높은 소금 섭취량과 Wildling 생쥐의 자연 장내 미생물군집에 미치는 영향
Jun 28, 2024
1. 소개
포유류의 장에는 복잡하고 다양한 박테리아 군집이 서식하며, 숙주와 함께 섬세한 공생 관계를 형성합니다[1,2]. 이 박테리아 군집은 대사, 면역 조절, 영양 기능 등 숙주에게 유용한 많은 기능을 발휘하며[3-7], 장내 미생물군 구성은 숙주의 특정 요구와 생리에 따라 일생 동안 바뀔 수 있습니다[1,8, 9]. 장 건강을 증진시키는 박테리아의 많은 유익한 기능은 혐기성 발효 유래 대사산물에 의해 매개되며[10-13], 미생물 불균형 상태는 숙주 건강에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다[2,11,14,15]. 생활방식이 건강에 미치는 영향에 대한 관심이 높아지면서 장내 미생물군 관련과 그 번역적 의미에 대한 과학적 관심이 높아졌습니다[16,17]. 실제로, 장내 미생물총은 외인성(예: 생활 방식, 식이요법 및 의학적 치료) 요인과 내인성(예: 숙주 유전학, 면역 및 대사 조절) 요인에 의해 형성됩니다[8,18-20]. 일반적으로 외부 요소가 장내 미생물군 구성 및 기능에 영향을 미치는 주요 기여 요인 중 하나인 식이 요법과 함께 영향력 있는 효과를 이끌어낼 수 있다는 것이 인식되고 있습니다[1,2,21]. 높은 소금 섭취와 같은 서양식 식이 성분은 면역체계에 영향을 미치고 장내 미생물군과 질병을 변화시켜 숙주의 항상성을 손상시키는 것으로 알려져 있습니다[18,22-37]. 쥐의 장내 미생물총에서 고염식(HSD)은 Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia 및 Faecalibaculum과 같은 단쇄지방산(SCFA) 생산자로 악명 높은 건강 증진 박테리아의 감소와 관련이 있습니다. 29,38-41], 다양한 모델 시스템에서 숙주 면역과 질병에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 또 다른 기회주의적 SCFA 생산자인 Akkermansia의 풍부함이 증가했습니다[42,43]. 쥐과 동물 모델은 식이 요인이 장내 미생물군, 면역 체계 및 질병을 어떻게 형성할 수 있는지 연구하는 데 자주 사용됩니다[29,44-46]. 기존 실험실 쥐(CLM)의 사용은 여전히 많은 연구에서 유효한 옵션이지만 장내 미생물군에 초점을 맞춘 응용 프로그램을 적절하게 번역하지 못하는 경우가 있습니다[47-49]. 예를 들어, 염증성 장 질환(IBD) 및 비만의 쥐 모델에 대한 면역학 및 대사체학 연구는 장내 미생물 연구의 번역 결과를 제대로 예측하지 못하는 것으로 나타났습니다[50]. 이는 다양한 장 해부학, 유전학, 생리학과 같은 모델 시스템의 많은 본질적인 차이로 인해 발생할 수 있습니다[16,50]. 그러나 미생물총-면역 상호작용을 연구하기 위해 CLM을 사용하는 또 다른 문제는 CLM에서 장내 세균 구성의 가축화인데, 이는 야생 쥐에 비해 CLM 장내 미생물총의 복잡성과 탄력성이 감소하는 것으로 반영됩니다[51]. 위생적이고 통제된 환경에 대한 필요성은 잠재적인 병원체 및 기생충의 존재 감소에 직면하며, 이는 결과적으로 야생 쥐에 비해 CLM의 면역 체계가 덜 "교육된" 것으로 이어지는 것으로 여겨집니다[51-53]. 이 문제를 해결하기 위해 C57BL/6 마우스 유래 배아를 야생 마우스에 이식하여 야생 유래 장내 미생물군을 얻고 면역학적 장내 미생물군 연구의 번역 문제를 극복하는 야생 쥐 모델을 개발했습니다[54]. 이 마우스 모델과 관련된 최근 연구에서는 CLM과 비교하여 실험적 면역요법의 번역 가치를 예측하는 데 탁월한 결과가 나타났습니다[54,55]. 더욱이, 야생 장내 미생물총은 CLM에 비해 항생제 치료와 고지방 식이에 더 저항력이 있고 회복력이 있었는데, 이는 인간의 더 복잡한 상황과 비슷합니다[54,55]. 그러나 장내 미생물군, 면역체계 및 CLM의 다양한 질병 모델에 대한 HSD의 확립된 효과에도 불구하고 자연 유래 장내 미생물군에 대한 고염분 섭취의 효과는 알려져 있지 않습니다. 이 연구에서 우리는 야생 쥐와 비교하여 다양한 장내 세균 생태계 구성과 CLM의 예측 기능에 대한 HSD의 효과를 평가했습니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 동물과 다이어트
