포도당은 멜라닌 세포 및 인간 피부 등가물에서 티로시나제의 간접적인 불활성화에 의해 항멜라닌 생성 효과를 발휘합니다
Mar 22, 2023
추상적인:
당은 유기체에 어디에나 존재하며 최소한의 부작용으로 피부 보습을 위한 잘 알려진 화장품 성분입니다. 살아있는 세포가 에너지원으로 사용하는 단당류인 포도당은 스킨케어 제품에 자주 사용됩니다. 설탕 및 설탕 관련 화합물이 멜라닌 세포에 항 멜라닌 생성 효과가 있음을 여러 보고서에서 입증했습니다. 그러나 포도당이 화장품에서 미백 및 보습 성분으로 사용되지만 포도당이 멜라닌 합성을 억제하는 근본적인 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 포도당이 멜라닌 세포 자극 호르몬(MSH)으로 자극된 B16 세포와 세포 독성의 징후가 없는 어둡게 착색된 정상 인간 멜라닌 세포의 멜라닌 함량을 유의하게 감소시킨다는 것을 발견했습니다.
또한, 포도당의 국소 처리는 착색된 3D 인간 피부 모델 MelanoDerm에서 사진, Fontana-Masson(F&M) 염색 및 다광자 현미경 검사를 통해 미백 효능을 입증했습니다. 그러나 포도당은 멜라닌 세포에서 주요 멜라닌 생성 단백질의 유전자 발현이나 단백질 수준을 변경하지 않았습니다. 포도당은 멜라닌 세포에서 세포 내 티로시나제 활성을 강력하게 감소시켰지만 무세포 실험 시스템에서는 버섯 티로시나제 활성을 감소시키지 않았습니다. 그러나 포도당은 젖산으로 대사되어 티로시나제 활성을 강력하게 억제할 수 있습니다. 따라서 우리는 포도당이 젖산으로 전환되어 티로시나제 활성을 간접적으로 억제한다는 결론을 내렸고, 이는 멜라닌 세포에서 포도당의 항멜라닌 생성 효과를 설명합니다.
티로시나제는 단백질에서 티로신을 분해하여 티로신 페놀 및 기타 물질과 같은 티로신 산화 생성물로 전환할 수 있는 효소입니다. 이 효소는 인체, 특히 음식의 소화와 흡수에 관여하는 장에 널리 존재합니다. 동시에, 연구에서 Cistanche가 티로시나아제의 활동을 감소시켜 피부를 하얗게 할 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다.
키워드:
멜라닌 생성; 설탕; 포도당; 티로시나제; 인간의 피부 등가물
1. 소개
멜라닌 생성은 멜라닌 생성 과정이며 피부 보호에 필수적입니다. 멜라닌은 자외선(UV) 빛을 흡수하고 자외선과 자유 라디칼의 손상 효과로부터 피부를 보호합니다[1]. 그러나 과도한 멜라닌 생성은 주근깨, 흑점 등의 과색소침착을 유발하여 심미적이지 못하다고 여겨질 수 있기 때문에 화장품이나 의약품에 효과적인 탈색소 성분을 찾기 위해 많은 연구가 진행되어 왔다[2-4].
설탕은 피부 보습을 위한 강력한 습윤제로서 부작용이 거의 없이 피부 보습을 위한 화장품 원료로 사용된다. 또한 당과 당 관련 물질은 멜라닌 생성에 영향을 미칩니다[5,6]. 멜라닌 합성에 관여하는 주요 효소인 티로시나아제의 글리코실화가 변경되어 촉매 활성을 억제하고 분해를 가속화할 수 있습니다[7]. 멜라닌 생성에서 당의 역할은 멜라닌 세포의 색소 표현형에 대한 글리코실화의 영향과 티로시나아제의 촉매 활성에 대한 당 잔기의 역할을 조사한 연구에서 강조되었습니다[5-7]. 일부 연구에서는 설탕 유도체가 티로시나아제 성숙을 억제하여 글리코실화에 영향을 줄 수 있다고 보고했습니다. 예를 들어 NAG(N-acetylglucosamine)는 글루코스에 아미노 그룹을 추가하여 생리학적으로 생성되는 아미노 6탄당으로 티로시나아제 글리코실화를 방해하여 기니피그 피부와 사람 피부에서 탈색 효과를 나타냅니다[8].
