혈청 아밀로이드 P 침착은 차폐된 IgG 카파 침착을 갖는 막성 사구체병증의 민감하고 특이적인 특징입니다
Mar 04, 2022
Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2, John M. Arthur2
키워드:사구체신염; 마스킹된 예금; 질량 분석; 막성 사구체병증; 상피하 침전물
차폐된 IgG 카파 침착을 갖는 막형 사구체병증(MGMID)은 독특한 조직병리학을 갖는 최근에 기술된 사구체신염 패턴입니다. 패턴은 상피하 및/또는 중간막이 특징입니다.면역성 있는"마스킹된" 침전물은 일상적인 면역형광에 의한 면역글로불린 염색이지만 프로테아제 소화 후 IgG 및 카파 경쇄에 대해 강하게 염색됩니다. 이러한 패턴의 사구체신염이 있는 환자는 단백뇨 및 저역가 항핵항체와 같은 자가면역 질환의 모호한 병력을 나타내는 가장 일반적으로 젊은 여성입니다. 여기에서 우리는 9개의 MGMID 신장 생검에서 레이저 캡처 미세 해부된 사구체의 질량 분석 프로파일을 막성 사구체 병증의 다른 패턴을 보여주는 8개의 생검과 비교했습니다. MGMID에서 가장 유의하게 증가된 단백질은 혈청 아밀로이드 P였다. 면역염색은 MGMID의 사구체에서 IgG와 함께 국소화된 혈청 아밀로이드 P를 나타내었지만 PLA2R 관련 막성 사구체병증과는 그렇지 않았다. 혈청 아밀로이드 P는 32개의 모든 MGMID 생검의 사구체에서 양성이었지만 PLA2R 및 THSD7A와 관련된 것과 같은 다른 유형의 막성 사구체 병증의 생검에서는 음성이었습니다. MGMID 또는 아밀로이드증의 기준을 충족하지 못한 173개의 생검 중 사구체 혈청 아밀로이드 P 염색이 있는 4개의 생검이 있었습니다. 혈청 아밀로이드 P 염색이 양성인 이 4가지 생검은 모두 "마스킹"이 없다는 점에서 MGMID와 다른 IgG 카파 침착물이 있는 사구체병증의 막 패턴을 보였습니다. 따라서, 혈청 아밀로이드에 대한 사구체 침착물 내 양성 염색은 질병의 일반적인 병태생리학적 기전을 공유할 가능성이 있는 독특한 형태의 사구체신염을 식별합니다.
차폐된 IgG 카파 침착물이 있는 막형 사구체병증(MGMID)은 2014년에 기술된 사구체신염의 조직병리학적 패턴으로, 이는 차폐된 사구체 침착물이라고 불리는 것에 대한 첫 번째 설명이었습니다.1 이 질병의 특징적인 조직병리학에는 메산지얼 및 상피하 IgG 카파 제한이 있는 예금. 흥미롭게도, 보체 성분 3(C3) 염색은 냉동 조직에 대한 일상적인 면역형광에 의해 종종 분명하지만 Ig 염색은 종종 마스킹됩니다. 즉, 이는 일상적인 면역형광에 의한 위음성 염색을 나타내지만 프로테아제 소화 후 파라핀 포매 조직에서 반복될 때 양성 염색을 나타냅니다. 따라서 병리학자가 이 개체에 대해 높은 의심 지수를 유지하지 않는 한 C3 사구체병증으로 오진될 수 있습니다. 사구체 침전물에서 이러한 차폐 현상을 나타내는 것으로 설명된 다른 개체에는 차폐된 단일형 Ig 침전물이 있는 막증식성 사구체신염과 한랭글로불린혈증성 사구체신염이 있습니다.2,3
생검에서 MGMID가 발견된 환자는 가장 일반적으로 젊은 여성입니다.<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95%)는 혈청 단백질 전기영동에서 단클론성 Ig에 대해 음성이었고 기저 혈액 악성 종양과 관련된 사례는 관찰되지 않았습니다.4
MGMID 환자들 사이에서 공유되는 임상병리학적 소견이 그들의 질병을 유발하는 공통 분자 병리생리학적 기전을 나타낼 수 있다는 가설이 세워졌습니다. 이 개체를 처음 보고할 때 의도는 추가 분석을 위해 코호트를 정의하는 것이었습니다.1 여기서 우리는 MGMID 사구체의 퇴적물에서 고유하게 발견되는 단백질 혈청 아밀로이드 p 성분(SAP)의 존재를 설명합니다. 사구체 침전물에서 SAP에 대한 면역염색은 MGMID 진단을 위한 민감하고 구체적인 기술이며 병원성 통찰력도 제공합니다.
