석류(Punica Granatum L.) 잎의 파보노이드 및 피토옥시리핀 반응 1부
Mar 26, 2022
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추상적인:식물에서 생성된 메틸 자스모네이트(MeJA)는 환경 스트레스에 대한 반응을 중재할 수 있습니다. MeJA의 외인성 적용은 또한 많은 식물 종에서 신호 전달 경로를 활성화하고 파이토알렉신 축적을 유도하는 것으로 나타났습니다. 석류 식물이 환경 스트레스에 어떻게 생화학적으로 반응하는지 이해하기 위해 MeJA를 적용한 석류 잎에서 대사 산물 분석을 수행했으며 가수분해성 탄닌, 플라보노이드 및 Phyto-oxylipins의 독특한 변화를 밝혀냈습니다. 또한, 모의 처리 및 MeJA 처리 석류 잎의 전사체 및 실시간 qPCR 분석을 통해 차동적으로 발현된 대사 유전자와 전사 인자가 확인되었습니다.가수분해성탄닌, 플라보노이드 및 Phyto-oxylipin 경로. 분자, 생화학적, 생물정보학적 특성 규명리폭시게나제지속적인 MeJA 유도 발현은 비-자스모네이트(비-JA) Phyto-oxylipins가 생성된 세포내 구획에 위치하지는 않지만 다중불포화 지방산을 산화시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 플라보노이드와 안토시아닌의 광범위한 억제가 전사 수준에서 적어도 부분적으로 제어되는 반면 non-JA의 유도된 생합성을 종합적으로 시사한다.피토옥시리핀전사적으로 조절되지 않을 가능성이 높습니다. 전반적으로 석류 잎이 환경 스트레스에 어떻게 반응하는지 더 잘 이해하면 식물 건강과 생산성이 향상될 뿐만 아니라 석류 식물에서 생산되는 과일은 영양 성분이 풍부하기 때문에 인간의 건강에도 영향을 미칩니다.
키워드:메틸자스모네이트.플라보노이드·안토시아닌 · 지방산.피토옥시리핀·리폭시게나제
소개
식물은 상처를 입거나 초식동물과 병원체의 공격을 받으면 methyl jasmonate(MeJA)를 생성하고 방출하며, 이는 상처를 입지 않은 식물 조직과 주변 식물이 감지하여 방어 반응을 활성화합니다(Cheong and Choi 2003). 또한, 식물에 대한 MeJA의 외인성 적용은 신호 전달 경로뿐만 아니라 파이토알렉신으로 알려진 병인 관련 단백질 및 방어 화학 물질의 생산을 유도하는 것으로 나타났습니다. 플라보노이드 및 안토시아닌과 같은 페놀성 파이토알렉신은 애기장대, 포도(Vitis vinifera), 바나나(Musa acuminate), 사과(Malus Domestica), 붉은 라즈베리(Rubus idaeus)와 같은 다양한 식물에서 MeJA 처리에 대한 반응으로 축적 증가를 나타냈습니다. )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res and Ruiz del Castillo 2014). 플라보노이드와 안토시아닌의 생합성은 chalcone synthase(CHS)에 의해 촉매되는 coumaroyl CoA와 3분자의 malonyl CoA로부터 naringenin chalcone이 형성되고 chalcone isomerase(CHI)에 의해 naringenin chalcone이 naringenin으로 이성질화되는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 Naringenin은 코어 플라보노이드 및 안토시아닌 골격을 생성하는 데 사용되며, 이는 글리코실, 메틸, 히드록실 및 프레닐 작용기로 추가 변형되어 다양한 구조와 기능을 발생시킵니다(Tian et al. 2008).
