자연적으로 발생하는 플라보노이드인 Gossypitrin은 철 유도 신경 세포 및 미토콘드리아 손상을 약화시킵니다 3부
Mar 16, 2022
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4. 재료 및 방법 4.1.시약
모든 시약은 Sigma-Aldrich Corp.(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. Gos의 스톡 용액은 DMSO에서 제조되었고 1/1000(o/o) 희석으로 세포 배양물 또는 미토콘드리아 제제에 첨가되었습니다.
4.2.식물 재료
Talipariti elatum (Sw.)(Syn. Hisbiscus elatus Sw.)(아욱과)의 식물 재료(꽃)는 La Lisa, Institute of Pharmaceutical and Food Sciences, Institute for Research and Biological Assessment 주변 지역에서 2020년 3월 동안 수집되었습니다. , 쿠바, 하바나. 그들은 바우처 표본이 기탁된 Camagüey 대학 "Ignacio Agramonte Loynaz" 식물표본관 전문가에 의해 인증되었습니다: G. Pardo., HPC{1}}(HIPC).
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4.3. 추출물 및 샘플 준비
그만큼에탄올추출물은 이전에 보고된 바와 같이 Telatum의 붉은 꽃에서 준비되었습니다[29]. 회전 증발 후, 고형물은 재결정화 절차에 의해 정제되었습니다[29]. 분리된 화합물은 1D 'H(400MHz) 및 13C(100MHz) NMR에 의해 특성화되었습니다. NMR 데이터 처리는 Windows용 MestReNova 소프트웨어 버전 6.1.{9}}(보충 자료, 그림 S{10}}S3)으로 수행되었습니다. Gos에서 수집한 NMR 데이터를 이전 결과와 비교했습니다[56].
4.4. UV/Vis 및 IR 분광학 연구
UV/Vis 스펙트럼은 10mm 광학 경로 길이의 석영 큐벳에서 수행되었고 흡광도는 UV-Vis에 기록되었습니다.분광 광도계상온에서 웨이브 스캔 소프트웨어(SWIFT I, 1.2)가 있는 컴퓨터에 결합된 Amersham BioSci(Little Chalfont, UK)의 Ultrospec 2100 Pro. Gos와 철 이온 간의 상호 작용은 UV/Vis 스펙트럼의 변화를 모니터링하여 측정되었습니다. Gos와 Fe(II) 이온 사이의 화학량론적 비율을 결정하기 위해 Job의 방법이 사용되었습니다. Gos 및 Fe(lI)의 스톡 용액은 각각 메탄올 및 인산염 완충액에서 매일 제조되었습니다. IR 스펙트럼은 샘플을 준비하기 위해 브롬화칼륨 펠렛을 사용하여 4000-400 cm-I 범위에 걸쳐 JASCO FI/IR-440 분광계에서 기록되었습니다.
4.5. 세포 배양
생쥐해마HT{0}} 세포(ATCC)는 10% FCS, L-글루타민(1mM) 및 페니실린/스트렙토마이신(1%)이 보충된 DMEM 배지에서 배양되었고, 가습된 5% CO2에서 37도를 유지하였다. 부란기. 세포(2×104개 세포/웰)를 37℃에서 24시간 동안 200μL의 배양 배지에서 96-웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 접종했습니다.
4.6. 세포 산화성 손상 유도 및 고스 치료
Gos({0}}.001-100 μM)의 신경보호 작용은 Gos 또는 Trolox(500 μM), FeCl2(100μM)와 24시간 동안 동시 배양을 통해 HT-22에서 테스트되었습니다. 및 구연산염(1mM). 24시간 후, 세포 상층액을 제거하고 [{10}}(4,{12}}디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드](MTT) 비색 분석.
4.7. 세포 생존력 분석
처리 후, 세포(2×104)를 37℃에서 3시간 동안 10 uM MTT와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 착색된 MTT 유도체를 50μL의 DMSO에 용해시키고 마이크로플레이트 리더(FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany)에서 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 처리되지 않은 세포의 대조군에 대한 백분율로 표시됩니다.
4.8.HT-22 세포에서 미토콘드리아 막 전위(△Y) 분석
미토콘드리아막 전위는 형광 양이온 프로브 로다민 123의 세포 보유에 기초하여 평가되었습니다[57,58]. Gos(0.001-100 μM) 또는 Trolox(5{13}}0 μM)가 없거나(대조군) 철/아스코르브산염 손상 2시간 후, 신경 세포(2 ×10*)를 1μM 로다민 123과 함께 10분간 배양했습니다. 원심분리 및 0.1% Triton X{15}} 1mL에 재현탁한 후 마이크로플레이트 판독기(FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany) 505/535 nm 여기/방출 파장 쌍에서. 데이터는 처리되지 않은 세포의 대조군에 대한 백분율로 표시됩니다.
4.9.ATP 분석
세포 ATP는 AY와 동일한 조건에서 반딧불이 루시페린/루시페라제 분석 시스템[59]에 의해 결정되었습니다. 생물발광은 마이크로플레이트 판독기(FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany)의 발광 옵션을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 Sigma-Aldrich 분석 키트로 측정되었습니다.
4.10.동물
수컷 Wistar 랫트(200g)는 Center for the Production of Lab-oratory Animals(CENPALAB, 스페인 약어에 따라 Havana, Cuba)에서 입수하였고, 온도-실험에 앞서 1주일 동안 동물 보호 시설에 수용하였다. 통제된 환경(22-24도), 12-시간의 명암 주기가 있고 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있습니다.