그림 1|혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)은 차폐된 IgG 카파 침착이 있는 막형 사구체병증 환자의 미세 해부된 사구체에 상당히 풍부합니다. MaxQuant(Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Germany)의 정규화된 강도 기반 절대 정량화 값을 통계 분석에 사용했습니다. 점선은 폴드 변경 및 P-값에 대한 휴리스틱 컷오프를 나타냅니다. (a) 3개의 포스포리파제 A2 수용체(PLA2R)-양성 막 케이스를 다른 케이스와 비교하는 화산 플롯은 오른쪽 상단 사분면에서 명백한 이상값인 2개의 단백질을 식별합니다. (b) 2개의 트롬보스폰딘 유형 1 도메인-함유 7A(THSD7A)-양성 막 사례를 다른 사례와 비교하는 화산 플롯은 가장 큰 배수 변화를 나타내는 THSD7A와 함께 명백한 이상치인 2개의 단백질을 식별합니다. (c) 차폐된 IgG 카파 침전물이 있는 막형 사구체병증 샘플을 다른 모든 유형의 막성 케이스와 비교하는 화산 플롯은 오른쪽 상단 사분면에서 명확한 이상값인 6개의 단백질을 식별합니다. C6, 보체 성분 6; C7, 보체 성분 7; CFHR1, 보체 인자-H-관련 단백질 1; HP1BP3, 이질염색질 단백질 1 결합 단백질 3; HPRT1, 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1; IGHG3, Ig 무거운 상수 감마 3.
결과
레이저 캡처 미세 해부 사구체의 질량 분석
MGMID 9예에서 미세해부된 사구체의 질량분석법을 phospholipase A2 수용체(PLA2R) 양성 MG 3예, 트롬보스폰딘 1형 도메인 함유 7A 2예를 포함한 막성 사구체병증(MG) 8예와 비교하였다. THSD7A) - MG 양성, 3건의 루푸스 MG. 이 분석에서 총 1695개의 단백질이 확인되었습니다. MG의 질병 발병에 관여하는 단백질이 질량분석기로 검출될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 원리 증명 분석을 수행했습니다. 각각의 알려진 막 유형에 대해 정규화된 강도 기반 절대 정량화(iBAQ) 값을 사용하여 나머지 그룹에 대해 단백질 차등 존재비를 비교했습니다. 통계분석은 Welch's t-test를 이용하여 수행하였고, 그 결과를 화산 플롯에 가시화하였다. PLA2R은 PLA2R 관련 MG의 경우에 훨씬 더 풍부했고 가장 강한 배수 변화를 보였습니다(그림 1a). THSD7A는 THSD7A 관련 MG에서 가장 강한 배수 변화를 표시했지만, 이 그룹의 낮은 샘플 크기로 인해 더 큰 P 값을 나타내었습니다(n=2, 그림 1b). 전반적으로, 이 원리 증명 분석은 레이저 캡처 미세 해부 사구체의 질량 분석이 막성 사구체 병증에서 질병의 발병기전에 중요한 단백질을 식별할 수 있음을 보여주었습니다.
우리는 다음으로 이 접근 방식을 사용하여 MGMID 발병에 잠재적으로 관련된 단백질을 식별하려고 했습니다. 총 6개의 단백질이 다른 그룹에 비해 MGMID 샘플에서 훨씬 더 풍부했습니다(표 1). 가장 높은 배수 변화를 가진 단백질은 SAP였습니다(그림 1c). 나머지 단백질은 IgG 카파, 3개의 보체 단백질 및 이질염색질 단백질 1-결합 단백질 3(HP1BP3)으로 구성되었습니다. SAP는 모든 MGMID 샘플에서 검출되었으며 비 MGMID 샘플에 비해 존재비에서 가장 큰 차이를 보여 최고의 후보로 간주되었습니다. IgG 카파 침전물이 있는 막형 사구체병증의 경우 레이저 캡처 미세 해부 사구체에서 질량 분석으로 식별된 모든 Ig가 보충 표 S1에 나와 있습니다. MGMID 샘플에서 $1 log2 증가된 풍부도와 P-값 #{15}}.1을 나타내는 모든 단백질의 샘플링에 의한 스펙트럼 카운트는 보충 표 S2에 나와 있습니다.
