Graham-2023-학습으로 고유한 성적표 생성
Dec 07, 2023
추상적인:
학습은 여러 시간 규모에서 청각 피질의 신경생리학적 가소성을 유도할 수 있습니다. 며칠, 몇 주, 심지어 평생 동안 지속되는 청각 피질 기능의 지속적인 변화에는 학습 유도 유전자 발현이 필요합니다. 실제로, 새로운 전사는 일시적인 경험이 행동에 지속적인 영향을 미치는 장기 기억으로 변환되는지 여부를 결정하는 분자적 결정 요인입니다.
과학과 기술의 지속적인 발전과 함께 인간의 삶의 과정에서 많은 마법적 생명 현상이 나타났으며, 그 중 가장 연구에 가치 있는 것은 기억입니다. 기억은 인간의 고도화된 신경 활동의 중요한 부분이며, 인간 진화 이후 발생한 다양한 사건의 기록과 축적이기도 하다. 그렇다면 유전자 발현과 기억 사이에는 관계가 있을까요? 대답은 '예'입니다.
첫째, 기억에 대한 유전자의 영향은 명백합니다. 이는 단일 염기 다형성(SNP) 및 기타 방법을 통해 다양한 기억 관련 분자 및 단백질의 발현을 조절할 수 있습니다. 이는 뉴런 간의 통신 효율성에 영향을 미칠 수 있으며, 이로써 사람의 인지적, 개념적, 정서적 및 기타 특성에 영향을 미쳐 기억의 질을 나타냅니다.
둘째, 기억은 유전자 발현에 일정한 영향을 미칠 수도 있습니다. 우리의 학습, 기억, 사고 과정에서는 뇌의 신경 활동의 변화뿐만 아니라 많은 유전자와 분자의 조절과 개입도 이루어집니다. 이러한 유전자와 분자의 조절은 우리의 장기 기억에 존재하는 감정과 경험에 상응하는 흔적을 기록하고 결국 유전자에 저장되게 됩니다.
마지막으로, 긍정적인 태도와 장기 기억 능력 사이에는 상호의존성이 있습니다. 행복한 기분은 학습과 사고 과정에서 더 집중하고 집중력을 높여 기억력 향상에 도움이 됩니다. 장기 의도적 기억은 또한 뇌의 새로운 신경 연결과 구조의 형성을 촉진할 수 있으며, 이는 미래의 학습과 기억에도 매우 도움이 됩니다.
그러므로 우리는 유전자 발현과 기억 사이에 상관관계가 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 우리는 의도적인 기억, 낙천주의, 긍정적인 사고를 통해 기억력을 촉진하고 향상시킬 수 있으며, 이는 또한 더 나은 신체적, 정신적 건강을 달성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그래야만 우리는 사회와 인류 발전에 더 나은 봉사를 할 수 있습니다. 기억력 향상이 필요함을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라는 기억력 향상이라는 독특한 효능이 많은 중국 전통 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 다진 고기의 효능은 산, 다당류, 플라보노이드 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 방식으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
그러나 청각 학습, 기억 및 후천적인 소리 관련 행동을 지원하는 청각 피질 유전자는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 보고서는 청각 기억 형성의 기초가 되는 것으로 생각되는 청각 피질 내에서 학습으로 인해 유발된 유전자 발현의 게놈 전반에 걸친 변화를 확인한 최초의 보고서입니다. RNA 시퀀싱을 통한 유전자 강화 프로필에 대한 생물정보학적 분석을 통해 콜린성 시냅스 및 신경활성 수용체 상호 작용을 포함하는 생물학적 경로가 확인되었습니다.
이번 연구 결과는 성인 뇌의 장기 청각 기억 형성을 지원하는 대뇌 피질 기능의 변화를 뒷받침하는 주요 후보 효과기를 특징으로 합니다. 확인된 분자와 메커니즘은 성인기의 청각 기능에 대한 장기적이고 소리 관련 변화를 촉진하는 잠재적인 치료 목표이며 이제 미래의 유전자 표적 조사에 가장 적합합니다.
원고:
학습 및 기억 분야에서 잘 받아들여지는 개념은 기억이 처리되는 곳에 기억이 저장된다는 것입니다(Nadel & Hardt, 2011). 기억 강화로 알려진 생물학적 사건은 감각 경험에 의해 유발된 일시적인 신경 표상을 안정화할 수 있습니다(Lechner, Squire,& Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). 기억 강화를 시작하는 근본적이고 진화적으로 보존된 메커니즘은 전사와 번역이며, 이는 각각 유전자와 그에 따른 단백질 생성물의 활성 발현으로 정의됩니다(Alberini &Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).