야생형 C57BL/6 마우스(7~8주령 암컷, n{5}})는 Charles River에서 구입하여 표준화된 조건 하에 University of Hasselt의 동물 시설에 보관되었습니다. Wildling 쥐(C57BL/6 유전적 배경, 수컷 n=12 및 암컷 n=11) [54]를 표준화된 조건 하에서 UHasselt의 동물 시설에 가두었습니다. 동물 연구는 Hasselt University의 ECAE(동물 실험 윤리 위원회)의 승인을 받았습니다(ID2{21}}1618A4V1, ID202235). 생쥐는 12:12시간의 명/암 주기로 온도 조절실(21~23°C)에 수용되었습니다(케이지당 4마리). Ssniff(독일 Soest)에서 다음과 같은 정제 사료를 구입했습니다: 0.5% NaCl/대조 사료(E15430-04) 및 4% NaCl/HSD(E15431-34). HSD의 경우 [28]에 설명된 대로 E15431-34 외에 식수에 1% NaCl을 동물에게 먹였습니다. CLM 마우스는 대조군(n=10)과 HSD(n=10) 사이에 균등하게 분포되었습니다. 야생 생쥐의 경우 수컷과 암컷 개체도 대조군과 HSD 식이 그룹에 균등하게 분포되었습니다(대조군 수컷 6명, HSD 수컷 6명, 대조군 암컷 5명, HSD 암컷 6명).
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
2.2. DNA 추출
미생물 DNA 추출은 QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)의 수정된 프로토콜을 사용하여 [28]에 설명된 대로 수행되었습니다. 간단히 말하면, 0.5 mm 유리 비드와 1.5 mL의 용해 완충액(ASL)(Qiagen, Hilden, Germany)을 포함하는 2-mL Eppendorf에 배설물 펠렛을 첨가했습니다. 비드 비팅을 사용하여 펠릿의 기계적 균질화를 수행했습니다. 약간의 수정을 가한 제조업체의 프로토콜에 따라 전체 추출을 수행했습니다(70°C에서 단백질분해효소 K 배양 시간을 2시간으로 연장). DNA 농도는 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 평가하고 16S rRNA 유전자 증폭 전에 -20oC에서 보관했습니다.
2.3. 16S rRNA 유전자 증폭 및 시퀀싱
16S rRNA 유전자 서열은 이전에 설명한 대로 V4 영역(F515/R806)에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭되었습니다[56]. 간단히 말하면, 98°C에서 30초 동안 초기 변성된 PCR 반응(30μL)(KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA)당 25ng의 DNA가 사용되었고, 이후 25주기(98°C에서 10초)가 수행되었습니다. C, 55°C에서 20초, 72°C에서 20초). 반응은 3중으로 수행되었고, 샘플당 풀링되었으며, 자기 비드 기반 클린업 시스템(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)으로 정제되었습니다. Nextera 기술(Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 인덱싱된 라이브러리를 얻기 위해 제한된 주기 PCR을 통해 라이브러리 준비를 수행한 후 두 번째 AMPure XP 자기 비드 청소 단계를 수행했습니다. 그런 다음 인덱싱된 샘플을 동일한 농도 4nM로 정규화하고 풀링한 다음 회사 프로토콜(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)에 따라 2 x 300bp 쌍방향 프로토콜을 사용하여 Illumina MiSeq 플랫폼 PE300에서 시퀀싱했습니다.