Cistanche는 면역력을 향상시킬 수 있습니다
In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75% 유사성) 및 신호 펩타이드를 포함하지 않는 반면 유형 II LOX는 전반적으로 낮은 서열 유사성(<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">
석류(Punica granatum L.)는 플라보노이드, 안토시아닌, 가수분해성 탄닌(HT)과 같은 과일의 풍부한 페놀 화합물로 인해 가치가 높은 특수 원예 작물로 시키메이트 경로의 중간체에서 파생됩니다(Ono et al.2016). ). 지금까지 많은 연구에서 인간의 스트레스와 질병을 완화시키는 석류 페놀의 역할에 초점을 맞추었습니다(Wu and Tian 2017). 대조적으로, 비생물적 및 생물학적 요인으로부터 석류를 방어하는 페놀 및 기타 식물화학물질의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다(예: 상처, 병원체, MeJA 유도) 잎과 과일. 두 개의 최근 보고서에서 석류 열매의 수확 후 품질에 대한 수확 전 MeJA 처리를 평가했습니다(Koushesh Saba and Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). MeJA 처리 과일의 총 안토시아닌, 플라보노이드 및 페놀은 분광 광도계를 사용하여 집합적으로 분석되었습니다. 연구 중 하나는 질량 분석기를 사용하여 개별 안토시아닌을 분석하기도 했습니다(Garcia-Pastor et al.2020). 그러나 석류 식물 조직이 잎이든 과일이든 과일이 맺히기 전에 환경적 스트레스에 어떻게 반응하는지 불분명합니다.
석류 식물과 환경 요인 간의 상호 작용을 해부하기 시작하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화 탠덤 질량 분석법(LC-ESI-MS/MS)을 사용하여 외인성 MeJA 응용 프로그램에 대한 석류 잎의 대사 반응을 조사했습니다. . MeJA로 처리한 석류 잎에서 HT, 플라보노이드 및 안토시아닌의 독특한 변화와 지질, 지방산 및 Phyto-oxylipins의 변화가 관찰되었습니다. 실시간 qPCR 분석에 의해 검증된 비교 전사체 분석은 HT, 플라보노이드, 안토시아닌 및 Phyto-oxylipin 대사에 관여하는 구조 및/또는 조절 유전자가 모의 및 MeJA 처리 석류 잎에서 차등적으로 발현되는 것으로 나타났습니다. MeJA 처리된 잎에서 지속적으로 상향 조절된 발현을 나타내는 유일한 LOX 유전자는 분자, 생화학적 및 계통 발생학적 특성을 추가로 분석했습니다.
재료 및 방법
-글루코갈린 및 펜타갈로일 글루코스 표준품은 Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd(Shanghai, China)에서 구입했습니다. LOX 분석에 사용된 화학물질은 3-(디메틸아미노)벤조산(DMAB)(Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, China), 리놀레산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),3-메틸-2-벤조티아졸리논(MBTH) 및 헤모글로빈(Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China).
식물 재료 석류 열매와 씨앗(cv. Wonderful)은 Panzhihua 농업 및 산림 과학 아카데미에서 아낌없이 제공했으며 Shanghai Chenshan 식물원의 Binjie Ge 박사가 확인했습니다. 바우처 표본(No. CSHO173966)은 중국 상하이 상하이 천산 식물원 식물 표본관에 기탁되었다. 석류 묘목을 25도 및 16시간 명암/8시간 동안 온도 조절된 생육실에서 6주 동안 재배했습니다. 식물 조직에 스프레이를 적용하기 위한 MeJA 농도는 보고된 바에 따르면 100~250μM 범위입니다(Ku et al.2014; Hickman et al.2017). 다양한 농도의 MeJA가 처음에 석류 잎에 적용되었으며, 그 중 200μM MeJA는 예비 분석에서 식별 가능한 대사 반응을 일으켰고 이 연구에 설명된 대사 산물 및 유전자 발현 분석에 사용되었습니다. MeJA 처리 전에 석류 식물의 절반을 유사한 조건의 다른 성장실로 옮겼습니다. 한 성장실의 식물에 200μM MeJA를 분무한 반면, 다른 성장실의 식물에는 물을 분무했습니다(즉, 모의 대조군). 2-h,{13}}h,{14}} h,{15}}h,{16}}h, 30-h,{18}}h,{19}}h,{20}}처리 후 3에서 출발 5개의 모의 또는 MeJA 처리 식물을 풀링하여 하나의 생물학적 복제를 구성합니다. 모의 및 MeJA 처리 실험을 위해 3개의 생물학적 복제물을 수집했습니다. 각각의 생물학적 복제물은 대사 산물 프로파일링 및 유전자 발현 분석을 위해 분취량으로 분할되었습니다.