우리는 건전한 차별 학습이 청각 피질 내에서 새로운 유전자 발현을 유도한다는 가설을 세웠습니다. 소리 신호의 매우 구체적인 표현은 나중에 소리 신호 행동을 안내하는 장기 기억(몇 시간에서 며칠)으로 통합되어 일시적인 경험(초 및 분)보다 오래 지속될 수 있습니다. 독특한 지역 전사체 프로파일이 기억 강화를 담당하는 것으로 생각되지만(Katzman, et al., 2021), 중추 청각 시스템에서 기억 형성을 지원하는 학습 유발 전사 이벤트는 심각하게 과소 설명됩니다.
대조적으로, 청각 피질은 신경 생리학적 변화 수준의 청각 학습 및 기억에 대한 연구에서 특히 수용 영역 및 음위 주제 지도에서 매우 잘 설명되었습니다(Schreiner &Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011). 여러 시간 규모(Froemke & Martins)를 포함하여 피질 및 피질-후갈 연결성(Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015) , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David & Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). 더욱이, 신경생리학적 변화는 행동, 예를 들어 신호에 따른 행동(Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), 주의(Fritz et al., 2007; Elhilali et al., 2007) 및 소리 신호에 대한 기억(Bieszczad & Lüthi, 2015)과 연관되어 있습니다. Weinberger 2010; Grosso 외, 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso, & Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).
청각 피질의 학습 유발 신경생리학적 가소성에 대한 수십 년간의 증거는 청각 기억의 공통된 행동 특성을 보여 주었고(Weinberger 2007a; 2007b), 청각 기억 통합을 위한 최고의 후보 영역이 되었습니다. 청각 피질을 생물정보학적으로 조사함으로써 우리는 적응성 청각 기능의 기초가 되는 신경가소성의 뇌 전반에 걸쳐 공통적이거나 뚜렷한 생물학적 게이트키퍼를 발견할 수 있는 편견 없는 기회를 활용합니다. 더 넓은 관점에서 볼 때, 지역 전사체 프로파일링은 기억 서비스 경험에 의해 감각 시스템이 어떻게 수정되는지에 대한 보다 완전한 이해로 이어질 수 있습니다.
청각 피질 내에서 식별된 학습 유발 전사체 프로필은 적응형 청각 처리를 지원하거나 손상시키는 프로세스의 새로운 생물학적 모델을 검증, 확장 또는 유도할 수 있습니다. 청각기억의 강화는 청각 피질 내의 세포 기능에 영향을 미치는 유전자 발현의 경험 의존적 변화의 산물일 가능성이 높습니다. 이는 소리에 의해 유발되는 신경생리학적 반응에 대한 지속적인 변화를 촉진하여 소리에 의한 행동을 변화시킵니다.
학습 유발 전사물을 식별하기 위해 해부학적으로 정의된 청각 피질 샘플에 대해 RNAsequencing(RNAseq)을 사용한 발현 프로파일링 분석을 수행했습니다(Bregma -3.10 mm, Interaural 6.90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) 물 제한을 받는 성인 쥐부터 바 프레스 훈련을 받은 쥐부터 물 보상을 위한 순수한 톤까지. 목표 순수 톤 주파수(5.0kHz, 65dB SPL)에 대한 응답은 보상을 받은 반면, 비목표(11.5kHz, 65dB SPL)에 대한 응답은 보상을 받지 못하고 다음 시도까지 시간을 연장하는 시간 초과 기간이 시작되었습니다.
이 2톤 식별 작업(2TD)은 지각적으로 어렵지 않습니다. 음향 주파수는 한 옥타브 이상 떨어져 있으며 설치류에 의해 쉽게 구별됩니다(Talwar & Gerstein, 1998). 오히려 행동 문제는 연관성이 있었습니다. 2TD 성능은 톤이 보상과 연관된 기억을 요구합니다(보상 없음 대비). 훈련된 쥐(N=8)는 3회 연속 일일 45-분 2TD 훈련 세션 후에 희생되었으며 소리에 익숙하지 않은 쥐 그룹(N=4)과 비교되었습니다. 이는 동물이 여전히 2TD 작업을 수행하는 훈련 초기 시점입니다. 초기 작업 획득은 몇 주 동안의 훈련에 걸쳐 행동에서 관찰된 2TD 성능의 이후 증가를 위한 단계를 설정하는 초기 학습 유도 전사 이벤트를 포착하는 것을 목표로 했습니다.