시스탄체향상시킬 수 있습니다신장기능
막 유사 사구체 병증의 경우 SAP 염색
SAP 단백질에 대한 다클론성 토끼 항체(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)는 공초점 분석에 의해 IgG와 함께 국재화된 MGMID가 있는 경우의 사구체 기저막을 따라 강한 양성 염색을 나타냈다. SAP는 PLA2R 관련 MG의 사구체에서 IgG와 공동 국소화를 나타내지 않았습니다(그림 2). HP1BP3에 대한 다클론 토끼 항체는 MGMID를 사용한 4개의 생검에서 테스트되었으며 4개의 경우 모두 사구체 침착물에서 음성 염색을 보였습니다.
SAP 염색은 총 211개신장생검사구체 신염 (표 2). SAP에 대해 양성으로 염색된 면역형 침착물이 있는 총 36건. 양성으로 염색된 모든 증례는 IgG 카파 제한이 있는 간간막 및 상피하 침착물의 존재를 포함하는 특정 조직병리학적 특징을 공유하고 광학현미경에 의한 모세혈관내 또는 막증식성 변화가 없었다. SAP는 한랭글로불린혈증 사구체신염 3건 및 차폐막증식성 사구체신염 3건을 포함하여 MGMID가 아닌 차폐 침착물과 함께 모든 경우에서 음성이었습니다. 또한 IgG1 카파(4건), IgG2 람다(1건), IgG 3 카파(8건), IgG3 람다(6건)를 포함하여 단클론성 Ig 침착을 동반한 증식성 사구체신염(PGNMID)의 19건 모두에서 음성이었다. ). 다클론성 막사구체병증(PLA2R, THSD7A, 루푸스 및 분절)의 30예 모두 SAP에 대해 음성이었다. 추가 형태의 사구체신염도 연구되었으며 음성이었습니다. 감염 관련 사구체신염 중 7예는 IgG 염색 양성이었고 6예는 상피하 혹 침착의 증거가 있었다. 예상대로 아밀로이드증 6예 모두 아밀로이드 침착물에서 양성 염색을 보였다. 그러나, 침전의 얼룩 패턴은 MGMID의 경우에 존재하는 과립 염색과 극명한 대조를 이룹니다. 다양한 신장 질환의 SAP 염색에 대한 사구체의 대표적인 현미경 사진이 보충 그림 S1에 나와 있습니다.
이전에 MGMID로 식별된 32건의 사례 모두 SAP에 대해 양성이었습니다. 또한, 일상적으로 차폐되지 않는 단일형 IgG 침착을 갖는 막성 사구체병증 25예 중 4예에서 사구체에서 SAP에 대한 양성 염색이 있었다.
면역형광, IgG1 카파 13건 중 4건, IgG1 람다 2건 중 0, IgG2 카파 5건 중 0, IgG3 카파 4건 중 0, {{ 12}} IgG4 카파가 있는 경우 1건. 전반적으로, SAP 양성 사구체병증의 36개 중 32개(89%)가 마스킹되어 MGMID 범주에 해당하는 반면, 36개 중 나머지 4개(11%)는 마스킹되지 않았고 IgG1 카파 침착이 있는 MG로 진단되었습니다. 차폐되지 않았지만 SAP에 양성인 단일형 막 사구체병증 환자의 평균 연령은 33세였으며 남녀 비율은 4:{27}}입니다. 차폐되지 않았지만 SAP에 대해 음성인 단일형 막 사구체병증 환자의 평균 연령은 59.3세였으며 남녀 비율은 15:4였습니다.
표 1|환자의 사구체에서 단백질이 크게 증가했습니다.막성 사구체병증마스킹된 IgG 카파 침전물로, 질량 분석에 의해 표시되는 바와 같이
SAP에 대한 혈청 반응성
MGMID 환자 22명, PLA2R 양성 막 사구체병증 환자 12명, 정상 대조군 6명의 혈청을 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 SAP에 대한 IgG 반응성에 대해 테스트했습니다. 각 그룹의 환자 간에 약간의 변동이 있었지만 그룹 간에 SAP에 대한 IgG 반응성에는 유의한 차이가 없었습니다(보충 그림 S2).