또한 최근 연구에 따르면 설탕 관련 화합물이 티로시나아제 발현 또는 활성화를 억제하고 글리코실화를 변경하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어 펙틴의 주성분인 갈락토스의 산화 형태인 당산인 갈락투론산(GA)의 미백 효능을 평가했습니다. 갈락투론산은 B16 마우스 흑색종 세포 및 인간 피부 등가물에서 티로시나제 활성 및 발현의 조절을 통해 미백 효과를 발휘합니다[9]. 또 다른 보고서에서는 고리형 니트로실 니게로스(CNN)로 알려진 새로운 유형의 고리형 올리고당이 티로시나아제의 효소 활성에 대해 약하지만 상당한 직접 억제 효과를 보여 저색소침착의 한 가지 가능한 메커니즘을 시사합니다[10]. 적절한 글리코실화에 의한 티로시나제 성숙과 유사하게 CNN의 발현 또는 활성은 항멜라닌 생성제의 표적이 될 수 있습니다[11]. 그러나 수많은 항멜라닌 생성제에는 백반증과 같은 심각한 부작용이 있습니다[12,13]. 따라서 더 안전한 탈색소 화합물에 큰 관심이 있습니다.
여기에서 우리는 B16 마우스 흑색종 세포와 정상적인 인간 멜라닌 세포에 대한 포도당의 항 멜라닌 생성 효과를 조사했습니다. 또한 인체 피부 등가물을 조직 절편 염색하여 조직의 색과 표피 상태를 조사하였다. 우리의 연구 결과를 바탕으로 우리는 포도당의 미백 효과가 젖산 생산에 의존하여 티로시나아제 불활성화를 초래한다고 제안합니다.
2. 결과
2.1. B16 및 NHM에서 포도당의 항멜라닌 생성 효능
포도당의 항멜라닌 생성 효과를 조사하기 위해 B16 흑색종 세포(쥐 흑색종 세포주)와 정상 인간 멜라닌 세포(NHM)의 두 가지 유형의 멜라닌 세포를 사용했습니다. 먼저 포도당이 B16 세포에 독성이 있는지 확인했습니다. 포도당은 그림 1A와 같이 B16 세포에서 최대 100mM 농도에서 어떠한 세포독성도 나타내지 않았습니다. 세포 독성 데이터를 기반으로 B16 세포를 멜라닌 생성 유도제인 멜라닌 세포 자극 호르몬(MSH) 존재 하에 다양한 농도의 포도당으로 72시간 동안 처리했습니다. 그림 1B에서 볼 수 있듯이 포도당은 세포 내 멜라닌 함량을 용량 의존적으로 명확하고 유의하게 하향 조절했습니다. Kojic acid(KA)는 피부 미백 화장품 성분으로 자주 사용되기 때문에 항멜라닌 생성을 위한 참조 화합물로 사용되었습니다[1,3,4]. 포도당 처리 세포의 용해물의 색은 대조군 세포의 색보다 밝았습니다(그림 1C).
또한, 배양 배지로 분비되는 멜라닌의 양이 감소하고 배지의 색이 밝아지는 것을 확인하였다(도 1D). 다음으로 우리는 어둡게 착색된 NHM에 대한 포도당의 항멜라닌 생성 효과를 조사했습니다. 최대 100mM 농도의 포도당은 최대 4일 동안 세포독성이 없었습니다(그림 1E). 4일 동안 NHM의 포도당 처리 후 멜라닌 함량을 측정했을 때, 우리는 멜라닌 함량이 용량 의존적으로 감소하는 것을 발견했습니다(그림 1F). 종합하면, 이러한 결과는 포도당이 멜라닌 세포에서 멜라닌 합성을 억제한다는 것을 나타냅니다.
