Cistanche의 배당체는 혈관 치매의 쥐 모델에서 학습과 기억을 향상시킵니다.

더 많은 information:ali.ma@wecistanche.com 을 위해

J. CHEN1,2, S.-N. 저우1, Y.-M. ZHANG2, Y.-L. 펭2, S. WANG2

1신경학과, 산동 대학의 Qilu 병원, 지난, 중국. & 뇌 과학 연구소, 산동 대학, 산동, P.R. 중국

2신경학과, 내몽골 자치구 인민 병원, P.R. 중국

Jin Chen과 Yan-Mei Zhang은이 연구에 동등하게 기여했습니다.

추상적인.– 목표:시스탄체의 배당체(GC)는 장 신에서 추출됩니다.시스탄체중국 약초로 널리 사용됩니다. 이 연구는 GC가 혈관성 치매 (VD)에 미치는 영향을 평가하는 것을 목표로합니다.

재료 및 방법: VD 모델은 14일 동안 식염수, GC(10mg/kg 체중/D, I.P.) 또는 옥시라세탐(450mg/kg 체중/D, i.P)을 매일 투여받은 성인 Wistar 랫트의 양측 공통 경동맥의 합자에 의해 확립되었습니다. Morris Water Maze 테스트는 쥐의인지 성능을 중요하게 평가했습니다. 해마를 해부하고 프로테오믹스 및 면역조직화학 분석을 실시하였다. 결과: GC 그룹은 수술 후 나흘 및 오일 만에 VD 그룹보다 탈출 대기 시간이 현저히 낮았다. 그들은 sham-operated group 및 oxiracetam 대조군과 비교했을 때 유의한 차이를 보이지 않았다. 해마에서, GC 그룹에서 21개의 단백질 스팟은 VD 그룹과 비교하여 상이한 발현 수준을 보였다. 여기에는 유의한 차이를 보인 네 개의 단백질이 포함되었다: 세 개의 상향조절된 단백질 티오레독신-유사 단백질 1, 이중-특이성 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 1, 및 디히드로피리딘-나제-관련 단백질 2 (CRMP-2), 및 하나의 하향조절된 단백질 글루타티온 신테타제. 면역조직화학 분석은 P-타우 단백질 수준이 가짜 조작군에서보다 VD 모델군에서 유의하게 더 높았다는 것을 보여주었다(p< 0.05).="" after="" gc="" treatment,="" p-tau="" protein="" level="" in="" vd="" model="" rats="" showed="" a="" significant="" decrease="" compared="" with="" the="" vd="" group="" treated="" with="" saline="" (p="">< 0.05).="" conclusions:="" the="" gc="" plays="" a="" critical="" role="" in="" protecting="" the="" hippocampal="" neurons="" in="" the="" vd,="" by="" decreasing="" p-tau="" phosphorylation="" and="" increasing="" the="" crmp-2="" expression="" level.="" pharma-="" ecological="" manipulation="" of="" gc="" offers="" a="" new="" opportunity="" for="" vd="">

핵심 단어:

혈관성 치매, 시스탄체의 배당체, 프로테오믹스, P-타우, 디하이드로피리미디나제-관련 단백질 2.

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소개

혈관성 치매 (VD)는 두 번째로 이어지는 노인성 치매이며 주로 허혈성 뇌 혈관 질환으로 인해 발생합니다. VD는 이질적인인지 장애를 유발하며, VD의 진행을 치료하거나 예방하는 새로운 효과적인 치료 약물이 필요합니다1. 그러나 뇌 허혈에 의해 유발되는인지 장애를 증명하는 효과적인 중국 허브는 아직 없습니다.

시스탄체(GC)의 배당체는 신경 보호 효과가 있는 허브로 널리 사용되고 있다. Her- ba Cistanches 추출물은학습과 기억뉴런 세포 분화, 신경돌기 성장 및 시냅스 형성을 촉진함으로써 마우스의 2. 시스탄체의 배당체는 소뇌 과립 뉴런의 아폽토시스를 방지하고 카스파제-3 및 카스파제-83의 활성화를 억제함으로써 항아폽토시스 효과를 발휘할 수 있다. Herba Cistanches의 주요 활성 성분 인 Echinacoside는 Trk 신호 전달을 활성화하여 로테논 인 배심원으로부터 신경 세포를 보호하기에 충분합니다4. 그러나 GC가 VD의인지 장애를 향상시키는 메커니즘은 아직 크게 알려지지 않았습니다.