예를 들어, 평균 성과는 우연보다 높았지만 연장 훈련 후 90% 이상인 것과 비교하여 3일 후에는 66±7.81%에 불과했습니다(Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). 성공적인 소리 특이적 연관 기억과 관련된 유전자의 발현을 식별할 수 있는 기회를 활용하기 위해 우리는 학습 및 기억 형성에서 활동 의존적 유전자 발현의 후생유전적 조절을 목표로 하는 HDAC 억제제를 활용했습니다(McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al., 2017; Malvaez, et al., 2012). 중요한 것은, 10년 간의 연구를 통해 HDAC 억제가 소리 유발 청각 피질 반응(차량 관련)에서 학습 유발 신경생리학적 가소성을 촉진하고 청각 차별적 행동을 향상시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다(Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) 비인간을 포함합니다(Gervain, et al., 2013).
훈련된 동물의 절반은 HDAC 억제제인 RGFP966(N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; cu. 이하 주사)으로 치료되었습니다. 나머지 절반은 동일하게 교육을 받았지만 차량 솔루션을 관리했습니다(N=4; 일치하는 볼륨, cu 이하 주입, 그림 1a). 뇌수집 당시 그룹 간 2TD 성능에는 차이가 없었습니다(RGFP966: 61±5.0% vs. 차량: 71±7.0%; t(5.9166)=-1.21, p=0.272 웰치(Welch) t-테스트). HDAC 억제제 또는 비히클의 세션 후 주사 후 1시간, 청각 피질 내 억제제의 최고 농도와 일치하는 시점에 뇌를 즉시 수집하고 급속 냉동시켰습니다(Bieszczad et al., 2015).
이번 연구 결과는 청각 피질 내 연관 학습의 전사체 프로필을 최초로 확인한 것입니다. 수백 가지 유전자의 전사 수준에서 2가지 톤 식별 작업으로 인한 변화를 학습합니다(소리가 없는 것과 비교)(그림 1b). 계층적 클러스터링 알고리즘은 유전자가 고유하게 상향 조절되거나 하향 조절됨을 보여주었으며 청각 학습에 의해 유도된 피질 유전자 발현 이벤트의 복잡한 네트워크를 드러냈습니다(그림 2a).
농축 분석(iPathwayGuideTM; 영향 분석 방법)을 통해 콜린성 시냅스(차별적으로 발현된 유전자(DEG)/모든 유전자(ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection)가 상위 생물학적 경로로 확인되었습니다(표 1) . 이 결과는 신경생리학적 가소성 및 관련 청각 행동에 대한 청각 피질의 콜린성 신호 전달이 충분함을 강조한 1990년대 이후의 연구와 일치합니다(Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). HDAC 억제 하에서 학습에 의해 유도된 전사 수준은 동일한 방향으로 증폭되거나(고유한 유전자 전사 수준의 추가 증가 또는 추가 감소)(그림 2b) 단독 학습과 비교하여 둔화되었습니다(그림 2c). 이러한 조건에서 가장 중요한 생물학적 경로 중 하나는 신경 활성화에 중요한 효과기와 관련된 신경 활성 리간드-수용체 상호 작용(DEG/ALL: 30/194; p{16}}.016; 표 1)이었습니다.
또 다른 상위 경로는 세포외 기질 수용체(ECM-수용체) 상호작용이었습니다(DEG/ALL: 14/69; p{3}}.04; 표 1). ECM의 구성 요소는 피질 가소성과 기억 강화에 중요합니다(Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). 이러한 경로는 청각 기능의 지속적인 경험 의존적 변화를 촉진할 수 있는 콜린성 신호에 대한 잠재적인 대안, 아마도 보완적인 대안을 제공합니다(Ji, Gao, & Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). 청각 학습에 따라 발현이 변경되었지만 HDAC 억제에서는 더 이상 발현이 변경되지 않은 다른 유전자는 소리 관련 연관 기억보다는 작업의 절차적 조건과 관련이 있을 가능성이 높습니다. 예를 들어, 물 섭취의 항상성 조절을 위해 뇌에서 중요한 아펠린 신호 전달 경로(DEG/ALL: 20/116; p=0.0005)가 확인되었습니다(Hu, et al., 2021). 두 그룹의 훈련된 쥐(HDAC 억제 유무에 관계없이 학습) 간의 전사 수준을 직접 비교한 결과, 고유하게 차별적으로 발현되는 유전자(DEG)가 거의 없는 것으로 나타났습니다.
