뇌 노화와 알츠하이머병에서 세포내이입과 자가포식의 GTP 에너지 의존성

추상적인

고령화에 대한 관심 증가와알츠하이머병뇌의 autophagy에서 (AD) 관련 손상은 조절 및 치료에 대한 중요한 질문을 제기합니다. endocytosis와 autophagy의 많은 단계가 GTPase에 의존하기 때문에 세포 내 GTP 수준에 대한 새로운 측정이 필요합니다.노화 및 AD의 에너지 조절 평가. 비율 측정 GTP 센서(GEVALS)의 최근 개발과 GTP 수준이 세포 내에서 균일하지 않다는 발견은GTPase 규제의 새로운 문제GTP의 현지 가용성에 의해. 이 리뷰에서는 다음을 강조합니다.GTP의 대사초기 엔도솜, 후기 엔도솜 및 손상된 화물의 자가포식 분해를 실행하기 위한 리소좀 수송의 형성에 관여하는 Rab GTPase와 관련하여. 특정 GTPase는 거대자가포식(미토파지), 미세자가포식 및 샤페론 매개 자가포식(CMA)을 제어합니다. 추론에 따르면, 로컬 GTP 수준은 과잉이 아니라면 자가포식을 제어할 것입니다. 티오레독신 관련을 포함하여 세포의 산화환원 상태에 의해 추가적인 제어 수준이 부과됩니다. 이 검토 전반에 걸쳐 우리는 다음을 강조합니다.연령 관련 변화그건 할 수GTP 및 AD의 적자에 기여. 우리는 자가포식을 회복하기 위해 GTP 수준을 높이고 노화와 관련된 산화 산화환원 이동을 역전시킬 전망으로 결론을 내립니다. 따라서 GTP 수준은 엔도사이토시스, 자가포식 및 소포 밀매와 관련된 수많은 GTPase를 조절할 수 있습니다. 노화에 있어 좌식 생활 방식에 대한 대사적 적응은 미토콘드리아 기능을 손상시켜 아밀로이드 및타우 단백질분해효소, 시냅스 기능, 그리고염증.

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노화와 AD의 또 다른 에너지 화폐인 GTP

고에너지 분자 ATP와 GTP의 합성은 모두 NAD + /NADH의 산화환원 상태와 이들의 충분한 농도에 의존합니다. 해당과정에서 ATP 합성은 주로 NAD의 산화력과 환원당에 작용하여 이루어집니다. 미토콘드리아에서 산화적 인산화에 의한 ATP 합성은 피루브산, 글리세롤 또는 전자 수송 사슬의 말단 전자 수용체로서 산소를 갖는 지방산의 환원을 위한 TCA 주기에서 NADH 생성에 의해 동력을 얻습니다. 살아있는 쥐나 마우스 해마 뉴런에 대한 우리의 무표지 연구는 NAD와 NADH의 연령 관련 고갈을 나타내며, 이는 ATP와 GTP의 합성을 손상시킬 수 있습니다[1-4]. 이러한 고갈은 인간 베타-아밀로이드 및 타우에 대한 이식유전자를 운반하는 마우스의 뉴런에서 더욱 악화되었습니다. 또한, TCA 주기 효소의 사후 분석은 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 뇌의 TCA 주기 효소에서 최대 40% 손상을 나타냈습니다[5]. 따라서 TCA 효소 활성에서 AD 관련 미토콘드리아 손상에 더하여 NAD 플러스 및 NADH의 연령 관련 에너지 고갈은 비록 그들의 벌크 농도가 최소한으로 영향을 받더라도 ATP 및 GTP 수준에 국부적으로 영향을 미칠 수 있습니다.