타우 단백질은 뉴런 미세소관을 안정화시키는 뉴런 미세소관 관련 단백질이다. 타우 단백질 (P-tau)의 인산화는 미세 소관과 상호 작용하고 im-pacts 시냅스 전달에 영향을 미칩니다. 신경 세동 엉킴 (NFTs)의 축적은 P-타우 단백질로 구성되며 알츠하이머 병 (AD)5의 주요 특징 중 하나입니다. VD와 AD가 가장 흔한 두 가지 치매 질환이라는 것은 잘 알려져 있습니다. 그들은 고혈압, 당뇨병 및 고 콜레스테롤 혈증과 같은 혈관 위험 요소와 공통적 인 상관 관계를 공유합니다. 따라서, P-타우는 또한 VD에 연루될 수 있다.

우리는 GC가 미치는 영향을 평가했습니다.학습-기억 기능VD의 래트 모델에서 VD 래트의 해마에 대한 프로테오믹스 및 면역조직화학 분석을 수행하여 GC의 신경 보호 효과에 대한 통찰력을 제공하였다. 우리의 결과는 GC가향상된 학습 및 기억력VD 래트에서, VD 래트에서 P-타우와 같은 단백질의 수준을 변화시켰다.

재료 및 방법

마리

6개월된 수컷 위스타 래트(체중 230-270 g)를 중국 후베이성의 실험 동물 센터에 의해 제공하였다. 모든 실험 동물 절차는 중국 우한 No. 1 병원의 동물 관리 지침 및 지역 윤리 규정에 따라 수행되었습니다. 윤리 승인 번호는 00014834입니다. 동물들은 25°C에서 케이지당 4마리씩 그룹으로 따로 수용되었으며, 12시간의 빛/12시간의 암흑주기와 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 동물 (n = 45)은 무작위로 네 개의 그룹에 할당되었다 : 모델 그룹 (n = 12), 가짜 조작 그룹 (n = 11), GC- 처리 그룹 (n = 12) 및 옥시 라세탐 처리 대조군 (n = 10).

양측 공통 경동맥 결찰 (2-VO)

10 % 염소 수화물 (천진 다마오 화학 시약 공장 시약, 천진, 중국)으로 깊은 마취하에 (350 mg / kg 체중,

i. p.), 양측 공통 경동맥(CCA)을 주변 조직으로부터 조심스럽게 분리한 다음, 봉합사와 단단히 결찰하였다. 이후 피부가 재건되고 쥐는 실온에서 유지되고 소생술 될 때까지 홈 케이지로 돌아 왔습니다. Sham-operated 대조군 래트는 CCA 라이게이션 없이 동일한 외과적 절차를 거쳤다. VD 래트는 수술 직후 GC (10 mg/kg 체중/d, i.p.) 또는 옥시라세탐 (450 mg/kg 체중/d, i.p)으로 14일 연속으로 치료하였다. 모델 그룹에는 동일한 부피의 정상 식염수를 주사하였다.

모리스 워터 미로 테스트

MWM 시험은 앞서 기술된 방법7에 따라 수행되었다. 시험 영역은 물 (25 ± 1 °C)으로 채워진 원형 수영장으로 구성되었으며, 쥐가 물 표면 아래 1cm 아래의 수중 플랫폼을 볼 수 없도록 우유로 불투명하게 만들었습니다. 풀은 네 개의 사분면(구역 I, II, III 및 IV로 레이블이 지정됨)으로 나뉘어졌으며 플랫폼은 구역 II에 잠겨 있었습니다. 시각적 단서가 시험실 벽에 놓여졌습니다. 동물들은 네 개의 시작 사분면 점 중 하나에 물 속에 놓여졌고, 이는 시험 전반에 걸쳐 무작위로 다양했다. 쥐는 플랫폼을 찾아 15 초 동안 앉기 위해 2 분을 받았다. 주어진 시간 내에 위치를 찾지 못한 쥐는 부드럽게 플랫폼으로 안내되었고 15 초 동안 그 위에 머물기 위해 알-로우드되었습니다. 자동 추적 시스템을 사용하여 각 구역의 수영 경로, 대기 시간, 수영 거리 및 시간을 기록했습니다. 모든 래트는 후속 분석을 위해 MWM 시험 2주 후에 희생되었다.