2.2. 3D 인체 피부 등가물에 대한 포도당의 미백 효과
포도당의 항 멜라닌 생성 능력을 추가로 정의하기 위해 착색된 3D 인간 피부 모델인 MelanoDerm을 사용했습니다. 재료 및 방법 섹션에 설명된 대로 포도당을 MelanoDerm에 18일 동안 국소 도포하고 세포 생존력을 CCK-8 분석으로 결정했습니다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, 18일 동안 포도당 처리 후 조직 세포독성이 관찰되지 않았다. 조직 색상 변화를 사진으로 평가했습니다. 그림 2B에서 볼 수 있듯이 포도당 처리 조직은 인산염 완충 식염수(PBS) 처리 조직보다 색상이 더 밝았습니다. 또한, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 포도당이 조직 붕괴를 유도하지 않는 것으로 밝혀진 반면, 폰타나-마손(F&M) 염색은 포도당이 기저층에서 과색소침착된 멜라닌 세포(화살표로 표시됨)의 수를 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 2C). .
멜라닌 함량의 변화를 추가로 조사하기 위해 그림 2D와 같이 2광자 여기 형광(TPEF) 현미경을 사용하여 PBS 및 포도당 처리 조직의 멜라닌 세포층에서 멜라닌의 자동 형광 신호를 비교했습니다. 이 이미지를 분석한 결과 PBS 처리 조직에 비해 포도당 처리 조직에서 멜라닌 부피가 약 36% 감소하고 멜라닌 세포가 풍부한 부위의 멜라닌에 대한 TPEF 신호 강도가 약 38% 감소한 것으로 나타났습니다.
그림 2. 인간 피부와 동등한 MelanoDerm에 대한 포도당의 영향. (A) 포도당으로 처리된 인간 피부 동등물의 생존력. (B) 인간 피부 등가물(MelanoDerm; n=3)을 18일 동안 포도당으로 국소 처리한 다음 사진을 찍었습니다. ΔL 값은 PBS 처리된 조직과 비교하여 밝기의 정도를 나타냅니다. (C) 조직 절편의 H&E 및 F&M 염색. 슬라이드를 포름알데히드 용액에 고정하고 염색을 위해 파라핀 왁스에 포매하였다(스케일 바, 5{{10}} μm). 검은색 화살표는 착색된 멜라닌 세포를 나타냅니다. (D) TPEF 현미경을 사용하여 인간 피부 등가물의 멜라닌 이미징(200 × 200 × 60 µm3 )을 수행했습니다. 유사색(빨간색) 신호는 멜라닌(축척 막대, 50µm)을 나타냅니다. 그래프는 멜라닌 부피 및 TPEF 신호의 정량화를 나타냅니다. 데이터는 최소 세 번의 독립적인 측정의 평균 ± SD로 표현됩니다(*p < 0.05, ***p < 0.001).
2.3. 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성 단백질의 발현에 대한 포도당의 영향
다음으로, 멜라닌 세포에서 포도당의 탈색 메커니즘을 규명하기 위해 B16 세포와 NHM에서 tyrosinase와 Tyrp-1와 같은 멜라닌 생성 효소의 발현에 미치는 영향을 평가했습니다. B16 세포를 -MSH의 존재 하에 지시된 시간 동안 글루코스로 처리하였다. 그런 다음 tyrosinase와 Tyrp-1의 단백질 수준을 Western blot assay로 측정했습니다(그림 3A). tyrosinase와 Tyrp-1의 발현 수준은 어느 시점에서도 포도당에 의해 감소하지 않았습니다. 또한, 티로시나아제의 전사 수준은 -MSH로 자극된 B16 세포에서 포도당에 의해 영향을 받지 않았습니다(그림 3B). B16 세포와 유사하게, 글루코스로 처리된 NHM 세포에서 tyrosinase, Tyrp-1 및 MITF의 단백질 수준은 글루코스에 의해 억제되지 않았으며(그림 3C), tyrosinase 및 Tyrp-1의 mRNA 수준 또한 글루코스에 의해 억제되지 않았습니다. 감소했지만 포도당에 의해 약간 증가했습니다(그림 3D).