그림 2|IgG와 혈청 아밀로이드 P-성분(SAP)의 동시 국소화. (a-c) 차폐된 IgG 카파 침착이 있는 막성 사구체병증으로 진단된 환자의 신장 생검 샘플에서 수행된 면역형광 실험은 (a) SAP 및 (b) IgG에 대한 과립형 사구체 기저막 염색을 보여줍니다. (c) 사구체 기저막 침착물에 SAP와 IgG의 강력한 공동 국소화가 있습니다. (d-f) 3개의 포스포리파제 A2 수용체 양성 막 사구체병증이 있는 환자의 신장 생검 샘플에 대해 수행된 면역형광 실험은 (d) SAP에 대한 음성 사구체 기저막 염색 및 (e) IgG에 대한 양성 과립형 사구체 기저막 염색을 보여줍니다. (f) 3개의 포스포리파제 A2 수용체 관련 막성 사구체병증이 있는 이 환자에서 공동 국소화가 부족합니다. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 표 2에 있는 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오|신장 생검에서 혈청 아밀로이드 p 성분(SAP) 염색 결과
AA, 아밀로이드 A; AL, 아밀로이드 경쇄; C3, 보체 성분 3; GBM, 사구체 기저막; MG, 막성 사구체병증; MGMID, 차폐된 IgG 카파 침착을 갖는 막성 사구체병증; MPGN, 막증식성; 사구체신염; PGMNID, 단클론성 IgG 카파 침착이 있는 증식성 사구체신염; PLA2R, 포스포리파제 A2 수용체; THSD7A, 트롬보스폰딘 유형 1 도메인 함유 7A.
논의
MGMID는 파라핀 IF에 의해 IgG 카파를 염색하는 상피하 및 중간막 침착을 특징으로 하는 사구체병증의 최근에 설명되고 독특한 패턴입니다(그림 3). 이러한 사구체병증 패턴을 가진 환자는 젊은 여성(나이<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">
SAP는 APCS 유전자에 의해 암호화되는 펜트락신 계열 내의 25-kDa 오량체 단백질이며 혈청에 풍부하고 사구체 기저막의 구성 요소입니다. SAP의 정확한 기능은 불분명하지만 알려져 있습니다. 혈장에서 보체 성분, 아포지단백질, 응고 및 단백질 분해 조절제를 비롯한 다양한 단백질과 상호작용합니다.6 이는 단백질, 지단백질 및 DNA를 비롯한 리간드와 안정적인 칼슘 의존적 상호작용을 형성하여 분해로부터 보호합니다. SAP는 미생물 성분 및 세포 사멸 세포 잔해를 포함하여 다양한 병원체 및 손상 관련 분자 패턴을 인식하는 타고난 면역 반응에 관여하는 가용성 패턴 인식 분자 역할을 합니다.7 SAP와 병원체 또는 손상 관련 분자의 상호 작용 패턴은 보체 구성 요소 1q(C1q)에 직접 결합하고 고전적인 보체 경로의 활성화를 통해 사멸 세포 파편의 보체 매개 제거를 촉진합니다. 보체 활성화에도 불구하고, SAP는 면역 조절을 부여하여 호중구를 감소시키는 것으로 알려져 있습니다.염증감소된 내피 부착,8 감소된 엘라스타제 기능,9 및 조직으로의 감소된 귀소를 통해 조직 내에서. SAP는 또한 혈장 내의 DNA 및 염색질에 대한 주요 결합 단백질로 알려져 있습니다.11
질병에서 SAP는 아밀로이드증 침착물의 일부로 가장 잘 알려져 있습니다. 덜 연구되었지만 자가면역 질환의 인간 및 동물 모델에서 역할을 할 수 있다는 증거도 있습니다. SAP 항체는 다음과 같은 환자에서 확인되었습니다.자가면역질병, 감소된 SAP 발현은자가면역쥐 모델에서. SAP에 대한 항체는 전신성 홍반성 루푸스 환자의 44%에서 확인되며 항체 역가는 질병 활성과 관련이 있습니다.12 SAP 결핍은 자가면역 경향이 있는 C57BL/6 마우스와 비자가면역 마우스에서 자발적 자가면역의 발달을 초래하는 것으로 밝혀졌습니다. C57BL/6 생쥐(129/Sv x C57BL/6 F2)13와 교배했을 때 경향이 있는 129/Sv 생쥐13, 129/Sv 계통 단독으로는 그렇지 않으며, 이는 자가면역을 유도하기 위해 SAP 결핍에 근본적인 유전적 감수성이 필요할 수 있음을 시사합니다.14 생쥐는 항핵 항체, 항 단일 가닥 DNA, 항 이중 가닥 DNA 항체 및 류마티스 인자의 생산을 보여줍니다. 그들은 증식면역성 있는복합 매개 사구체신염은 여성에서 더 자주 발생합니다.13 활성화된 자가 DNA를 혈청에 주입하여 사구체신염을 유발하는 루푸스 신염의 쥐 모델에서 플라스미드 벡터에 의한 SAP 유전자 요법은 항이중 가닥 DNA 항체의 생산을 감소시켰습니다. , 면역 복합체 침착 및 신장 염증을 예방하고 루푸스 신염의 발병을 예방합니다.15
그림 3|차폐된 IgG 카파 침착이 있는 막성 사구체병증에서 신장 생검 소견. 그림 2에 표시된 생검의 현미경 사진이 여기에 표시됩니다. (a) Jones methenamine silver stain(원배율 × 400)에 의해 사구체 기저막을 따라 분절 스파이크가 존재합니다. (b) 전자현미경은 사구체 기저막을 따라 존재하는 상피하 침전물을 보여줍니다(원래 배율×12,000). (c) 신선한 조직에 대한 일상적인 면역형광법(직접 면역형광법, 원래 배율 x 400)에 의해 IgG에 대해 음성인 사구체 염색. (d) 프로테아제 소화 후 파라핀 포매 조직에서 양성으로 염색된 동일한 경우의 사구체(직접 면역형광, 원래 배율 x 400). (e) 사구체는 카파에 대한 염색을 나타내고 (f) 프로테아제 소화 파라핀 포매 조직에서 람다가 아님(직접 면역형광, 원래 배율 x 400). 이 이미지의 보기를 최적화하려면 www에서 이 기사의 온라인 버전을 참조하십시오.신장-international.org.