4.11.미토콘드리아 분리
쥐의 전뇌 미토콘드리아는 이전에 설명한 대로 차등 원심분리에 의해 분리되었습니다[60]. Digitonin 10%는 시냅토솜을 파괴하고 비-시냅토솜과 시냅토솜 미토콘드리아의 혼합물을 생성하는 데 사용되었습니다. 전체 절차는 4도에서 수행되었습니다. 호흡 조절 비율(상태 3/상태 4 호흡 수)은 5mM 숙시네이트를 기질로 사용하여 측정했을 때 항상 4.5~6.0 범위였습니다.
4.12. 지속적인 모니터링 미토콘드리아 어세이
미토콘드리아 막 전위는 495/586 nm 여기/방출 파장에서 마이크로플레이트 판독기(FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany)에서 10 μM 사프라닌 O를 프로브로 사용하여 분광형광법으로 측정되었습니다. 이러한 분석은 0.1mM EGTA 및 2mM K, HPOA의 존재하에 수행되었습니다. 미토콘드리아 팽창은 540 nm에서 겉보기 흡광도의 감소로부터 분광광도계로 추정되었습니다. 분석을 위해, 미토콘드리아는 30도에서 125mM 자당, 65mM KC 및 10mM HEPES-KOH(pH 7.4)로 구성된 표준 배지에서 5mM 포타슘 숙시네이트(2.5uM 로테논)로 활성화되었습니다.
4.13.지질 과산화 분석
지질 과산화는 말론디알데히드(MDA) 생성으로부터 추정되었습니다[28,62]. 미토콘드리아(1 mg/mL)는 37℃에서 4mM tert-부틸하이드로퍼옥사이드 또는 50uM Fe(II) + 1mM 시트르산나트륨에 노출되었습니다. MDA 농도는 소광 계수(c{9}}를 사용하여 계산되었습니다. 56×105M-1.cm-1).
4.14. Fe(II) 농도 측정
Fe(II)의 농도는 1,{5}}페난트롤린(5mM)과의 적색 착체 형성에 의해 10mM 인산염 완충액 pH 6.5(2mL)에서 결정되었습니다[24,28].
4.15.산소 소비 모니터링
Fe(II) 산화와 관련된 O의 소모량은 자기장 교반기가 장착된 1.{2}}ml 유리 챔버에서 Clark-type 전극(Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, UK)으로 측정되었습니다. 30도 . 산소 소비율(ROC)은 분당 nmol O2/mL로 표시되었습니다.
4.16.2-데옥시리보스 산화 분석
하이드록실("OH) 라디칼의 형성은 2-데옥시리보스가 MDA로 분해되는 방식에 따라 추정되었으며, 이는 소멸 계수(e{1}}.56×10도 M-1· cm-) 이전에 보고된 대로 [26,27].
4.17. Gos-Fe(II) 착물 검출
Fe(ⅡI)(FeCl,0.4-1.6μM)를 2mM 시트레이트 및 1.6μM Gos를 함유하는 2mL(10mM) 인산염 완충액(pH 6.5)에 첨가하였다. 200-600 nm의 파장 스캔은 28도에서 Hitachi 2001 분광 광도계(Hitachi, Tokyo)에서 수행되었습니다.
4.18. 통계 분석
GraphPad Prism 5.{1}}(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용했습니다. 일원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 다음 쌍별 비교를 위해 Student-Newman-Keuls 사후 검정을 수행했습니다. p가 있는 결과<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">
보충 자료: 다음은 온라인에서 사용할 수 있습니다. 그림 S1: DMSO-do에서 gossypitrin의 1H-NMR(400 MHz) 스펙트럼, 그림 S2: DMSO-d에서 gossypitrin의 13C-NMR(101 MHz) 스펙트럼, 그림 S3: DMSO-dg에서 gossypitrin의 HSQC 스펙트럼. 표 S1: 'H(400MHz) 및 13C(100MHz) 데이터 대 이전 보고서 비교.
저자 기여:개념화, G.LP.-A.; 방법론, MAB-V., RFD, YM-P. 및 GLP-A.; 검증, MAB-V., JM-P., YM-P 및 RFD; 형식 분석, YM-P, JM-P, RF-A. 및 GLP-A.; 조사, MAB-V, AA-L., DA-A., YM-P., RFD 및 GLP-A.; 데이터 큐레이션, MAB-V.YM.-PJM-P. 및 RF-A.; 쓰기 - 원본 초안 준비, MAB-V.; 쓰기 - 검토 및 편집, IM.-P, RF-A., YM-P 및 GLP-A. 시각화, YM-P. 및 GLP-A.; 감독, GLP-A.; 자금 조달, GLP-A.모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 동의했습니다.
자금 지원: 이 연구는 VLIR(벨기에)의 자금 지원을 받았습니다. 부여 번호 CU2018TEA457A103, 그리고Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente(쿠바); 부여 번호 PN223LH010-035. APC는 VLIR(벨기에)에서 자금을 지원했습니다. 부여 번호 CU2018TEA457A103.
기관 검토 위원회 성명서:이 연구는 헬싱키 선언의 지침에 따라 수행되었으며 쿠바 하바나 대학교 제약 식품 과학 연구소의 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(프로토콜 코드 IFAL-CEI 087-2019, 2019년 10월) .
사전 동의서: 해당 사항 없음. 데이터 가용성 선언문: 해당 없음.
감사의 말:이 작업은 Vlaamse Interuniversitaire Raad(VLIR)-Belgium/Ministerio de Educacion Superior(MES)-Cuba Project CU2018TEA457A103(문서 처리 수수료도 포함됨)과 "Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente(쿠바), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". 이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
샘플 가용성: 화합물의 샘플은 해당 저자로부터 사용할 수 있습니다.