GTP 가수분해에서 얻을 수 있는 에너지는 ATP 가수분해와 같지만 GTP는 특정 효소의 선택성 때문에 ATP와 다른 용도로 활용된다. 세포의 GTP 농도는 밀리몰 ATP보다 평균 10배 낮습니다. GTP는 엔도사이토시스(endocytosis) 및 오토파지(autophagy)를 포함하는 단백질 합성 및 소포 수송(vesicular trafficking)의 다중 에너지 의존적 세포 과정의 주요 조절자이다. 포유류 세포에서 추정된 총 세포 GTP 농도는 250-700μM 범위이지만 암세포 돌출부에서 자유 GTP는 30μM에 가깝습니다. GTP에 의해 구동되는 주요 단백질에는 막 분열 및 융합을 위한 다이나민, 작은 규제 GTPase 및 아래에 자세히 설명된 미세소관이 포함됩니다. IDMPH2에 의한 이노신과 GMPS에 의한 크산토신의 새로운 합성 외에, GTP의 세포 공급원은 주로 ATP를 GTP로 전환시키는 비전이성 유전자(NME; 때때로 NM23으로 불림)의 국소화된 뉴클레오사이드 2인산 키나아제(NDPK)입니다[8]. NME 유전자 패밀리에는 적어도 10개의 구성원이 있지만 처음 4개만이 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 활성을 가지고 있습니다. Allen Brain Atlas에 따르면, NME1~4는 알츠하이머병에서 기억력이 손상된 마우스와 인간 해마에서 강력하고 선택적으로 발현됩니다. NME1-3은 세포질이고 NME4는 미토콘드리아입니다. endocytosis와 autophagy의 두 가지 별개의 과정이 노화와 AD에 영향을 미치기 때문에 우리는 상류의 변화가 이러한 아밀로이드 결정적 기능에 대한 GTP 수준을 제한하는 연령과 AD 관련 결과 모두에 영향을 미친다고 가정합니다.

GTP 수준 측정

GTP는 세포 생존을 위한 몇 가지 중요한 과정을 조절하지만 생리학적 및 병리학적 조건에서 살아있는 세포의 GTP 수준을 측정하는 것은 높은 전환율과 단백질 결합 상태와 자유 상태가 모두 존재하기 때문에 어렵습니다. Bianchi-Smira glia et al. [9]는 in vitro 및 in vivo에서 GTP가 없는 농도와 GTP가 결합된 농도의 비례적 변화를 감지하는 노란색 형광 단백질을 기반으로 하는 새로운 유전적으로 암호화된 GTP 센서(GEVAL)를 설명했습니다. 최근 같은 그룹이 국소 GTP 생산에 의해 구동되는 인간 흑색종 세포주에 의한 세포 침입에서 GTPase Rac1의 조절 메커니즘을 보고하고[7], 그 방법론을 검토했습니다[10]. 이 리뷰에서 볼 수 있듯이 GTP는 아밀로이드 처리와 관련된 엔도사이토시스 및 자가포식 동안 중요한 역할을 합니다. 현재 우리는 삼중 트랜스제닉 3xTg-AD 마우스의 해마 뉴런의 1차 배양에서 A 처리의 연령 관련 GTP 변화와 자가포식의 변화에 ​​미치는 영향을 연구하고 있습니다. 그림 1은 비트랜스제닉 마우스 뉴런과 비교하여 이 AD 마우스 모델에서 1차 성인 ​​뉴런으로의 GEVAL530 형질감염의 예비 결과를 보여줍니다. Bianchi-Smiraglia et al. [7], 자유 GTP를 측정할 때(그림 1Aa), 3xTg-AD 뉴런(그림 1Ac)에서 자유 GTP 수준이 낮을 때 세포체의 과정과 가장자리에서 GTP의 불균일한 분포를 볼 수 있습니다. 섹션 10에서 자세히 설명한 바와 같이, NAD + 전구체인 니코틴아미드로 이들 뉴런을 전처리하면 유리 GTP 수치가 높아졌습니다(그림 1Ab, d). 이러한 실험에 사용된 GEVAL530에 대한 530-µM Kd는 로컬 유리 GTP 농도가 530µM의 몇 배 이내임을 시사합니다. 그림 1B에서 우리는 특히 3xTg AD 뉴런에서 소포에 국한되고 니코틴아미드에 의해 증가된 것으로 보이는 결합된 GTP를 검사했습니다(그림 1Bf, h). 예비 증거는 NME1 siRNA로 처리된 뉴런이 유리 GTP 수준을 낮춘다는 것을 나타냅니다(Santana Martinez, 미공개). 연령 스펙트럼에 걸쳐 성인 뉴런에 대한 추가 연구는 GTP 결핍의 연령 의존성과 NAD 플러스 전구체로 이를 교정할 수 있는 능력을 결정할 것입니다. 세포내이입 및 자가포식의 수포 밀매 과정에서 GTP의 필수적인 역할과 AD 유사 유전학을 가진 GTP의 변화에 ​​대한 예비 증거를 감안할 때, 다음 섹션에서는 이러한 과정에 대한 세부 사항과 노화 및 알츠하이머병의 영향을 제공합니다. 이 검토 결과는 결합 및 유리 GTP와 총 GTP 농도의 변화를 직접 측정하기 위한 GEVAL 프로브와 같은 새로운 방법의 필요성을 강조합니다.