그림 3. B16 세포 및 NHM에서 멜라닌 생성 단백질의 발현에 대한 포도당의 영향. (A, B) B16 세포를 20 mM 글루코스의 존재 또는 부재 하에 지시된 시간 동안 -MSH로 처리하였다. 그런 다음 웨스턴 블롯(A) 및 qRT-PCR(B) 분석을 수행했습니다. (C) NHM을 지시된 농도의 글루코스로 48시간 동안 처리하였다. 그런 다음 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. (D) NHM을 50mM 글루코스의 존재 하에 지시된 시간으로 처리하였다. 그런 다음 qRT-PCR 분석을 수행했습니다. 데이터는 최소 세 번의 독립적인 측정의 평균 ± SD로 표현됩니다.
2.4. Tyrosinase 활성에 대한 포도당의 영향
포도당의 작용 메커니즘을 더 자세히 정의하기 위해 버섯 티로시나제 활성에 대한 억제 효과가 있는지 테스트했습니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이 포도당이 버섯 티로시나제 활성에 대한 억제 효과가 없음을 발견했으며 이는 포도당이 티로시나제 활성에 직접적으로 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 우리는 다음으로 B16 세포와 NHM 모두에서 포도당 처리 세포 용 해물을 사용하여 총 세포 내 티로시나제 활성 분석을 수행했습니다. 흥미롭게도, 세포내 티로시나제 활성은 -MSH 존재 하에 글루코스 처리된 B16 세포에서 용량 의존적 방식으로 억제되었다(도 4B). NHM에서 포도당은 또한 세포 내 티로시나제 활성을 억제했습니다(그림 4C). 이러한 데이터는 포도당이 멜라닌 세포에서 티로시나아제를 간접적으로 비활성화할 가능성을 뒷받침합니다.
그림 4. 티로시나제 활성에 대한 포도당의 영향. (A) 무세포 시스템에서 버섯 티로시나제 활성에 대한 포도당의 영향. (B, C) 세포 티로시나제 활성 분석. (B) B16 세포를 지시된 농도의 글루코스로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음 방법 섹션에 설명된 대로 세포 티로시나아제 활성 분석을 수행했습니다. (C) NHM은 표시된 시간 동안 50mM 포도당으로 처리되었습니다. 그런 다음 방법 섹션에 설명된 대로 세포 티로시나아제 활성 분석을 수행했습니다. 세포 티로시나제 활성은 총 단백질 함량에 의해 정규화되었다. 데이터는 최소 세 가지 독립적인 측정의 평균 ± SD로 표현됩니다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
2.5. 포도당 처리 멜라닌 세포에서 젖산 생성에 의한 Tyrosinase 불활성화
포도당은 세포 대사 산물인 젖산염으로 전환되는데, 이는 용액의 젖산이며 색소 병변 치료에 효과적인 것으로 보고되었습니다[14,15]. 따라서 우리는 포도당이 멜라닌 세포에서 젖산으로 전환되고 젖산의 증가가 티로시나아제 불활성화를 통해 멜라닌 생성을 억제한다는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 평가하기 위해 먼저 포도당 처리 멜라닌 세포의 배지에서 젖산 생산을 평가했습니다. 예상대로 포도당은 B16 세포 배양 배지에서 젖산 함량을 상당히 상향 조절했습니다(그림 5A). 또한 젖산은 tyrosinase 활성을 직접적으로 억제하는 것으로 알려져[15], 젖산이 버섯 tyrosinase 활성을 억제하는지 평가하였다. 그림 5B에서 볼 수 있듯이 젖산은 포도당과 달리 버섯 티로시나제 활성을 극적으로 억제했습니다. 이러한 결과는 포도당의 젖산으로의 전환이 젖산에 의한 티로시나제 불활성화를 통해 항멜라닌 생성 효과가 있음을 시사한다.