단백질 추출

10% 클로랄 하이드레이트를 사용한 깊은 마취 하에서, MWM 시험을 실시한 모든 래트는 탈항복하였다. 해마 조직은 얼음 위에서 신속하게 수확 된 다음 즉시 액체 질소에서 얼어 붙었습니다. 모든 조직을 모르타르 및 페슬을 사용하여 액체 질소 하에서 균질화시키고, 용해 완충액 (7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 2% CHAPS, 20 mM 트리스)에서 수집하였다. 불용성 입자는 4°C에서 20분 동안 12,000 rpm에서 원심분리에 의해 제거되었다. 샘플 내의 오염된 핵산은 5분 동안 간헐적 음파 진동에 의해 파쇄되었다. 상층액은 상기와 동일한 조건에서 원심분리 후 수집하였다. 상청액의 단백질 농도는 브래드포드 분석법으로 측정하고, 상청액은 80°C에서 보관하였다.

이차원 젤 전기영동

단백질 분취량 (120 μg)을 350 μL의 부피로 재수화 완충액 (7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS, 1% wt/vol DTT, 0.5% IPG 완충액 및 브로모페놀 블루의 미량)으로 조정하였다. 등전 포커싱 (IEF)은 12분 동안 300 V에서 IPG 스트립 (pH 4-7, 크기 22 cm)에서 수행되었고, 18분 동안 700V, 1.5h의 경우 1500V, 3시간 동안 9900V, 6.5시간 동안 9990V, Ettan IPGphor II 시스템(GE ETTAN IPGPHOR3)에서 20시간 동안 600V. IEF 프로그램 후, 스트립을 IPG 평형 완충액 I (6 M 우레아, 2% SDS, 30% 글리세롤, 0.375M 트리스, pH 8.8, 20 mg/ml DTT 및 브로모페놀 블루의 트레이스)에서 평형화시킨 다음, 알킬화 (평형 완충제 중의 DTT 대신 25 mg/ml 요오도아세트아미드)에서 15분 동안 2-DE를 0.5% 아가로스 밀봉 접착제로 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔 (24 cm×19.5 cm×1.0 mm) 상에서 수행하였고, Ettan DALT Six 전기 영동 시스템 (GE ETTAN DALTsix, PA, USA)을 사용합니다. 전기영동은 2 W에서 45분 동안 수행되었고, 이어서 브로모페놀 블루가 겔의 바닥에 거의 도달할 때까지 4시간 동안 17 W에서 분리하였다. 단백질 스팟은 분석 겔에서 은 염색(톈진 다마오 화학 시약 공장)을 통해 시각화되었다. 2-DE 와셔는 각 그룹에 대해 삼중 및 세 개의 독립적인 단백질 추출로부터 형성된다.

제조용 젤 전기영동

래트의 4개 그룹으로부터의 단백질 샘플 (600 μg)을 상기 기재된 방법에 따라 2-DE를 실시하였다. 단백질 반점은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색(톈진 다마오 화학 시약 공장)을 통해 제조용 겔에서 시각화되었다.

이미지 수집 및 분석

젤 이미지를 2-DE 이미지 스캐닝 시스템(UMAX Powerlook1100, VT, USA)에서 캡처하고 이미지 마스터 2D 플래티넘 5.0 소프트웨어(GE, PA, USA)로 분석했습니다. 단백질 반점을 자동으로 검출한 다음 수동으로 편집하여 줄무늬, 얼룩 및 아티팩트를 제거했습니다.