그림 1. GEVAL530 센서로 형질감염된 중년 마우스의 일차 마우스 해마 뉴런에서 비율 측정 GTP 측정 뉴런의 가색 픽셀 대 픽셀 비율 측정 이미지는 GTP의 불균일한 분포를 보여줍니다. (a) (c) 중년(10개월) 3xTg-AD 뉴런과 비교하여 가장자리 및 정단 수상돌기에서 중년(14개월) 비형질전환(NTg)의 과도한 자유 GTP/결합 GTP. (b, d) 24시간까지 2mM 니코틴아미드로 처리된 뉴런에서 유리 GTP의 증가. (e, g) 처리되지 않은 뉴런은 2mM 니코틴아미드로 처리된 (f, h) 뉴런에서 24시간까지 증가된 소포 결합 GTP를 나타냄

Endocytosis: 노화 및 AD에서의 GTP 의존성

세포내이입 과정에서 세포는 거대분자와 리간드 결합 수용체 및 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 포함한 표면 단백질을 내재화합니다[11](그림 2A). 두 가지 주요 세포내이입 경로 중에서 원형질막에 내장된 APP 흡수는 대부분 콜 테롤이 풍부한 패치(그림 2B.2)에서 카베올라 매개가 아닌 클라트린 매개 흡수(그림 2B.1)를 통해 발생합니다. 그러나 소수성 A는 원형질막에서 지질 뗏목의 콜레스테롤이 풍부한 패치로 분할되며 후속적으로 카베올라 경로에 의해 흡수됩니다[12](그림 2B.2). 두 경우 모두, dynamin GTPase 복합체는 invagination에서 조립되어 원형질막에서 성숙한 소포의 최종 융합 및 방출을 위해 GTP 의존성 막 곡률을 촉매합니다[13-15]. 국소 GTP 연료 공급은 다이나민에 결합하는 NME1 및 2뉴클레오티드 포스페이트 키나아제에 의해 촉매됩니다[16]. 분해를 위한 후기 엔도솜 Rab7 GTPase로의 변형 또는 엑소사이토시스 및 수용체 재활용에 대한 초기 엔도솜 Rab5 GTPase 결정.

Rab5 GTPase는 초기 엔도솜의 마커로 간주됩니다[17]. Rab5 단백질은 원형질막, 클라트린으로 코팅된 소포 및 초기 엔도솜에 존재합니다(그림 2). 헌팅턴병의 세포 및 fy 모델에서 Rab5는 자가포식을 조절하고 독성 돌연변이 헌팅틴을 제거하기 위해 자가포식소체 형성에 참여합니다[18]. Rab5의 억제는 자가포식 조절 프로테아제 Atg5-Atg12 접합을 감소시켜 자가포식소체 형성을 감소시킵니다. Atg12-Atg5 접합체는 Atg8의 지질화를 촉진하고, 지질화된 Atg8은 자가포식 동안 자가포식소체 형성 및 선택적 화물 인식을 촉진합니다[19].