그림 5. 포도당에 의한 젖산 생성 및 젖산이 티로시나제 활성에 미치는 영향. (A) 포도당 처리 B16 세포에서 젖산 생산. (A) B16 세포를 지시된 농도의 글루코스로 3일 동안 처리하였다. 그런 다음 방법 섹션에 설명된 대로 배양 배지를 사용하여 젖산 분석을 수행했습니다. (B) 무세포 시스템에서 버섯 티로시나제 활성에 대한 젖산의 영향. 데이터는 최소 세 가지 독립적인 측정의 평균 ± SD로 표현됩니다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). .
3. 토론
당류 또는 당류 유래 물질은 피부 보호 및 생리 조절을 위한 화장품 원료로 많이 사용된다. 예를 들어, 라피노스는 mTOR-독립적 자가포식을 증가시키고 UVB 조사된 케라티노사이트에서 세포 사멸을 감소시켜 천연 물질인 라피노스가 광손상을 제한하는 데 잠재적인 가치가 있음을 나타냅니다[16]. 트레할로스와 수크로스는 mTOR 독립적인 경로를 통해 인간 케라티노사이트에서 자가포식의 새로운 활성제입니다[17]. 이러한 발견은 케라티노사이트에서 설탕 매개 autophagy 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 포도당의 경우 국소 포도당이 아토피 피부염 및 각질세포 배양 마우스 모델에서 claudin-1 및 filaggrin 발현을 유도하는 것으로 나타났으며 이는 피부 장벽 기능을 회복시켜 항염증 효과가 있음을 나타냅니다[18]. 또한 포도당은 피부 각질세포의 증식을 억제하고 분화를 촉진한다[19]. 따라서 포도당은 피부 장벽 기능 및 각질 세포 수화 수준과 같은 표피 생리학의 다양한 측면을 조절합니다.
설탕은 티로시나제와 관련된 여러 가지 다른 메커니즘을 통해 탈색제 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 제제는 티로시나아제 성숙을 억제하는 반면, 다른 제제는 티로시나아제 유전자 발현 또는 활성의 억제를 유도합니다[5,8-10]. 그러나 포도당의 탈색소 효과의 기본 메커니즘을 조사한 연구는 거의 없습니다.
멜라닌 생성에 대한 포도당의 영향을 확인하기 위해 우리는 이전에 지질 대사 및 콜레스테롤 항상성에서 중추적인 역할을 하는 리간드 활성화 핵 수용체인 간 X 수용체(LXR)에 초점을 맞췄습니다[20]. 우리는 간 X 수용체 활성화가 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 매개 미세안구증 관련 전사 인자(MITF) 분해의 가속화를 통해 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 발견했습니다[21]. 또한 포도당은 내인성 LXR 리간드입니다[22]. 따라서 우리는 포도당이 LXR 의존적 경로의 활성화로 인해 항멜라닌 생성 효과를 갖는다는 가설을 세웠습니다. 그러나 그림 3C에서 볼 수 있듯이 포도당은 티로시나제 또는 MITF의 발현 수준을 변경하지 않았지만 LXR 활성화는 멜라닌 세포에서 이러한 단백질의 발현 수준을 감소시켰습니다.
따라서 우리는 포도당이 LXR 활성화와 무관하게 멜라닌 세포에 대한 탈색 효과를 갖는다고 결론지었습니다.
