만성 신장 질환 환자에서 오스테오폰틴의 유전학: 독일 만성 신장 질환 연구 IV

기준 변수 및 측정

표준화된 바이오마커 세트는 표준화된 프로토콜을 사용하여 중앙 인증 실험실에서 측정되었습니다[81]. 그 중에서도 혈청과 소변의 크레아티닌과 알부민은 각각 IDMS 추적 방법(Creatinine plus, Roche, Germany)과 탁도법(Tina-Quant, Roche, Germany) Roche/Hitachi MODULAR P를 사용하여 정량화되었습니다. 사구체여과율(GFR)은 물라에 대한 크레아티닌 기반 CKD-EPI를 사용하여 추정되었습니다(단위: mL/min/1.73m2, [82]). UACR은 측정된 요중 알부민/요중 크레아티닌(mg/g, [83])으로 계산되었습니다. 나이와 성별은 기본 방문 시 자가 보고되었습니다. 2015년에 OPN은 R&D Systems(R&D Systems Europe, Abingdon, UK)의 정량적 샌드위치 효소 면역분석 기술(고체상 ELISA; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST{12}}을 사용하여 전체 GCKD 연구 코호트의 기준 혈청 샘플에서 측정되었습니다. )). 정량화는 독일 그라이프스발트의 임상 화학 및 실험실 의학 연구소에서 수행되었습니다. 변동 계수(분석 내)는 낮은 수준, 중간 수준, 높은 수준에 대해 각각 4.5%, 5.3% 및 3.5%였습니다. 분석 간 변동 계수는 6.4%였습니다. 시약과 2차 표준물질은 제조업체가 권장하는 대로 사용되었습니다.

신장 건강을 위한 유기농 전통 허브

유전형 분석, 품질 관리 및 대치

GCKD 연구의 유전형 분석 및 데이터 정리에 대한 자세한 정보는 이전에 설명되었습니다[18]. 간략하게 말하면, 뮌헨 헬름홀츠 센터에서 Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip 어레이(Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module Version 1.9.4)를 사용하여 5,123명의 GCKD 참가자에 대해 2,612,357개의 변이체에서 DNA를 분리하고 유전자형을 분석했습니다. Omni2.5 콘텐츠와 어레이의 엑솜 칩 콘텐츠에 대해 별도로 데이터 정리가 수행되었습니다. 표준화된 프로토콜[84]을 기반으로 맞춤형 스크립트(R, Perl)와 Plink1.9[85] 소프트웨어를 Omni2.5 콘텐츠의 품질 관리(QC)에 사용했습니다. 샘플 기반 QC 단계에는 호출률, 성별, 이형접합성, 유전적 조상 및 관련성에 대한 검사가 포함되어 89개 샘플이 제외되었습니다. 변형 수준에서 호출 속도가 다음과 같은 경우 단일 염기 다형성(SNP)이 제외되었습니다.<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

공통 변종에 대한 게놈 차원의 연관 연구

이전에 보고된 바와 같이 [17,18], log2의 선형 회귀를 사용하여 완전한 유전자형 분석(Omni2.5), eGFR, UACR 및 log2(OPN) 측정(N= 4,897) 데이터를 사용하여 GCKD 참가자를 대상으로 GWAS를 수행했습니다. 연령, 성별, log(eGFR) 및 log(UACR)에 대해 조정된 MAF �1%의 SNP(추가 유전 모델)에 대한 (OPN)(S1 그림). 연관성 분석은 SNPTEST v2.5[89]를 사용하여 수행되었습니다. 품질에 대해서는 GWAtoolbox[90]를 사용하고 인플레이션에 대해서는 게놈 제어[91]를 사용하여 요약 통계를 확인했습니다. 그러나 게놈 대조 수정은 요청되지 않았습니다(λ=1.01). p-값과의 연관성<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

변종의 기능적 주석은 ANNOVAR[92], SNiPA[93], Open Targets Genetics[94], FAVOR[95] 및 RegulomeDB[96]를 사용하여 수행되었습니다. 지역 연관성 도표는 LocusZoom v1.3[97]을 사용하여 그려졌습니다.

미세 매핑

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

공동 지역화 분석

연관성의 근간을 이루는 분자 메커니즘 및 관련 표현형을 더 자세히 이해하기 위해 우리는 아래에 설명된 대로 세 가지 다른 소스의 GWAS 요약 통계를 사용하여 두 개의 복제된 OPN 유전자좌와 관련된 OPN GWAS 요약 통계의 공동 위치 분석을 수행했습니다. 모든 공동 지역화 분석을 위해 기본 매개 변수 및 이전 정의(https://github.com/tobyjohnson/gtx)와 함께 R 패키지 gtx의 'coloc.fast' 기능을 사용했습니다. 이는 도입된 공동 지역화 방법의 적응된 버전을 구현한 것입니다. Giambartolomei 외. [98]. 두 특성(H4, p12)에 대한 연관 궤적에서 공유된 인과 변형의 사후 확률이 > 0.8인 경우 긍정적인 동일 위치화를 고려합니다.

유전자 발현.

먼저, GTEx 프로젝트[99]와 NEPTUNE 연구[100]의 유전자 발현 데이터에 대한 GWAS 요약 통계를 사용했습니다. GTEx V8(49개 조직) 및 NEPTUNE 연구(사구체 및 세뇨관간질 신장 부분의 NephQTL)의 eQTL 데이터는 GTEx 포털(https://www.gtexportal.org/home/) 및 NephQTL 웹사이트(http://www.gtexportal.org/home/)에서 다운로드되었습니다. //nephqtl.org/), 각각. Colocalization의 분석 단계는 다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다 [17]. 첫째, 두 개의 OPN SNP 중 ±100kb의 게놈 영역에서 GTEx 및 NephQTL의 GWAS 요약이 추출되었습니다. 추출된 GWAS의 유전자가 식별되고 각 유전자에 대해 유전자의 시작과 끝 측면에 있는 500kb의 시스 윈도우가 정의됩니다. 그런 다음, 연관 p-값이 < 0.001인 SNP가 하나 이상 있는 모든 cis 유전자 창에 대해 GTEx 및 NephQTL 조직의 GWAS 요약과 OPN GWAS를 추출하여 공동 국소화 분석을 위한 입력으로 사용했습니다.