Rab5-매개 autophagy에 기여하는 또 다른 요인은 포스파티딜이노시톨-3-키나제(PI3K)입니다. PI3- 키나제 복합체는 Akt/mTOR 신호 경로를 활성화하여 자가포식을 억제합니다[20]. PI3K 복합체의 P110 서브유닛은 Vps34 복합체의 촉매 활성을 조절하여 PI3P 생성을 촉진합니다[21]. 이 단계는 autophagosome 형성에 필수적입니다. P110은 Rab5- GDP에서 Rab5-GTP로의 전환을 촉진합니다. P110 과발현은 Rab5, Vps34 및 Beclin1로 구성된 거대분자 복합체의 활성화에 따른 자가포식 결핍을 완화하여 자가포식소체 형성을 유도합니다[22]. 이러한 특정 단백질을 표적으로 하면 AD 병리학을 약화시키는 치료 방법을 밝힐 수 있습니다.

그림 2 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 세포내이입. 응집되기 쉬운 A의 녹색 음영이 있는 770개 잔기 APP 단백질의 N-말단 부분은 BACE 및 감마 펩티다아제에 의한 절단을 필요로 합니다. B APP의 세포내이입. (1) 엔도프로테아제 BACE 및 β-세크레타아제와 함께 클라트린에 의해 조율된 원형질막으로부터 내측 싹의 형성. dynamin에 의해 지원되는 Endocytosis는 NME1에 의해 로컬 GTP를 수신합니다. (2) 콜레스테롤(lipid rafts)이 풍부한 마이크로도메인은 A로 가공된 APP 또는 실질로부터 흡착된 A에 결합한다. (3) 초기 엔도솜은 또 다른 GTPase인 Rab11에 의해 인식되는 GTPase Rab5를 끌어당겨 (4) 수용체의 원형질막으로의 세포내 재순환을 매개합니다. 대안적으로, (5) Rab7은 APP의 추가 처리 및 A의 축적을 가능하게 하는 늦은 엔도솜으로 초기에 분리를 매개한다. (6) 내용물을 분해하기 위한 (7) 리소좀과의 후기 엔도솜 융합. 일부 응집된 A는 소화에 저항성이 있을 수 있으며 엔도솜 파괴로 A가 세포질에 축적될 수 있습니다.

막 결합 Rab5는 Mon1-Ccz1-의존성 Rab7 활성화 및 Rab7-의존성 막 융합을 직접 촉진하는 핵심 요소입니다[23]. Mon1-Ccz1은 Rab5를 활성화하는 헤테로다이머 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 GEF-복합체입니다. Rab5 GEF의 Mon1-매개 변위는 Rab7에 의한 Rab5의 변위를 초래합니다. C-Vps 복합체는 Rab7에 대한 GEF 역할을 하며 Rab7 활성화를 위해 GDP-바운드에서 GTP-바운드 상태로 전환하는 Rab7을 촉진합니다. 자외선 저항 관련 유전자(UVRAG)는 Rab7의 GDP/GTP 교환을 통한 UVRAG-C-Vps 상호작용에 의해 Rab7 활성화를 자극합니다[24]. autophagic 과정의 또 다른 조절 지점은 막 융합 동안 효모 액포 Ypt-Rab GTPase를 활성화하는 HOPS(homotypic fusion and vacuole protein-sorting) 복합체입니다[25]. HOPS 복합체의 6개 하위 단위 중 하나는 Vps11, Vps16, Vps18 및 Vps33을 포함하는 클래스 C 액포 단백질 분류(C-Vps) 복합체입니다. Rab7 late endocytic vesicles는 이어서 화물 분해를 위해 리소좀과 융합합니다(그림 2).