대사산물 프로파일링 분석
석류 잎을 동결건조하고 무게를 재고 90년대 30Hz에서 비드 비터(Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Germany)에서 지르코니아 비드를 사용하여 미세 분말로 분쇄했습니다. HPLC 분석을 위해 잎 샘플을 70% 메탄올에서 60분 동안 초음파 처리하여 추출하고 13,{6}} rpm에서 10분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 HPLC 바이알에 옮기고, 그 중 30μL를 역상 HPLC(Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에 주입하고 앞서 설명한 바와 같이 분석하였다(Wil-son et al.2019). 대사 산물은 254 nm, 280 nm, 320 nm 및 360 nm에서 UV 흡수에 의해 검출되었습니다. α-글루코갈린 및 펜타갈로일 글루코스의 표준 검량선을 작성했습니다. 이들은 α-글루코갈린 및 펜타갈로일 글루코스의 체류 시간 및 흡수 스펙트럼과 일치하는 피크 영역을 각각의 농도로 전환하는 데 사용되었습니다.
For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1은(는) 크게 변경된 것으로 간주됩니다.
전사체 분석
총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 석류 잎에서 추출하고 Nanodrop2000(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 정량화했습니다. RNA 샘플의 무결성은 Nanodrop2000을 사용하여 아가로스 겔(눈에 보이는 분해 없음)과 OD20/28o 비율(1.8과 2.2 사이)에서 분리를 통해 확인되었습니다. 전체 RNA로부터 mRNA의 농축은 올리고(dT) 자기 비드(Invitrogen)를 사용하여 수행했습니다.mRNA-Seq 라이브러리는 Truseq RNA 라이브러리 준비 키트(Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 구성했습니다. Illumina HiSeq4000에서 전사체 분석을 수행했으며 각 샘플 라이브러리에 대해 55-60백만 개의 {{11}bp paired-end read(PE150)를 얻었습니다. 원시 시퀀스 데이터는 어댑터 시퀀스와 short(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, 조정된 P 값<>
실시간 qPCR 분석
RNAprep Pure Plant Kit(Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, China)를 사용하여 모의 및 MeJA 처리 석류 잎에서 총 RNA를 추출했습니다. 역전사(RT)는 total RNA와 PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan)를 사용하여 수행했습니다. 정량적 PCR(qPCR)은 TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus)kit( Takara) 및 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Ther-moFisher Scientific). 용융 곡선 분석이 수행되었으며 각 프라이머 쌍에 대한 단일 증폭 산물이 나타났습니다. RT-qPCR 분석을 위해 모의 및 MeJA 처리 샘플에 대해 3개의 생물학적 복제물과 각각 3개의 기술적 복제물이 있는 복제물을 검사했습니다. 유전자 발현은 비교 C,(△AC) 방법(Livak and Schmittgen 2001)을 사용하여 분석하고 유의 수준은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정했습니다. Real-Time qPCR 분석을 위한 프라이머 서열과 프라이머 쌍의 증폭 효율은 표 S1에 나와 있습니다.
재조합 단백질 및 효소 분석의 발현 및 정제
E. coli(Genewiz, Suzhou, China)에서 최적의 코돈 사용을 위해 Pgr{12}}25417의 오픈 리딩 프레임을 합성하고 pET28a에 클로닝했습니다. 재조합 플라스미드는 E. coli BL21로 형질전환되었습니다. (DE3) 세포. 5{16}}ug mL-Ikanamycin이 포함된 5-mL Luria Bertani(LB) 배양을 단일 콜로니에서 시작하고 37C에서 진탕하면서 밤새 인큐베이션했습니다. 밤새 배양을 사용하여 100-mL LB 배지에 50ug mL-'카나마이신을 접종하고 OD600이 0.5가 되도록 성장시켰다. 그런 다음 단백질 발현 유도를 위해 이소프로필{14}}D-티오갈락토사이드(IPTG)를 0.1mM의 최종 농도로 첨가했습니다. 16도에서 18시간 동안 진탕하면서 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 펠렛을 용해 완충액(50mM NaH, PO, pH 7.4,300mM NaCl, 10mM 이미다졸)에 재현탁하고 세포 파괴제(Constant Systems Ltd, Northants, UK)를 사용하여 균질화했습니다. 세척 완충액(50mM NaH,PO, pH 7.4,300mM NaCl, 25mM 이미다졸) 및 용리 완충액(50mM NaH,PO, pH 7.4,300mM NaCl, 500mM)이 포함된 Ni-NTA 비드(ThermoFisher Scientific) 이미다졸). 정제된 단백질은 단백질 순도를 시각화하기 위해 10% SDS-PAGE 겔에서 분리되었습니다. 정제된 단백질의 농도는 Bradford 분석법(Bradford 1976)을 사용하여 결정되었습니다.