매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 질량 분광법(MALDI-TOF-MS)

펩티드 질량 핑거프린팅 및 후속 분석을 위해, 겔을 슬라이스하고, 쿠마시-염색된 스팟을 탈염색하고, 100 mM 중탄산암모늄 및 아세토니트릴로 세척하고, 60°C에서 40분 동안 DTT로 환원시킨 다음, 어둠 속에서 30분 동안 IAA에 의해 알킬화시켰다. 겔은 하룻밤 사이에 37°C에서 50 mM 중탄산암모늄 (pH 8.6) 중의 12 ng/μl 개질된 트립신 용액 50 μL에 포함되었다. 펩티드를 1% 포름산/2% 아세토니트릴로 겔 플러그로부터 추출하고 C-18 Zip-Tips를 사용하여 농축하였다. 다이제스트는 a-시아노 4-하이드록시신남산(50% 아세토니트릴 중 2mg/ml, 10mM 인산암모늄을 함유하는 0.1% TFA)을 매트릭스로 사용하여 MALDI 표적에서 스팟팅(4회 반복실험)하였다. 스펙트럼은 4700 MALDI TOF/TOF 질량 분광계(Applied Biosystems, NY, USA)에서 획득되었으며 GPS ExplorerTM(Applied Biosystems) 소프트웨어에 의해 분석되었습니다.

면역조직화학

코로나 해마 절편을 파라핀에 매립하기 전에 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 4μm 두께의 절편으로 절단하였다. 출발-마무리된 관상동맥 해마 절편을 포스페이트 완충 식염수 중 3% H2O2를 사용하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭하도록 처리하였다. 비특이적 면역반응은 실온에서 15분 동안 차단하였다. 이어서, 절편을 실온에서 30분 동안 P-타우 항체 및 이차 항체와 함께 인큐베이션하고, 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (다코, 도쿄, 일본) 반응 후에 가시화하였다. 이미지는 광학 현미경 (올림푸스, 도쿄, 일본)을 사용하여 캡처하고 Photoshop 소프트웨어 (버전 7.0, Adobe, San Jose, CA, USA)를 사용하여 처리했습니다.

통계 분석

정량적 데이터는 SD± 의미로 표시하였다. 분산의 양방향 분석(ANOVA)은 SPSS 10.0 분석 소프트웨어(SPSS Inc., 시카고, 일리노이, 미국)를 사용하여 수행하였다. p< 0.05="" was="" considered="">

결과

GC는 VD 쥐의 학습과 기억을 촉진합니다.

VD 래트 모델의 인지 기능에 대한 GC의 효과를 평가하기 위해, MWM 테스트를 수행했습니다. MWM 시험에서, GC 그룹은 수술 후 4 및 5 일에 VD 그룹보다 현저히 낮은 탈출 대기 시간을 보였지만 sham-operated 그룹 및 oxiracetam 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않았다 (표 I). 이 데이터는 GC가 VD 쥐의 학습과 기억을 촉진한다는 것을 암시합니다. GC는 VD 쥐의 해마의 프로테오믹 프로파일을 변경합니다.

래트 해마의 프로테오믹 분석에 의해, 우리는 GC 그룹에서 21개의 단백질 스팟이 VD 그룹과 비교하여 상이한 발현 수준을 나타냄을 발견하였다. 그 중에서도, 네 개의 단백질이 GC 래트의 해마에서 유의한 차이를 나타냈다 (표 II): 세 개의 상향조절된 단백질을 포함하는 티오레독신 유사 단백질 1 (TXNL 1), 이중 특이성 미토겐-활성화 단백질 키나아제 1 (MAPKK 1), 및 디히드로피리미디나제 관련 단백질 2 (DPYSL2); 및 하나의 하향 조절된 단백질 글루타티온 신테타제 (GCL). DPYSL2의 전형적인 2차원 겔 전기영동(2-DE) pro-파일을 도 1에 나타내었다.

GC는 VD 쥐의 해마에서 P-타우 수준을 조절합니다.