마우스 모델 및 AD에서 Rab 5 및 Rab 7 엔도솜 트래피킹의 변화

아밀로이드 전구 단백질(APP) 또는 A 생성 프레세닐린에 돌연변이가 있는 AD 마우스 모델에서 엔도솜-자가포식소체-리소좀 경로는 프로테아제와 리파아제를 충분히 활성화하지 못하는 리소좀의 손상된 산성화 때문에 부분적으로 조절되지 않는 것으로 보입니다[26]. AD의 마우스 모델에서 A를 포함하는 큰 perinuclear body는 Rab7 및 후기 endosomal 및 lysosomal 구성 요소와 colocalized autophagosome 마커 LC3로 레이블을 집계합니다. 이는 보호 상향 조절 실패 또는 병리학적 장애로 인한 것일 수 있습니다. 연령대에 걸쳐 3xTg-AD 마우스에서 배양한 뉴런에서 응집된 소낭 A가 나이가 들면서 30~50배 증가하는 것을 발견했으며, Rab5-라벨이 지정된 초기 엔도솜과 미토콘드리아에서 가장 두드러지게 나타납니다. 또한 Rab{{9} }후기 엔도좀 및 자가포식소체[27]로 분류됨. A 42 및 A 45의 눈덩이 같은 축적은 오래된 뉴런이 이러한 A의 더 긴 집합체의 자가포식 분해를 완료할 수 없음을 시사합니다. 우리는 오래된 뉴런의 손상된 에너지 생산이 autophagy 완료를 위한 에너지 용량을 제한한다고 가정합니다. 젊은 해마 및 피질의 수준과 비교하여 7~12-개월 된 APP/PS1 마우스 해마에서 Rab7 수준은 Beclin1 및 Rubicon 활성제의 감소와 Rubicon 억제제의 증가와 함께 감소했습니다[28]. 젊은 해마와 피질의 모든 연령대에서 Beclin1은 Rab7을 활성화하는 반면, Rubicon은 UVRAG(UV Radiation Resistance-Associated Gene Protein)-Vps(vacuolar protein sorting gene) 상호작용을 억제하여 Rab7의 활성화를 억제합니다. 효모와 초파리의 Rab7 결핍은 autophagosomes의 대량 축적을 초래합니다[29]. Rab7 녹다운은 또한 mTORC1/S6K1 및 후기 엔도좀에서 mTOR의 위치를 ​​비활성화합니다[30]. 흥미롭게도 endocytic trafficking의 다른 단계의 억제는 mTORC1의 활성을 변화시키지 않으며, 이는 온전한 후기 엔도솜이 autophagy에서 mTORC1 신호 전달에 중요하다는 것을 시사합니다. 이것이 mTOR를 표적으로 삼아 노화나 AD를 늦추지 못하는 중요한 이유입니다.

AD에서 Rab 5 및 Rab7 단백질 및 mRNA의 국소적 선택적 상향조절은 질병 병리 또는 불충분한 보호 메커니즘에 대한 선택적 기여를 시사한다[31]. A는 주로 Rab7 양성 후기 엔도솜과 뉴런 세포의 자가포식 액포[32]에 노화와 관련된 방식으로 축적되어[27] A의 내재화를 유발하고 후속적으로 Rab7의 증가가 뉴런 변성을 유발합니다[33]. Rab7 억제에 의한 후기 세포내이입 경로 차단은 세포 표면에서 A 의존성 아밀로이드 원섬유 형성을 유도하여 엔도솜 확대를 유발하여 [34] Rab7의 재활용을 가속화하고 분해를 위해 A를 리소좀으로 세포내이입 이동시킵니다 [35]. Iysoso mal proteolysis의 억제는 또한 AD-like axonal dystrophy를 일으키는 autophagic organelles의 axonal retrograde transport에 영향을 줄 수 있습니다. 그러나 Rab7-매개 autophagy를 촉진하기 위한 실질적인 개입은 AD 진행을 지연시키거나 역전시킬 수 있습니다. 예를 들면 좌식 생활에서 운동으로의 전환, 지중해 식단, 산화환원 전환을 생성하는 NAD 전구체와 같은 에너지 강화 화합물이 있습니다[4](섹션 10). 또 다른 방법은 AD 뇌에서 구아노신 모노포스페이트 환원효소 1(NADPH-dependent GMPR1) 수치가 증가한다는 이상한 발견으로, 자체적으로 GTP 수치를 낮추고 AMP 신호를 높일 수 있습니다[37]. 타우의 신경원섬유 엉킴은 AD 마우스에서 이 활동이 억제되었을 때 낮아졌습니다.