가장 가능성이 높은 DEG를 식별하는 데 사용된 임계값(p{0}}.05)은 Adamts13, U6, Rexo4 및 Cabin1만 차별적으로 표현된 것으로 나타났습니다(그림 2d). 따라서 HDAC 억제의 주요 효과는 다음과 같습니다. 소리 특정 기억을 보존하기 위해 고유한 유전자를 새로 모집하기보다는 정상적인 조건에서 청각 학습에 의해 유도된 유전자의 발현을 조절합니다. 함께, 이러한 발견은 성체 동물이 소리 단서 사이의 차별적 연관 관계를 학습함에 따라 훈련 초기에 청각 피질에서 대규모 전사체 변화가 발생한다는 것을 보여줍니다. 청각 기능을 촉진하기 위한 HDAC 억제에 대한 확립된 신경생리학적 및 행동적 보고와 함께, 이러한 발견은 청각 기억 형성의 성공을 결정하는 발현이 있는 유전자를 구별하기 위해 HDAC 억제제를 사용하는 전술을 뒷받침합니다.
유전자 표적 접근 방식으로 게놈 전체 시퀀싱을 검증하기 위해 생물학적 경로 내 농축 분석에서 여러 관심 유전자(GOI)를 선택했습니다. 샘플은 동일한 초기 단계에서 훈련되고 치료된 동물의 두 그룹을 복제한 별도의 코호트에서 수집되었습니다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)을 사용한 유전자 발현 분석에 사용하기 위한 훈련 시점(즉, 세 번째 2TD 훈련 세션 후 1시간). 복제 코호트에서는 2TD 성능 차이가 없었습니다(RGFP9661: 61±5.0% 대 RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274; 차량1:71±6.0% 대 차량2: 74±3.0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796, Welch의 t-검정).
첫 번째 GOI는 학습 첫 시간 내에 최고조에 달하고 기억 형성에 중요한 것으로 알려진 잘 연구된 활동 의존적 "즉시 초기 유전자"인 Egr1이었습니다(Duclot & Kabbaj, 2017). 이는 유전자 표적화 연구에서 별도의 동물 집단에서 HDAC 억제로 증폭된 발현 증가가 확인된 탑러닝 유도 유전자였습니다(그림 3). 뇌의 일주기 리듬과 세로토닌성 경로의 조절에 관여하는 유전자인 Per2의 경우에도 마찬가지였습니다(Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. ,2020). Per2는 다른 뇌 영역의 HDAC 조절과 연결된 "시계 유전자" 계열의 일부이며(Kwapis, et al., 2018) 청각 기능에서도 역할을 할 수 있습니다(Reh et al., 2020). 대조적으로, 게놈 전체에서 확인된 일부 GOI는 부분적으로만 확인되었습니다.
Chrna7은 신경생리학적 증거와 일치하여 청각 학습으로 하향조절되는 것으로 밝혀진 동적 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR)의 하위 단위를 인코딩합니다(Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). 따라서 우리는 유전자 표적 연구가 모든 2TD 훈련 동물에서 Chrna7 하향 조절을 확인하기를 기대했지만, 하향 조절은 HDAC 억제 없이 2TD를 학습한 차량 내 처리 동물에서만 명백했습니다. 추가로 선택된 GOI는 다른 뇌 영역에서 RGFP966의 선택적 HDAC 표적의 하류 효과를 전파하는 데 필요한 것으로 보고된 즉시 초기 유전자인 Nr4a 고아 핵 수용체 계열인 Nr4a1 및 Nr4a2에서 나왔습니다(McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019).
Nr4a 계열 유전자 발현의 작업 의존적 지역적 차이에 대한 이전 보고서와 일관되게(McNulty, et al., 2012), Nr4a1은 Nr4a2가 아닌 청각 학습 후 청각 피질에서 상향 조절되었습니다. 다른 DEG인 Htr1a 또는 Adamts13은 맞춤형 설계 유전자 표적 프로브에 의해 검출되지 않은 알려진 전사 변종의 차이, 제1종 오류 또는 훈련된 동물 집단 간의 미묘한 행동 차이로 인해 유전자 표적 연구에 의해 확인되지 않았습니다. 2TD 성능 측정에서는 감지되지 않았습니다. 우리는 또한 감각 피질에서 "임계기"와 같은 가소성을 다시 여는 기능의 오랜 역사를 가진 유전자인 Lynx1을 조사했습니다(Morishita et al., 2010). 이는 아마도 콜린성 및 세로토닌성 조절에 대한 작용 때문일 것입니다(Takesian, et al. , 2018). 그러나 검출에 실패한 이전 게놈 전체 보고서(Kalish, et al., 2020)와 일치하여, 이는 우리의 RNAseq 데이터 세트나 유전자 표적 연구에서는 검출되지 않았습니다.