생검에서 관찰된 경쇄 제한에도 불구하고, 현재 이 개체가 근본적인 림프증식성 장애 또는 순환하는 단일클론성 Ig와 연관되어 있다는 증거는 없습니다. 시각. SAP 자가항체의 역할도 불확실합니다. PLA2R 관련 질병16과 같이 면역 침착물에 특이적으로 존재하는 단백질이 있는 다른 형태의 막 사구체병증과 달리, MGMID 환자에서 SAP에 대한 혈청 항체 반응성을 감지하지 못했기 때문에 MGMID는 SAP에 대한 자가항체에 의해 유도되는 것으로 보이지 않습니다. . 다른 설명은 Ig 카파 사슬이 혈청 SAP의 정상적인 상호작용체의 일부로 알려져 있기 때문에 자가면역 항원-항체 상호작용보다는 이들 2개 단백질 간의 정상적인 상호작용의 결과로 IgG 카파가 존재한다는 것입니다. 따라서, 비록 이 개체의 조직 진단에 유용하지만 혈청 내 SAP 항체 테스트는 현재로서는 비침습적 진단 역할을 하지 않으며 이 질병의 근본적인 원인은 미스터리로 남아 있습니다.
MGMID의 임상 결과는 자발적 관해에서 진행, 말기까지 매우 다양합니다.신장질병이식에서 재발. 후향적 분석은 활용된 치료와 임상 결과 사이의 연관성을 보여주지 못했습니다.4 이 질병에 SAP가 관여한다는 발견은 잠재적으로 치료에 영향을 미칩니다. SAP를 직접 표적으로 하는 치료는 아밀로이드증 치료에서 초기 가능성을 보여주었습니다.17,18 또한, 질량 분석 결과는 보체 캐스케이드를 표적으로 하는 요법이 이러한 형태의 사구체신염 치료에 유용할 수 있음을 나타냅니다. MGMID 사구체에서 보체 관련. 이 질병에 대한 활성의 바이오마커와 치료법을 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
일상적인 면역형광에서 MGMID 생검에서 면역 침착물을 가리는 이유는 여전히 미스터리로 남아 있습니다. 예금에 SAP의 존재는 MGMID의 경우 이 현상에 대한 새로운 가능한 설명을 제기합니다. 예를 들어, SAP 단백질의 상호작용은 Ca2þ에 크게 의존하는 것으로 알려져 있으며 면역형광을 위한 신장 생검 조직의 처리에 사용되는 많은 수송 매체와 완충액에는 Ca2þ가 없습니다. Ca2þ가 시험관 내에서 결핍되면 면역 침착물이 파괴되어 동결된 조직에 대한 면역형광법으로 더 이상 검출할 수 없게 됩니다. 그러나 면역 복합체 침착물은 포르말린으로 고정된 조직에서 탐지에 이용 가능하지만, 조직 내 단백질 사이의 포르말린 유도 공유 화학 결합의 결과입니다.