LOX 분석의 경우 리놀레산을 약간 수정한 2단계 비색법에서 기질로 사용했습니다(Anthon and Barrett 2008). 500-μL 반응 혼합물, 5{17}}mM Na-phosphate, pH 6, 1{43}}mM DMAB, 0.5mM 리놀레산 및 다양한 양의 정제된 재조합 단백질(1.5mg mL -), 10분 동안 25도에서 인큐베이션하였다. 0.2mM MBTH 및 0.1mg mL-'헤모글로빈을 함유하는 두 번째 용액(500μL)을 반응 혼합물에 첨가하고, 추가 5분 동안 인큐베이션하였다. 500μL 1%(w/v) 소듐 라우릴 설페이트를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 598 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 내 위치 및 계통 발생 분석 주석이 달린 석류 게놈 검색(Qin et al. 2017)은 Pgr025413,Pgr020032,Pgr05418,Pgrful,Pgr025418,Pgrful,Pgr025418,Pgr08을 포함하여 1l 추정 전장 LOX(786 aa ~ 970 aa)를 확인했습니다. -GenBank XP의 길이 시퀀스_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 및 PgrO13780. 석류 LOX에 대한 신호 펩티드의 세포 내 위치 및 절단 부위는 TargetP 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)(Almagro Armenteros et al.2019)을 사용하여 예측되었습니다.
TF 결합 부위 분석
TF의 결합 부위를 예측하기 위해 GenBank에서 표적 유전자의 ATG 시작 코돈 상류 1000 bp를 획득하고 PlantRegMap(버전 5)(Tian et al.2020)에서 Eucalyptus Grandis TF에 대해 검색했습니다. 결합 임계값 사이트 식별이 P le-4보다 작거나 같음으로 설정되었습니다. 대사 산물 정량화, 전사체 및 실시간 qPCR 데이터에 대한 통계 분석은 각 섹션에 설명되어 있습니다.
결과
MeJA는 석류 잎의 세포 신호 및 대사 경로를 조절합니다
MeJA 유도에 대한 석류의 게놈 전체 전사 반응을 이해하기 위해 석류의 전사체는 MeJA 후 2-h,6-h,24-h 및 72-h에 남습니다. 모의 치료(각각 3개의 생물학적 복제가 있음)가 분석되었습니다(그림 S1). 약 5,500만 개의 원시 시퀀스 읽기(2 x 150 bp paired-end)가 약 52%의 GC 함량과 91.6~95% 범위의 Q30 값을 갖는 각 전사체에 대해 획득되었습니다(표 S2). 모든 전사체의 경우, 정제된 서열 판독의 96% 이상이 참조 석류 게놈에 매핑되었습니다(Qin et al.2017)(표 S3). 조립된 전사체의 대부분은 1000bp(34.3%),1000bp 미만이었습니다. 2000bp(32.9%) 또는 2000bp-3000bp(18.1%)(표 S4).