불일치가 동물 간의 실제 생물학적 또는 개인별 다양성으로 설명될 수 있는지, 또는 풍부도가 낮거나 세포 유형별 발현 전사체의 기술적 다양성으로 인해 설명될 수 있는지를 결정하는 것은 여전히 어려운 일이지만, 우리는 일부 GOI에 대해 예외적으로 일관된 결과를 보고합니다. Chrna7, Egr1 및 Per2의 학습 유도 발현은 유전자 표적화 접근법과 게놈 전체 접근법 사이, 그리고 훈련된 동물의 다른 집단 사이에서 일관되기 때문에 이러한 유전자가 지속적인 변화를 위한 가장 근본적인 역할을 할 수 있다는 것은 당연합니다. 청각 기능과 기억은 이제 향후 조사에 가장 중요합니다.
함께 고려하면, 연구 결과는 신경생리학 및 행동에서 창발적인 청각 기능을 지원할 수 있는 성인 청각 피질의 역동적인 전사 환경을 보여줍니다. 감각 시스템 기능에 대한 후생적 제어에 대한 증거가 늘어나고 있는 점을 고려할 때(cf, Shang & Bieszczad, 2022), 고려하는 것은 흥미롭습니다. 후생적 메커니즘이 안정성과 청각 피질 회로의 경험에 따른 가소성의 균형을 맞추는 역할을 하는 방법. 예를 들어, 현재 게놈 전체 데이터세트에서는 HDAC 억제에서는 나타나지 않는 억제성 히스톤 탈아세틸화효소인 Hdac9 발현의 학습 유발 감소도 확인했습니다.
감소된 HDAC9 발현의 효과를 학습 유도 전사를 촉진하기 위해 HDAC를 약리학적으로 억제하는 효과에 비유하는 것은 유혹적입니다. 후생유전조절물질의 또 다른 중요한 부류는 히스톤보다는 DNA를 변경합니다. 예를 들어 Tet1과 Gadd45b는 DNA 메틸화에 영향을 미치고(Bayraktar & Kreutz, 2018) HDAC 억제 하에서 학습을 통해 각각 하향 및 상향 조절되는 것으로 나타났습니다. 또한, 한 종류의 microRNA가 HDAC 억제 학습을 통해 유도된 최고의 생물학적 경로로 나타났으며(표 1 참조), 이는 신경 전사 제어의 주요 후생적 조절 인자로서 현장에서 주목을 받았습니다(Saab & Mansuy, 2014). 후생유전적 플레이어와 발현된 유전자의 단백질산물 사이의 고차 분자 상호작용도 가능성이 높습니다. 예를 들어, 확인된 상향 조절된 Egr1은 Tet1을 모집하여 억압적인 메틸화 표시를 제거하여 하류 유전자를 활성화할 수 있습니다(Sun, et al., 2019). 학습하는 동안 청각 시스템의 후생적 조절자 간의 상호작용의 중요성을 분석하기 위해서는 추가 분자 연구가 필요할 것입니다. 더욱이, 이 보고서는 선별된 청각 피질 유전자와 그 하류 효과기 사이의 연결을 확립할 수 있는 즉각적인 기회를 제시합니다.
이러한 유전자와 분자 사이의 간격을 소리로 유발되는 신경 생리학적 사건에 미치는 영향에 연결하는 것은 성인 청각 시스템이 행동을 변경하기 위해 경험에 적응하는 방법을 이해하는 데 필수적입니다. 실제로, 세포 기능에 지속적인 변화를 일으키기 때문에 행동 기능의 장기적인 변화에 필요한 새로운 전사체의 번역이 필요합니다. 예를 들어, 학습 유도 전사 과정의 주요 표적 효과자는 소리를 결정하는 회로 내 채널이나 수용체의 가용성을 변경할 수 있습니다(Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023). 청각 시스템의 유발 역치, 반응성 및 수용 필드 아키텍처. 다양한 청각 작업이 작업 관련 소리 특징 또는 작업 구조에 대한 학습을 지원하는 특정 세포 기능과 관련된 생물학적 경로에 대한 고유한 유전자 네트워크를 모집한다고 가정하는 것이 합리적입니다.
전반적으로 이 보고서는 학습, 성인 및 청각 피질의 RNAseq 데이터 세트를 사용할 수 있도록 하는 출발점 역할을 합니다(데이터 저장소 참조). 성인 청각 피질의 분자 유전 과정에 초점을 맞춘 연구의 심각한 부족으로 인해 악화된 지식 격차를 좁히려는 노력은 이제 환영받습니다. 특히 현대 Omics 기술이 빠르게 발전하고 개선되고 있기 때문에 판독 깊이에 따라 기술적으로도 감도가 제한되는 벌크 RNA 시퀀싱의 시공간적 한계를 넘어서는 연구를 권장합니다(Li& Wang, 2021).