면역조직화학 분석에 의해, 우리는 P-타우 단백질 수준이 가짜 조작군에서보다 VD 모델군에서 유의하게 더 높다는 것을 발견하였다(p< 0.05).="" after="" the="" gc="" treatment,="" p-tau="" protein="" level="" in="" vd="" model="" rats="" showed="" a="" significant="" decrease="" compared="" with="" the="" vd="" group="" treated="" with="" saline="" (p="">< 0.05)="" but="" showed="" no="" significant="" difference="" compared="" with="" the="" oxiracetam="" control="" group="" (figure="">

토론

VD는 주로 뇌혈관 질환에 의해 유발되는 기억력 및 인지 기능의 손상으로 인한 것이다8,9,10,11. 2혈관 폐색(2VO) 모델은 간단하고 안정적이며 뇌 허혈의 표준 모델로 인식되고 있습니다. 이 연구에서는 VD 동물 모델을 확립하기 위해 2VO 모델을 사용했습니다. MWM 테스트를 통해 VD 그룹이 가짜 운영 그룹에 비해인지 능력이 감소한 것으로 나타나 VD 모델을 성공적으로 확립했음을 확인했습니다. 이 모델을 바탕으로, 우리는 GC 치료가 VD 쥐의 공간인지 능력을 양성 대조군 인 oxiracetam과 비슷한 정도로 향상시킨다는 것을 발견했습니다. 이러한 데이터는 GC가 VD에서 공간 학습 및 메모리 손상을 촉진 할 수 있음을 나타냅니다.

GC가 VD에 신경 보호 효과를 발휘하는 메커니즘을 조사하기 위해, 우리는 VD 래트의 해마에서 차등적으로 발현된 단백질을 스크리닝하기 위한 프로테오믹 접근법을 채택했습니다. 우리는 에너지 대사, 단백질 폴딩, 신호전달 경로 및 세포골격과 관련된 몇몇 단백질이 GC로 처리된 VD 래트의 해마에서 대조군으로 식염수로 처리된 것과 비교하여 상이한 발현을 나타냈다는 것을 발견하였다.

차등적으로 발현된 단백질 중 하나는 DPYSL2이며, 이는 콜랩신 반응 매개자 단백질-2(CRMP-2)로도 알려져 있으며, 이는 원발성 해마 뉴런에서 성장하는 축삭돌기의 원위 부분에 풍부하며 축삭 분화 및 뉴런 파생물에 매우 중요합니다12,13. 또한, CRMP-2는 미세소관 조립을 촉진하고 Ras 신호전달을 매개하여 다중축삭 형성 및 뉴런 극성을 향상시킨다14,15. 본 연구에서, CRMP-2의 단백질 발현 수준은 VD 그룹에 비해 GC 그룹에서 2.28배 증가하였으며, 이는 VD에서 신경망 형성 및 신경세포 극성의 유지의 잠재적 복구 기작에서 CRMP-2에 대한 중요한 역할을 시사한다.

더욱이, 본 연구에서 우리는 VD 모델 그룹에서 더 높은 P-타우를 발견했지만, GC 처리 후 P-타우 발현은 더 낮았다. 타우 단백질은 뉴런의 형태 형성에 중요한 역할을합니다. 특정 병리학적 상황에서, P-타우 단백질은 미토콘드리아 기능에 영향을 미침으로써 뉴런에 독성이 있는 비정상적인 응집체를 생성할 수 있다15. 이전 연구에 따르면 GC는 항산화 기능16,17,18로 미토콘드리아 에너지 대사를 향상시킬 수 있습니다. 흥미롭게도, CRMP-2 인산화는 또한 AD에서 신경세동 엉킴의 구성성분으로 특성화되었다.

결론

CRMP2는 일반적으로 AD 환자의 뇌에서 사이클린 의존성 단백질 키나아제-5(Cdk5) 및 글리코겐 신타아제-3(GSK3)에 의해 인산화되며, NFTs19,20을 생성하기 위해 타우 단백질을 인산화하는 동일한 키나아제이다. GC가 Cdk5 및 GSK3 활성을 조절함으로써 VD에서 P-타우 및 CRMP2 발현 lev-el을 조절하는지 여부를 조사하기 위해 추가 연구가 필요하다21,22,23. 요약하면, 우리의 데이터는 GC가 P-타우 인산화를 감소시키고 CRMP-2 발현 수준을 증가시킴으로써 VD의 해마 뉴런을 보호하는 데 중요한 역할을한다는 것을 시사합니다. GC의 약리학 적 조작은 VD에 대한 치료법 개발을위한 새로운 기회를 제공합니다.

승인을

이 연구는 Taishan Scholars 및 National Natural Science Fund (30960520)를위한 특별 재단의 지원을 받았습니다.

이해 상충

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

참조

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