우리는 여기서 처음으로 MGMID의 사구체 침전물에서 SAP의 독특한 존재를 설명합니다. 또한, 우리는 그 염색을 보여줍니다신장생검for SAP는 일상적인 면역형광법을 통해 차폐 없이 MGMID와 유사한 임상병리학적 특징을 가진 사례를 식별합니다. 이러한 결과를 감안할 때 우리는 SAP에 대한 사구체 침착물 내의 양성 염색이 질병의 일반적인 병태생리학적 기전을 공유하는 독특한 형태의 사구체신염을 식별한다고 믿습니다. 최근 MGMID에 대한 설명이 있기 전까지 이러한 사례는 C3 사구체병증에서 감염 관련 사구체신염, 비정형 막성 사구체병증에 이르기까지 다양한 범주로 진단되었습니다. 진단 기준의 급속한 발전과 이러한 형태의 사구체신염에 대한 이해는 질량의 힘을 강조합니다. 면역 매개 사구체신염에 대한 병태생리학적 통찰력을 제공하는 분광법.
행동 양식
신장 생검 처리 기술
빛, 면역형광, 전자현미경을 포함한 표준 신장 생검 처리 기술이 사용되었습니다.19,20 모든 광학 현미경 샘플은 hematoxylin 및 eosin, Jones methenamine silver, Masson trichrome 및 과요오드산-Schiff 시약으로 염색되었습니다. 모든 직접 면역형광 절편을 4mm로 절단하고 IgG, IgA, IgM, C3, C1q, 피브리노겐, k- 및 l-경쇄에 대한 flfluorescein 태그가 지정된 다클론 토끼 항인간 항체와 반응했습니다(Dako, Carpenteria, CA). 1시간 동안 헹구고; 커버슬립은 수성 장착 매체를 사용하여 적용되었습니다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)에 대한 flfluorescein 태그가 지정된 다클론성 마우스 항인간 항체에 대해 선별된 사례를 염색했습니다. 파라핀 면역형광은 이전에 설명한 대로 프로테아제 소화 후에 수행되었습니다.2,3 총 9개의 MGMID 생검과 다른 유형의 막성 사구체병증이 있는 8개의 비교 대조 생검을 질량 분석법 분석을 위해 선택했습니다. 연구 프로토콜은 솔루션 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언 원칙을 준수했습니다.
시스탄체 캔토니파이신장
레이저 캡처 미세 해부 사구체의 질량 분석
포르말린 고정 파라핀 포매 조직의 신장 생검 조직을 Leica PET 멤브레인 프레임 슬라이드(Leica, Wetzlar, Germany)에서 1{6}} mm 두께로 절단했습니다. 그런 다음 이 슬라이드를 헤마톡실린으로 염색했습니다. Leica DM60{{2{24}}}}0B 현미경을 사용하여 사구체를 미세 원심분리 튜브로 미세 해부했습니다. 미세해부된 사구체를 2% 나트륨 도데실 설페이트 및 0.1M 디티오트레이톨에 99도에서 1시간 동안 용해하고 필터 보조 샘플 준비(FASP)로 처리했습니다.21 정화된 용해물을 Vivacon 500 농축기(MWCO 30kDa, Sartorius , 괴팅겐, 독일). 0.1M 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄/Cl, pH 8.5 중 8M 요소로 반복 세척하여 나트륨 도데실 설페이트를 제거했습니다. 이어서, 샘플을 0.05 M 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 요오도아세트아미드는 8M 우레아/0.1M 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄/Cl, pH 8.5로 3회 세척한 후 0.05M 중탄산암모늄으로 3회 세척하여 제거했습니다. 단백질은 16시간 동안 37도에서 40:1 w/w 비율로 트립신(시퀀싱 등급, Promega, Madison, WI)으로 소화되었습니다. 펩티드는 원심분리에 의해 수집되고 C{36}}Stage 팁(Thermo Scientific, Waltham, MA)에서 탈염되었습니다.
분해된 펩타이드는 Thermo Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기(Thermo Scientific)를 사용하여 NanoLC-탠덤 질량 분석에 의해 분석되었습니다. 펩타이드를 150mm X 0.{14}}트랩에 사용된 것과 동일한 역상 수지를 포함하는 75mm 분석 컬럼. 그런 다음 nanoAcquity 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템(Waters Corp.)을 사용하여 60-98:2에서 6{16}}:40 완충액 A:B 비율(완충액 A=0.1% 포름산 , 0.5% 아세토니트릴, 완충액 B=0.1% 포름산, 99.9% 아세토니트릴).