청각 피질에 대한 연구는 필수 분자 연쇄를 식별한 분자 유전학 분야에서 초기 진전을 이루었지만(Schicknick, et al., 2008), 허용적인 IEG 프로파일(Mello, Velho, & Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018) Peter, et al., 2011) 그리고 염색질역학(Peter, et al., 2021)에서도 전사역학이 아름답게 연구되는 청각 주변부에는 선례가 있습니다(Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al., 2020; Ebeid, et al., 2017). 단일 세포 RNA 시퀀싱(RNA-Seq) 및 소분자 형광 현장 하이브리드화(smFISH)와 같은 기존 분자 도구는 청각 피질 세포 및 회로 내에서 경험에 따른 세포 간 변화 및 분자 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하는 데 유용합니다. 벌크 RNAseq과 달리 이러한 방법은 층별 미세 회로 및 편막 지형과 같은 청각 피질의 심오한 세포 다양성과 고차원 조직을 존중합니다.
최근 활성화된 청각 피질 세포(Cho, Huang, & Gray, 2016)의 태그 및 서열 전사체에 대한 영리한 접근 방식은 가장 기능적으로 관련된 세포 유형 및 집단에서 가장 기능적으로 관련된 유전자 세트를 확보할 수 있을 만큼 민감도를 높일 수 있습니다. 다른 청취 조건이나 행동 요구 하에서 청각 시스템의 피질하 기능과 피질의 놀라운 통합을 기리는 피질의 활동 의존적 지역 전사체 프로파일을 포착하고 대조하기 위해 유사한 접근 방식을 피질하에서도 사용할 수 있습니다. 성인 뇌의 청각 학습에 기초가 되는 유전적 및 분자 메커니즘의 세포 및 지역적 차이를 완전히 특성화하는 것은 수명 전반에 걸쳐 특정 청력 및 청취 능력을 지원하기 위해 강력하고 지속적인 기능적 변화를 가능하게 하는 부위 선택 및 분자 표적 정밀 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다.
행동 양식
대상: 총 24마리의 성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐(도착 시 250~300g, Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA)를 행동 및 분자 실험에 사용했습니다. 모든 동물은 12-시간의 명암주기에 따라 온도가 조절되는(24˚C) 집락실에 개별적으로 수용되었습니다. 피험자는 행동 훈련 전에 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 모든 절차는 뉴저지 주립대학교 러트거스의 동물 보호 및 사용 위원회(IACUC)의 지침(프로토콜 번호:999900026(KMB))에 따라 승인되고 수행되었습니다.
행동 장치 및 소리 자극: 모든 행동 세션은 소리 감쇠 상자 내 두 개의 동일한 악기 조절 챔버(H{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA)에서 수행되었습니다. 두 챔버에 동일한 노출을 보장하기 위해 일일 교육 세션의 균형이 맞춰졌습니다. 각 챔버(12" W x 10" D x 12" H; 철망 바닥에는 응답 레버(H21-03R), 실내 조명(H11-01R), 스피커(H{ {8}}R) 및 물 공급 시스템(H14-05R). 훈련 단계에서 동물은 반응 레버("바프레스")를 눌러 물컵(~0.02cc)을 제시할 수 있습니다. 보상 포트(1.25"W x 1.625" H). 초기 세션 동안 핸드 스위치(H21-01)를 사용하여 동물의 바 누름 반응을 형성하여 물컵에 대한 접근을 허용했습니다. 오프라인 분석을 위해 Graphic State 4 소프트웨어(CoulbournInstruments, Holliston MA)를 사용하여 행동 반응을 기록했습니다.
모든 청각 자극은 Tucker-Davis Technologies(TDT, Alachua, FL) 및 RPvdsEx 소프트웨어를 사용하여 생성되었으며 작동 챔버의 벽 장착 스피커를 통해 제공되었습니다. 백색 잡음(절차적 훈련 중, 그림 1a)은 7초 또는 9초 동안(75dB SPL) 제시되었습니다. 순수 톤(2톤 식별 훈련 중, 그림 1a)은 항상 8초(70dB SPL) 동안 제시되었습니다. 디지털 사운드 미터(Larson DavisSoundTrack LxT1)를 사용하여 사운드 레벨을 매일 보정했습니다.