포도당은 에너지 생산의 주요 기질이며 해당작용으로 알려진 여러 효소의 연속 반응을 통해 가수분해됩니다. 수많은 연구에 따르면 해당작용은 호기성 또는 혐기성 조건에 관계없이 단 하나의 최종 생성물인 젖산만 가지고 있습니다. 호기성 조건(O2)에서 젖산염은 미토콘드리아 젖산염 탈수소효소(MLD)의 기질로 사용됩니다. LDH는 트리카르복실산(TCA) 회로에 들어가는 피루브산으로 변환합니다. 혐기성 조건(N2)에서 젖산은 세포질에 축적됩니다. 따라서 해당 경로는 기질인 포도당에서 시작하여 주요 최종 생성물인 젖산염 생산으로 종료됩니다[23]. 또한 David et al. 정상 인간 멜라닌 세포에서 젖산 또는 피루브산으로 전환된 포도당의 분율을 측정했습니다[24]. 대부분의 포도당 대사 산물은 피루브산이 아닌 젖산이었습니다.
젖산은 알파 하이드록시산(AHA)입니다. 이러한 산은 표면 필링제로 화장품 제형에 광범위하게 사용됩니다[25]. 또한, 젖산은 젖산의 산성과는 무관한 효과인 티로시나제 활성을 직접 억제하여 멜라닌 생성을 억제하는데, 이는 젖산이 색소성 병변에 미치는 영향이 표피 세포 턴오버의 촉진뿐만 아니라 멜라닌 세포 [15]. 따라서 우리는 포도당이 젖산으로 전환될 수 있기 때문에 젖산 생산을 통해 포도당이 항멜라닌 생성 효과를 발휘할 수 있다고 추론했습니다. 예상대로 포도당 처리가 멜라닌 세포에서 젖산 생성을 초래한다는 것을 발견했습니다(그림 5A).
또한 젖산이 tyrosinase 활성을 강력하고 직접적으로 억제함을 확인하였다(Figure 5B). Usuki et al. 또한 젖산이 B16 세포와 인간 HM3KO 세포에서 세포내 티로시나제 활성을 감소시킨다는 것을 발견했습니다[15]. 보고서에서 tyrosinase와 Tyrp-1의 mRNA와 단백질 수준은 젖산의 영향을 받지 않았습니다. 함께, 이 데이터는 포도당이 젖산 생산을 증가시키고 이 젖산이 유전자 발현 수준에 영향을 미치지 않고 티로시나아제 활성을 직접적으로 억제한다는 것을 나타냅니다. 이는 포도당이 젖산 생산에 의존하는 간접적인 티로시나아제 불활성화를 통해 멜라닌 세포에서 항멜라닌 생성 효과가 있음을 나타냅니다. 그러나 탈색에서 젖산과 포도당의 역할을 검증하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다.
이 연구의 종합 데이터는 화장품 및 의약 제형에 안전하게 사용할 수 있는 효과적인 미백 및 보습 시약으로서 국소 포도당의 유용성을 뒷받침하는 예비 증거를 제공합니다.
4. 재료 및 방법
4.1. 재료
D-포도당, -MSH, 코지산(KA), L-티로신, L-DOPA 및 젖산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 티로시나아제와 액틴에 대한 항체는 Abcam(Cambridge, UK)에서 구입했습니다. Tyrp-1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)에서 구입했습니다. MITF에 대한 항체는 Proteintech(미국 일리노이주 시)에서 구입했습니다.
4.2. 세포 배양 및 생존력 분석
우리는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 B16 쥐 흑색종 세포, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 및 fetal bovine serum(FBS)을 구입했습니다. B16 세포는 5% FBS가 보충된 제조업체(ATCC)가 권장하는 4500 mg/L 고포도당(ATCC 30-2002)을 포함하는 DMEM에서 배양하고 95% 공기를 포함하는 가습 분위기에서 37 ºC로 배양하고 10% CO2. 어둡게 착색된 기본 NHM은 Thermo Fisher Scientific(#C2025C, Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. 세포를 Human Melanocyte Growth Supplement(#S0025)가 보충된 Medium 254(#M254500)에서 배양하고 5% CO2 분위기에서 37ºC로 배양했습니다. 실험을 위해 계대 4와 7 사이의 기본 NHM을 사용했습니다. 배양된 세포의 생존력은 제조업체(DOJINDO, Tokyo, Japan)에서 설명한 대로 Cell Counting Kit-8(CCK-8)를 사용하여 평가했습니다.