통합 스프레이 팁(Picofrit, New Objective)이 있는 컬럼에서 펩티드를 용리하고 전자분무(2.{1}} kV)로 이온화한 후 더 높은 에너지 충돌 유도 해리(HCD)를 사용하여 직렬 질량 분석 분석을 수행했습니다. 펩타이드 전구체의 조사 스캔은 5×10⁵ 이온 카운트 타겟을 사용하여 240K 해상도(400m/z에서)에서 수행되었습니다. 탠덤 질량 분석은 1.6 Th에서 사중극자를 사용한 분리, 30의 정규화된 충돌 에너지를 갖는 HCD 단편화 및 이온 트랩에서의 신속한 스캔 질량 분석 분석에 의해 수행되었습니다. 획득한 직렬 질량 분석 데이터는 다음을 사용하여 Swiss Prot 및 TREMBLE 항목을 모두 포함하는 가장 최근의 Uniprot 인간 데이터베이스에 대해 검색되었습니다.
MaxQuant(독일 플라네그 소재 막스 플랑크 생화학 연구소). 데이터 시각화는 Scaffold v4.6(Proteome Software, Portland, OR)을 사용하여 수행되었습니다. 잘못된 발견 비율은 펩타이드 대 스펙트럼 일치에 대해 1%로 설정되었습니다. MaxQuant의 정규화된 iBAQ 값을 정량에 사용했습니다. 각 샘플에 대한 iBAQ 분포는 로딩의 차이를 제어하기 위해 중앙값으로 조정되었습니다. 0과 같은 iBAQ 값은 데이터 세트에서 제거되었습니다. 통계적 가설 검정을 위해 2-샘플 Welch의 t-검정이 두 그룹에 대해 정규화된 iBAQ 값을 사용하여 각 단백질에 대해 수행되었습니다. 한 그룹에서만 단백질이 검출된 경우 1-검출된 가장 작은 iBAQ 값을 귀무 가설로 사용하여 샘플 Welch의 t-검정이 수행되었습니다.
SAP 염색
3mm로 절단된 포르말린 고정 파라핀 포매 절편을 탈파라핀화하고 99도에서 항원 회수를 수행하였다. 섹션을 토끼 다클론 항-SAP 다클론 항체(1:400; ThermoFisher, Waltham, MA)와 반응시킨 다음, 인간과의 최소 교차 반응을 보장하기 위해 고체상으로 흡착된 로다민 레드 X-접합 염소 항-토끼 이차 IgG(1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). 각 사례는 양성 대조군과 음성 대조군으로 실행되었습니다. 얼룩은 표준 면역형광 현미경으로 평가했습니다. 사구체에 입상모세혈관고리 염색이 양성이면 양성, 모세혈관이 없으면 음성으로 판단하였다.
사구체의 염색. 사구체 기저막에서 IgG와 SAP의 colocalization은 Zeiss LSM 880 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Zeiss Microscopy, Jena, Germany)을 사용하여 공초점 현미경으로 검사했습니다. 이 분석을 위해 다클론(flfluorescein isothiocyanate-conjugated) 토끼 항인간 IgG(1:40; Agilent, Santa Clara, CA)는 위에서 설명한 대로 SAP 염색 후 열 회수 조직과 반응했습니다. 1차 항체를 생략함으로써 항체 특이성을 보장하기 위해 음성 대조군을 수행하였다. MGMID의 4가지 경우가 면역과산화효소 염색을 통해 HP1BP3(1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA)의 존재에 대해 테스트되었습니다.
SAP에 대한 혈청 항체 테스트
SAP 단백질(R&D Systems, Minneapolis, MN, {{0}}SAB-050)을 탄산수소염 완충액(pH 9.6)에서 3ng/ml로 희석하고 {{ 6}} 4도에서 밤새 Immulon H2 플레이트(Thermo Scientific)를 웰. 플레이트를 2{18}}0ml의 세척 완충액(1×인산염 완충 식염수 및 0.05% 트윈)을 사용하여 3회 세척하고 차단 완충액(1×인산염 완충 식염수, 0.05%)으로 2시간 동안 차단했습니다. 트윈, 1% 생선 젤라틴). 이어서 플레이트를 200 ml의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 20 마이크로리터의 희석된 혈청(세척 완충액 중 1:100)을 웰당 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 ml의 세척 완충액으로 7회 세척한 후 검출 항체인 항-인간 IgG-HRP(Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003)를 첨가했습니다. 플레이트를 200 ml의 세척 완충액으로 7회 세척하였다. 다음으로, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 퍼옥시다제 기질과 퍼옥시다제 기질 Sol B를 1:1 비율로 혼합하고 100ml를 첨가하였다. 2M H2SO4 100ml를 첨가하여 반응을 중단시키고 450nm에서 판독하기 전에 벤치에 20분 동안 방치했습니다. SAP 단백질이 플레이트에 결합되도록 제어하기 위해 토끼 항-SAP(Invitrogen, Carlsbad, CA; PA{47}})를 연속 희석한 후 항-토끼 IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 사용했습니다. ; 111-035-144). 대조군은 평균 R-제곱 값이 0.95로 항체의 희석도와 흡광도 사이에 좋은 상관관계를 보여주었습니다.
