 활동을 나타냅니다(Kumar et al., 2009). 특히, 플라보노이드는 항산화 및 항염 효과의 생물학적 특성을 담당하는 페놀 화합물의 주요 그룹으로 기술되었습니다(Du et al., 2016; Jung et al., 2015). 다음으로 각 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 많은 양의 플라보노이드가 각 추출물에 존재했습니다(그림 4B). 결과는 50% EtOH 추출물이 샘플 중에서 가장 높은 플라보노이드 함량을 함유하고 있음을 나타냅니다. 이러한 경향은 항산화 분석 결과에서 관찰된 것과 유사하였다.

장미 꽃잎의 50% EtOH 용매의 암적색은 플라보노이드인 안토시아닌과 관련이 있는 것으로 추정됩니다(그림 1). 이 결과는 이전 연구 결과를 입증합니다(Oancea et al., 2012). 이전 연구에 따르면 블루베리(Vaccinium orymbosum L.)의 안토시아닌은 60%, 70% 및 80% EtOH를 포함한 다른 용매보다 50% EtOH 용매에서 가장 잘 추출되었습니다(Oancea et al., 2012). 당연히 안토시아닌은 배당체로 발생합니다. 따라서 우리는 안토시아닌의 극성이 50% EtOH 용매에 의해 일치되었을 수 있다고 추측했습니다. 안토시아닌의 강력한 항산화 활성은 다양한 모델 시스템에서 잘 입증되었습니다(Kalt et al., 2003; RiceEvans et al., 1995). 50% EtOH 장미 꽃잎 추출물이 안토시아닌 함량이 가장 높았기 때문에 50% EtOH 추출물의 항산화 활성이 50 lg/mL 추출물 중에서 가장 강했다.

요약하면, 우리의 연구는 RPE의 피부 노화 방지 성분으로서의 잠재력을 입증했습니다. 산업적 응용을 위해서는 생산 비용을 줄이기 위해 추출 조건의 최적화가 필수적입니다. 본 연구에서는 장미 꽃잎 추출에 가장 적합한 용매를 피부 노화 방지 활성과 관련하여 조사하였다. 장미 꽃잎의 플라보노이드는 50% EtOH 용매에서 가장 잘 추출되었습니다. 이 추출물은 가장 강력한 항산화 활성은 물론 피부 미백, 주름 억제 활성 등의 항피부노화 활성을 보였다. 산업 적용에 대한 적합성을 테스트하기 위해 임상 연구 및 안정성 분석이 필요할 수 있습니다.

감사의 말본 연구는 미래창조과학부와 한국농업식품기술기획평가원의 지원으로 한국식품연구원(KFRI) 본연구사업(E0183112-02)의 지원을 받아 수행되었습니다. , 농림축산식품부(MAFRA)(118060-03-2- HD020)에서 자금을 지원하는 고부가가치 식품 기술 개발 프로그램을 통해 임업 및 수산업(IPET).

윤리기준 준수

참조

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