4.3. 멜라닌 함량 측정
멜라닌 함량은 이전 보고서 [2-4]에 설명된 대로 결정되었습니다. 간략하게, B16 세포를 72시간 동안 -MSH(200 nM)의 존재 하에 지시된 농도의 글루코스로 처리하였다. NHM은 지시된 농도의 글루코스로 4일 동안 처리되었다. 그 후, 모든 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 60℃에서 1시간 동안 1N NaOH에 용해시켰다. 세포 용해물을 96-웰 플레이트로 옮기고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 값은 각 샘플 웰의 단백질 농도를 기준으로 정규화되었습니다.
4.4. 버섯 티로시나아제 활동 분석
우리는 표시된 포도당 농도가 버섯 티로시나제 활성에 미치는 직접적인 영향을 조사했습니다. 간단히 말해서, 100 µL의 포도당 함유 인산염 완충액을 버섯 티로시나아제(10 단위/웰)와 혼합하고 증류수에서 0.03% L-티로신 또는 L-DOPA 50 µL와 혼합했습니다. 그 후, 혼합물을 37℃에서 10분 동안 함께 배양하고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 잘 알려진 항티로시나제인 Kojic acid(KA)를 참조 화합물로 사용했습니다.
4.5. 세포내 티로시나제 활성 분석
간략하게, B16 세포 또는 NHM을 지시된 시간 동안 지시된 농도의 글루코스로 처리하였다. 그런 다음, 세포를 PBS로 세척하고 1% Triton X-100 및 0.1mM 페닐메틸-설포닐 플루오라이드를 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 6.8)에서 배양하여 용해시켰다. 그런 다음 세포 용해물을 12,000 rpm, 4ºC에서 20분 동안 원심분리했습니다. 세포 티로시나제를 함유하는 상청액을 수집하고 정규화를 위해 단백질 함량을 측정하였다. 세포 추출물을 인산염 완충액에서 L-DOPA와 함께 배양하고 도파크롬 형성을 30분 이내에 405 nm에서 흡광도를 측정하여 모니터링했습니다.
4.6. RNA 분리 및 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)
선택된 유전자의 상대적인 mRNA 발현을 결정하기 위해 제조업체의 지침에 따라 TRIzol(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하고 RT-premix(Bioneer, Seoul, South 한국). 정량적 PCR은 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. tyrosinase 및 Tyrp-1에 대한 qRT-PCR 프라이머 세트는 Applied Biosystems에서 구입했으며 TaqMan Gene Expression Assay 키트(Applied Biosystems)를 증폭에 사용했습니다. 표적 유전자 발현은 리보솜 단백질 측면 줄기 소단위 P0(RPLP0)을 암호화하는 하우스키핑 유전자의 발현으로 정규화되었다. 제조업체의 지침에 따라 비교 ∆∆Ct 방법을 사용하여 상대 양자화를 수행했습니다.
4.7. 웨스턴 블로팅
세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 다음 프로테아제 억제제(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 포함하는 얼음처럼 차갑게 변형된 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology, MA, USA)에 용해시켰다. 총 단백질 농도를 결정하고 단백질을 4-12% 구배 Bis-Tris 겔(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 SDS-PAGE로 분석하고 니트로셀룰로스 멤브레인(Thermo Fisher Scientific)으로 옮겼습니다. 이동 후 멤브레인은 5% 차단 용액으로 차단되었습니다. 멤브레인을 1차 항체와 함께 4oC에서 24시간 동안 배양하고 0.1% Tween-20(TBST)을 포함하는 Tris 완충 식염수로 세척하고 1시간 동안 과산화효소 결합 2차 항체에 노출시켰습니다. 실온에서. 멤브레인을 TBST로 세 번 헹구었습니다. Western blotting ECL 시약 (GE Healthcare, Hatfield, UK)을 사용하여 화학 발광 신호를 개발했습니다.