개선을 위한 시스탄체신장기능
폭로
모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.
보충
자료 보충 파일(PDF)
그림 S1. 다양한 신장 질환에서 사구체 SAP 염색의 대표적인 이미지.
그림 S2. 효소 결합 면역흡착 분석에 의한 항-SAP 혈청반응성 연구.
표 S1. 모든 Ig는 IgG 카파 침착물이 있는 막형 사구체병증의 경우에서 레이저로 포착한 미세 해부된 사구체에서 질량 분석에 의해 식별됩니다.
표 S2. 모든 단백질의 샘플링에 의한 스펙트럼 계수는 MGMID 샘플에서 $1 log2 증가된 풍부도 및 P-값 # 0.1을 보여주었습니다.
참조
1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM 등 차폐된 IgG 카파 침착이 있는 막성 사구체병증.신장국제 2014;86: 154–161.
2. 메시아스 NC, 워커 PD, 라슨 CP. 신장 병리학 실험실의 파라핀 면역형광: 회수 기술 이상. 모드 패톨. 2015;28:854–860.
3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD 등 차폐된 단일형 면역글로불린 침착이 있는 막증식성 사구체신염. 신장 국제 2015;88:867–873.
4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN 등 차폐된 IgG 카파 침착이 있는 막성 사구체병증의 임상병리학적 특징. 신장 국제 대표 2016;1:299–305.
5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. 5량체 인간 혈청 아밀로이드 P 성분의 구조. 자연. 1994;367:338–345.
6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et al. 생리 학적 칼슘 수준을 포함하는 인간 혈장의 혈청 아밀로이드 P 구성 요소 (SAP) 상호 작용. 생화학. 2017;56:896–902.
7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, et al. 펜트락신에 의한 패턴 인식. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98–116.
8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, et al. 선천성 면역, 염증 조절 및 조직 재형성에서 펜트락신 PTX3 및 SAP. J 헤파톨. 2016;64:1416–1427.
9. 리 JJ, McAdam KP. 인간 아밀로이드 P 성분: 엘라스타제 억제제. Scand J Immunol. 1984;20:219–226.
10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. 혈청 아밀로이드 P: 선천성 면역 반응의 전신 조절자. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.
11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. 보호 분자 - C 반응성 단백질(CRP), 혈청 아밀로이드 P(SAP), 펜트락신3(PTX3), 만노스 결합 렉틴(MBL) 및 아포지단백질 A1(Apo A1), 및 그들의 자가항체: 자가면역에서의 유병률 및 임상적 중요성. J Clin Immunol. 2005;25:582–591.
12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. 전신성 홍반성 루푸스 환자에서 항혈청 아밀로이드 성분 P 항체는 질병 활성과 상관관계가 있습니다. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698–1702.
13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL 등 혈청 아밀로이드 P 성분은 염색질 분해를 조절하고 항핵 자가면역을 예방합니다. 냇 메드. 1999;5:694–697.
14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et al. 혈청 아밀로이드 P 성분 유전자의 표적화된 결실이 있는 마우스의 자가면역 및 사구체신염: SAP 결핍 또는 균주 조합? 면역학. 2004;112:255–264.
15. Zhang W, Wu J, Qiao B, et al. 뚜렷한 기전을 가진 혈청 아밀로이드 P 성분 유전자 치료에 의한 루푸스 신염의 개선은 질병의 다른 단계에 따라 다릅니다. 플로스 원. 2011;6:e22659.
16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et al. 특발성 막성 신병증에서 표적 항원으로서 M형 포스포리파제 A2 수용체. N 영어 J Med. 2009;361:11–21.
17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et al. 혈청 아밀로이드 P 성분에 대한 항체에 의한 아밀로이드의 치료적 제거. N 영어 J Med. 2015;373:1106–1114.
18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV 등 전신 아밀로이드증 환자에서 혈청 아밀로이드 P 성분에 대한 항체의 반복 투여는 아밀로이드 침착을 제거합니다. 과학 번역 의학. 2018;10.
19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. 신장 생검을 위한 실습 지침. 모드 패톨. 2004;17:1555–1563.
20. 워커 PD. 신장 생검. 아치 패톨 연구소 Med. 2009;133:181–188.
21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. 프로테옴 분석을 위한 범용 시료 전처리 방법. Nat 메서드. 2009;6: 359–362.