HDAC3의 행동 훈련 및 약리학적 억제: 동물 사육장에 적응한 지 1일 후, 쥐를 최소 3일 동안 매일 처리했습니다. 행동 훈련을 시작하기 전에, 쥐는 연령이 일치하는 대조 동물의 제한되지 않은 체중의 85%에 도달할 때까지 물을 제한하는 일정에 따라 배치되었습니다. 그런 다음 물이 제한된 쥐를 소리가 감쇠된 챔버 내부로 형성하여 물 보상을 위해 압력을 가했습니다(그림 1a). 바프레스 성형 및 후속 사운드 훈련은 이전에 설명된 바와 같습니다(Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). 간략하게, 모든 동물은 5일에 걸쳐 바프레스로 성형된 후 바프레스를 통해 소리를 내는 방법을 배우는 절차적 작업으로 훈련되었습니다. 물 보상을 얻기 위해 광대역 가우스 잡음 자극(1-12.5kHz 대역 통과 필터링된 백색 잡음, 75dB SPL)을 사용했습니다. 모든 동물은 훈련의 다음 단계를 계속하기 전에 이 소리를 보상과 연관시키는 방법을 성공적으로 학습했습니다. 절차적 훈련은 동물이 얼마나 빨리 높은 수준의 성과를 내기 위해 과제를 배울 수 있는지에 대한 개인차를 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 동물은 평균 12.67일 후에 이틀 연속으로 90% 이상의 수행 수준(평균=92.85%, sem =0.01%)을 달성할 수 있었습니다( sd=2.85일). 성능은 100%를 사용하여 계산되었습니다.
훈련의 다음 단계는 2톤 구별(2TD) 작업(그림 1a)이었는데, 여기서 쥐는 두 개의 스펙트럼적으로 구별되는 소리 주파수를 구별하도록 훈련되었습니다. S+ 톤(5.0 kHz; 70 dB SPL)에 대한 바 프레스는 물 보상을 제공하는 반면 스톤(11.5 kHz; 70 dB SPL)에 대한 바 프레스는 오류 신호(깜박이는 하우스)를 초래합니다. 빛) 및 "타임아웃"(다음 시도가 시작될 때까지 추가로 6초 대기)이 있습니다. S+ 및 S- S-시험은 무작위로 이루어졌으며 8초 동안 지속되었습니다. 시험 간 간격(ITI)은 평균 15초(범위: 5-25초, 무작위)였습니다. 조용한 ITI 동안 바프레스는 중요하지 않았습니다(타임아웃 없음, 오류 신호 없음, 물 보상 없음). 일일 세션 길이는 45분이었습니다. 모든 동물은 총 3일 연속으로 2TD작업을 수행했습니다. 쥐들은 훈련된 관찰자와 짝을 이루어 절차적 과제를 획득하는 비율이 비슷한 동물들에게 2TD 단계에서 다른 치료 조건이 할당되었습니다. 성능이 일치하는 쌍은 각 치료 직후 약리학적 클래스 I HDAC3 억제제 RGFP966(Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12) 또는 비히클 용액(N=9)을 전신 주사 받았습니다. 2TD 세션. 2TD 작업의 성능은 이전에 설명한 대로 100%로 계산되었습니다(Shang,Bylipudi, & Bieszczad, 20).
). RNA의 조직 수집 및 분리: 2TD의 세 번째 세션 후 동물에게 RGFP966의 세 번째 및 최종 주입을 받은 지 1시간 후, 뇌를 신속하게 해부하고 드라이아이스 위에 놓인 2-메틸부탄 비이커에서 급속 냉동했습니다. 급속 냉동된 두뇌는 향후 처리 때까지 -80˚ C에 보관되었습니다. 뇌 냉동절편을 준비하기 위해 뇌를 최적의 절단 온도 화합물(OCT)에 넣고 -20˚ C에서 12-24시간 동안 보관하여 뇌 조직이 절단에 적합한 -20˚ C에 도달하도록 했습니다. OCT에 싸인 뇌는 저온 유지 장치(Leica CM 3050S)에서 250μm 두께로 수평으로 슬라이스됩니다. 1mm 원형 조직 마이크로 펀치를 사용하여 각 반구에서 2mm3의 청각 피질 조직(뇌 영역당 총 4mm3에 대해 하나의 샘플로 결합)을 RNA 추출을 위해 샘플링했습니다. 청각 피질 위치는 Paxinos와 Watson의 The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates(6판)를 참조 자료로 사용하여 확인되었습니다(대략 A/P=-3.6 ~ -5.8 mm, M/L {{20} } ±6.4 mm D/V=-4.2 ~ -5.8 mm, 해마를 랜드마크로 사용
제조사의 프로토콜을 사용하여 PureLink™ RNA Mini Kit(ThermoFisher)을 사용하여 각 샘플의 총 RNA를 분리했습니다. 그런 다음 RNA 샘플을 RNA Clean andConcentratorTM -25 키트(Zymo Research)를 사용하여 정제했습니다.
Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8) 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 생성했습니다. 라이브러리를 풀링하고 100bp 페어드 엔드 SBS화학을 실행하는 Illumina NovaSeq 6000에서 시퀀싱을 수행했습니다. 읽기는 아이오와 대학의 Argon HPC 리소스에서 실행되는 Harvard Chan Bioinformatics(v.1.2.4)에서 주로 개발된 'bcbio-nextgen.py' 오픈 소스 정보학 파이프라인으로 처리되었습니다. 이 파이프라인에는 판독 품질 제어, 판독 정렬 및 정량화를 위한 '모범 사례' 접근 방식이 포함되어 있습니다. 'bcbio-nextgen.py' 파이프라인은 선택된 게놈 빌드로 'rn6' 키를 사용하여 "RNA-seq" 모드에서 실행되었습니다(내부적으로Ensembl 어셈블리 및 genebuild 'Rnor{12}}.0' 참조). 정렬된 파이프라인은 스플라이스 인식, 초고속 hisat2 정렬기(2.2.1)를 사용하여 Rnor_6.0 게놈을 읽고 동시에 '연어'(1.4.0) 정렬기를 사용하여 전사체를 정량화하여 읽습니다. hisat2 BAM 정렬 파일을 검사하는 계산 도구인 Qualimap(2.2.2)을 사용하여 품질 관리를 위한 읽기 데이터를 검사했습니다. 서열 품질 점수는 기본 검사를 통과했으며 서열 복제율은 허용 가능한 매개변수 내에 있었습니다. 모든 샘플은 엑소닉 영역에 대한 판독 정렬을 위해 QC를 통과했습니다. 연어 유래 전사체 정량화(TPM 또는 "백만 당 전사체")를 가져와 Rstudio의 tximport(1.12.3)를 사용하여 유전자 수준에서 추정된 수로 요약했습니다. DESeq2 비네팅(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).
모든 샘플에서 추정 개수가 5개 미만인 유전자는 권장 절차에 따라 다운스트림 분석에서 사전 필터링되었습니다. 추정된 유전자 수준 수에 대해 DESeq2(v.1.24.0)를 사용하여 차등 유전자 발현 분석을 수행했습니다. FDR 5% 및 X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).
qRT-PCR을 통한 RNA-seq 데이터 검증: RNA-seq 데이터는 서로 다른 쥐 집단에서 추출된 mRNA에 대해 qRT-PCR로 검증되었습니다. 기준선에서 각 지역에서 풍부한 것으로 발견된 새로운 DEG 목록에서 5개의 성적표가 선택되었습니다. 유전자 중 3개는 청각 피질 생리학적 및 행동 문헌을 기반으로 한 가설 중심이었고, 다른 3개 유전자는 약물과 차량 그룹 간의 비교에서 유전자 수준 및 DEG 분석을 통해 확인된 신규 유전자였습니다. 모든 프라이머 서열은 쥐의 뇌 조직에 대한 이전 문헌(아래 표에 제공된 서열)에서 선택하거나 NCBI Primer Blast를 사용하여 설계하고 용융 곡선 및 PCR 앰플리콘 제품 서열 분석을 평가하여 표적 특이성을 검증했습니다. qRT-PCR 분석은 SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 QuantStudio 3(Applied Biosystems)에서 수행되었습니다. 각 샘플에 대해 iScriptTM cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용하여 500ng의 cDNA를 증폭했습니다.
감사의 말
저자는 행동 절차 및 분석에 도움을 준 Dr. Andrea Shang, Sean Tsaur 및 Sooraz Bylipudi에게 감사를 표하고 싶습니다. RNA 추출 및 샘플 수집 프로토콜에 도움을 준 Mimi L. Phan 박사; RNA 샘플 정제 분석에 도움을 주신 Dr. Troy A. Roepke, Ali Yasrebi 및 ChristopherO'Brien; 기술 지원을 위해 Alisa Ray가 참여했습니다. 우리는 모든 현재 및 이전 CLEF Lab 직원의 지원과 지원에 감사드립니다.
이 작업은 국립 보건원(National Institutes of Health), 국립 청각 장애 및 의사소통 장애 연구소[R01-DC014753 to KMB]의 지원을 받았습니다. Rutgers University의 예술 및 과학부; 학부 연구를 위해 소액의 보조금을 지원받는 Rutgers University의 Aresty Foundation; 학부 연구를 위한 소규모 보조금을 지원하는 Rutgers University의 Project SUPER 프로그램도 있습니다.
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Reference:1950477648n@gmail.com