4.8. 3차원(3D) 인체 피부 등가물
MelanoDerm(MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA)을 인간 피부 조직 모델로 사용했습니다. 이 실행 가능하고 재구성된 3D 인간 피부 등가물은 흑인 기증자로부터 파생되었으며 정상적인 멜라닌 세포와 각질 세포를 포함합니다. MelanoDerm은 EPI-100-NMM-113 배지(MatTek Corp, Ashland, MA, USA)의 공기-액체 계면에서 성장되었습니다. 포도당 처리 전에 조직을 1mL PBS로 세척하여 잔류 화합물을 제거했습니다. 포도당은 PBS에 용해되었습니다. 포도당의 최종 농도는 2%였습니다. 대조군 샘플은 PBS로만 처리하였다. 포도당은 1, 4, 6, 8, 11, 13, 15일에 MelanoDerm에 적용되었습니다. 18일 후 MelanoDerm 조직을 4% 완충 포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매한 다음 3μm 두께로 절단하고 H&E 및 F&M 염색. 조직 샘플의 생존력은 제조업체(DOJINDO, Tokyo, Japan)에서 설명한 대로 Cell Counting Kit-8(CCK-8)를 사용하여 평가했습니다. L* 값의 변화를 비교하여 MelanoDerm의 색소침착을 평가했습니다.
4.9. 2광자 여기 형광(TPEF) 이미징
3D 인간 피부 등가물에서 멜라닌 분포를 시각화하기 위해 이전 보고서에서 설명한 대로 TPEF 이미징을 수행했습니다[3,4]. 간략하게, 각 MelanoDerm 제제를 4 ºC에서 24시간 동안 4% 포르말린에 고정한 다음 PBS/0.1% BSA(소 혈청 알부민, Merck, Branchburg, NJ, USA)로 세척했습니다. 기저층에서 TPEF 이미지를 획득하여 멜라닌세포층의 세포내 멜라닌을 측정하였다. 측정 부피에서 멜라닌에 대한 상대 TPEF 신호 강도는 Image-Pro Premier 3D 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화되었습니다.
4.10. L-락테이트 분석
B16 세포를 12-웰 플레이트에 웰당 1.0 × 105개 세포로 시딩했습니다. 글루코스로 3일 동안 처리한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 L-락테이트 비색 분석 키트(Abcam, ab65331, Cambridge, UK)를 사용하여 세포외 락테이트 수준을 정량화하였다.
4.11. 통계 분석
데이터는 평균±SD(표준편차)로 표현하였고, 통계적 유의성은 Student's t-test로 결정하였다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
저자 기여:
개념화, H.-JK, JL 및 CSL; 데이터 큐레이션, SHL; 조사, SHL; 방법론, SHL, I.-HB 및 E.-SL; 감독, JL 및 CSL; 작문 - 원본 초안, SHL 및 CSL; 쓰기—검토 및 편집, JL 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.
자금 조달:
본 연구는 교육부의 지원으로 한국연구재단(NRF)의 기초과학연구사업(지원번호: 2018R1D1A1B07049402)의 지원으로 수행되었습니다.
이해 상충:
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
약어
-MSH -멜라닌 세포 자극 호르몬
Tyrp-1 티로시나제 관련 단백질 1
MITF 소안구증 관련 전사 인자
NHM 정상 인간 멜라닌 세포
TPEF 2광자 여기 형광
LXR 간 X 수용체
AHA 알파 하이드록시산
H&E 헤마톡실린 및 에오신
F&M 폰타나-마송
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