가벼운 인지 장애에서 알츠하이머병으로 진행함에 따라 엔도좀 Rab5 및 Rab7 발현은 모두 전사 마이크로어레이에 의해 측정된 바와 같이 해마 CA1 뉴런에서 상향조절되었습니다[31]. Rab5-양성 엔도솜의 확대는 신경원섬유 엉킴 및 아밀로이드 침착과 관련이 있었습니다. NGF(신경 성장 인자)와 같은 신경 영양 인자는 Trk 수용체에 결합하고 Rab5-양성 엔도좀으로 내재화하여 다운스트림 신호 전달을 시작합니다[38]. 신호 전달 엔도솜이 긴 축삭 내에서 이동하는 동안 Rab5 초기 엔도솜으로 유지되고 Rab7 후기 엔도솜으로 진행하지 않는다는 점에 주목하는 것은 흥미롭습니다[39]. 이 차이점은 autophagy를 향한 엔도솜 처리에서 수용체 매개 신호 전달을 구별합니다[40]. NGF에 의해 활성화된 후 TrkA는 Rab5-GAP를 모집하여 GTP-Rab5를 GDP-Rab5로 빠르게 전환하여 GTP-Rab5 수준을 억제합니다. 그러면 Rab5가 Rab7로 전환되는 것을 방지하여 NGF/TrkA 신호 전달이 억제됩니다. 조기 저하.

Rab5 기능은 AD의 초기 단계에서 손상됩니다[41]. Rab5의 지속적인 과활성화는 후기 엔도좀, 리소좀 융합 및 자가포식을 향한 세포내이입 경로를 촉진하여 신경 영양 인자 신호 전달 및 신경 위축의 조기 분해를 초래했습니다. 두 가지 주요 레트로머 단백질인 Vps35와 Vps26도 AD 뇌에서 감소했습니다[42]. Vps26은 엔도좀에서 골지로의 APP 트래피킹을 제어하는 ​​분류 수용체인 SorLA에 결합합니다. Vps 레트로머 단백질의 감소는 베타-세크레타제의 영향을 받는 엔도솜에서 APP 트래피킹 케이싱 APP 축적을 방해하는 비정상적인 Vps-SorLA 복합체를 초래합니다. 그러나 APP 653YTSI656 기저외측 모티프 내에서 S655에서 APP 인산화를 모방하면 레트로머 매개 과정에서 APP 검색을 향상시켜 APP 리소좀 표적화를 감소시키고 Abeta 생산을 감소시킬 수 있습니다[43]. 전체 길이의 APP 및 APP 단편 -CTF의 증가는 Rab5 GTPase 활성을 상승시켜 초기 엔도솜의 확대를 유도할 수 있습니다[44]. 흥미롭게도, APP ‐CTF에 의해 유도된 신경 위축은 시험관 내[39]와 생체 내[45] 모두에서 우성 음성 Rab5 돌연변이에 의해 구조될 수 있습니다.

노화의 최종 결과는 후기 엔도솜의 고갈, 후기 세포내이입 기능 장애 및 손상된 리소좀 융합입니다. AD에서 A의 엔도사이토시스는 확대된 Rab5 초기 엔도솜으로 증가합니다. AD에서 Rab7의 역할은 Rab7의 초기 상향 조절 및 후기 하향 조절이 양방향으로 신경 건강에 영향을 미치는 것으로 관찰되었기 때문에 아직 명확하게 밝혀지지 않았습니다. Bianchi-Smiraglia et al. [7], 균질액에서 측정되는 총 세포 GTP는 Rab GTPase에 대해 국소적으로 이용 가능한 유리 GTP의 평가를 허용하지 않습니다. 자유 GTP 측정은 아직 보고되지 않았으므로 세포내이입에서 연령 및 AD 관련 손상에 대한 가능한 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다. 따라서 살아있는 세포에서 자유 GTP를 측정하고 연령 및 AD 모델의 함수로서 세포내이입에 대한 자유 GTP의 변화 효과를 측정하는 것이 중요할 것입니다.

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