To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, 조정된 P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">
shikimate 및 HT 생합성 유전자 전사체의 양 변화가 이러한 경로에서 파생된 대사 산물의 수준에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위해 24-h, 30-h에 수확한 잎에서 페놀 대사 산물을 추출했습니다. MeJA 또는 모의 적용 후 36-h,48-h 및 72-h 및 HPLC로 분석되었습니다(그림 2). 이러한 시점은 6-h에서 shikimate 및 HT 생합성 유전자의 관찰된 발현 변화 후 단백질 합성 및 대사산물 생성 및 축적에 필요한 시간을 설명하기 위해 선택되었다는 점에 유의해야 합니다. 4.57분(피크 1) 및 24.98분(피크 2)에서 용출된 두 대사 산물의 체류 시간 및 흡수 스펙트럼은 각각 HT 경로 중간체 -글루코갈린 및 펜타 합금-글루코오스의 체류 시간 및 흡수 스펙트럼과 일치했습니다(도 1a 및 2a). 두 피크 모두 여러 시점에서 통합된 피크 면적에서 상당한 변화를 보였습니다(그림 2b). 특히, 피크 1은 30-h, 36-h 및 48-h에서 모의 대조군에 비해 MeJA 처리된 잎에서 증가했습니다(그림 2b). 흥미롭게도 MeJA 처리된 잎의 피크 2는 처음에는 24-h에서 감소했지만 이후 30-h 및 36-h에서 증가하여 48-에서 모의 대조군과 유사한 수준으로 돌아갔습니다. h 및 72-h(그림 2b). MeJA 처리 석류 잎에서 대부분의 플라보노이드와 안토시아닌이 감소하고 메틸화 플라본과 플라보놀이 증가했습니다.
To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; 표 S5 및 S6). 차등적으로 축적된 대사 산물의 경우 식물 2차/특수 대사에 관여하는 대사 산물(102개 중 67개), 특히 페놀 화합물(102개 중 63개)이 전반적으로 풍부했습니다(표 S6).
페놀류 중에서 MeJA 처리된 잎에서 광범위한 플라보노이드와 안토시아닌(73개의 감소된 화합물 중 42개)의 공동 감소가 분명했습니다(그림 3, 표 S6). 흥미롭게도, 디-O-메틸 케르세틴, 크리소베릴 O-헥소실-O-헥소시드 및 판매 5-O-헥소시드를 포함한 3개의 모노 또는 디-O-메틸화 플라본 및 플라보놀이 MeJA 처리 잎에서 증가했습니다. (그림 3, 표 S6). 루테올린, 크리소베릴, 디히드로캠페롤, 디히드로퀘르세틴, 디히드로미리세틴, 에피카테킨, 델피니딘 및 펠라르고니딘을 포함한 플라보노이드 및 안토시아닌 경로의 여러 중간체가 검출되었지만 MeJA 처리된 잎에서는 유의한 변화를 나타내지 않았습니다(그림 3, 표 S5). 하이드록시신-나모일 유도체, 이소플라본 및 쿠마린은 MeJA 유도 시 감소된 축적을 나타내는 다른 페놀 화합물 중 하나였습니다(표 S6). 대조적으로 MeJA 처리 잎에서는 2개의 페놀산인 2,{24}}디하이드록시벤조산과 프로토카테추산(3,{26}}디하이드록시벤조산)과 쿠마린인 6-메틸 쿠마린이 증가했습니다. (표 S6).
MeJA 처리 석류 잎에서 크게 감소된 플라보노이드 및 안토시아닌과 일치하며, 플라보노이드 및 안토시아닌 생합성을 위한 두 가지 핵심 효소의 전사체입니다. CHS(Pgr005566) 및 CHI(Pgr025966)는 전사체 분석에 따라 MeJA 적용 후 6-h 및 24-h에서 유의하게 감소했습니다(그림 4). 실시간 qPCR 분석을 수행하여 2-h, 3-h, 6-h,{10}}h,{{ 11}}h,{12}}h 및 72-h(그림 4).CHS 전사는 3-h에 MeJA 처리된 잎에서 떨어졌고 모의에서보다 현저히 낮은 상태를 유지했습니다. 72-h까지 제어하고 12-h에서 가장 크게 감소합니다. 대조적으로, CHI 발현의 감소는 MeJA 처리 후 24-h, 48-h 및 72-h에서만 유의미했습니다(그림 4).
이 문서는 Planta(2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9에서 발췌했습니다.