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2.4. 16S rRNA 유전자 서열 분석 데이터의 처리 및 통계 분석
원시 시퀀스는 QIIME 2 [57] 파이프라인을 사용하여 처리되었습니다. 길이 및 품질 필터링(기본 매개변수) 후에 판독값은 필터링되어 DADA2를 사용하여 운영 분류 단위(OTU)에 할당되었습니다[58]. 분류학적 할당은 VSEARCH 알고리즘(https://github.com/torognes/vsearch, 11월 9일 액세스022) 및 Silva 데이터베이스 v128(https://www.arb-silva.de)에 의해 수행되었습니다. /; 11월 9일 2{{4{42}}}}22)에 액세스했습니다. ASV 테이블은 6.147 깊이에서 희박화에 의해 정규화되어 모든 샘플이 희박 곡선 끝의 고원에 도달했습니다. 알파 다양성은 OTU 풍부도(관찰), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson(InvSimpson) 생태 지수의 두 가지 측정 기준을 사용하여 평가되었습니다. 베타 다양성의 경우 Bray-Curtis 비유사성, Jaccard 유사성, Weighted 및 Unweighted UniFrac 측정항목[59]을 PCoA(Principle Coordinates Analysis)로 계산하고 플롯하여 샘플 간의 실제 거리를 시각화했습니다. OTU 카운트 테이블을 정규화하기 위해 샘플당 63{44}}5개 시퀀스의 깊이에서 100회 희박화를 수행했습니다. OTU 분류 할당에서 얻은 출력은 분류 테이블로서 정규화된 OTU 테이블을 분류 수준 L2(문), L5(가족) 및 L6(속)에 대한 테이블로 축소하는 데 사용되었습니다. 통계 분석은 R(https://www.R-project.org/; 11월 25일 액세스022; 버전 4.2.0)을 사용하여 수행되었습니다. R 패키지 "vegan"(버전 2.6-4) [60]은 PCoA 또는 주성분 분석(PCA)에 따른 그룹의 구성 차이를 비교하기 위해 베타 다양성 측정항목을 생성하는 데 사용되었습니다. 패키지 및 데이터 분리는 유사 F 비율("vegan"의 "Adonis" 기능)을 사용한 순열 테스트를 통해 테스트되었습니다. 그룹 간의 베타 다양성 측면에서 분리는 거리 행렬을 사용한 분산의 순열 다변량 분석(PERMANOVA, "비건"의 "Adonis" 기능)으로 테스트한 반면, 그룹 내 분산의 차이는 그룹 분산 테스트(PERMDISP)의 다변량 동질성으로 테스트했습니다. , "vegan"의 "betadisper" 기능). 최소 4개 샘플에 존재하지 않는 분류군은 분석에서 제외되었습니다. 분류군의 상대적 존재비 측면에서 차이는 먼저 4개 그룹 사이의 예비 Kruskal-Wallis 테스트를 통해 평가한 후 다음 비교 쌍 간의 Wilcoxon 테스트를 통해 추가로 평가했습니다: CLM 대조 대 CLM HSD, 야생조류 대조조 대 야생조류 HSD, CLM 대조 vs. wildling Control, CLM HSD vs. wildling HSD. wildling과 CLM 사이의 분류학적 차이를 평가하기 위해 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/, 2022년 11월 25일 액세스)를 사용하여 속 수준에서 주요 특징을 구별했습니다. 61]. LEfSe 결과는 선형 판별 분석(LDA) 점수 임계값이 1.0보다 높은 막대 그래프로 표시되었습니다. 필요할 때마다 Benjamini-Hochberg 방법으로 다중 비교의 p-값을 조정했습니다. 0.05 이하의 FDR(false discovery rate)은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다. * p 0.05 이하; ** p 0.01 이하; *** p 0.001보다 작거나 같습니다. 식품 내 다양한 NaCl 함량(0.5% 및 4% NaCl 식품 함량)의 미생물군집 간의 기능적 차이는 16s rDNA 유전자 서열 분석 데이터(https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/; 2022년 11월 29일에 액세스함 PICRUSt2 2.4.1) [62] PICRUSt2 파이프라인은 표준 매개변수(https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; 2022년 11월 29일 액세스)를 사용하여 DADA2의 대표적인 서열과 풍부도 테이블에 적용되었습니다. 전체 파이프라인 출력에서 KEGG Orthology 및 MetaCyc 경로에 대한 메타게놈 예측은 예측 기능을 행으로, 샘플을 열로 사용하여 테이블로 작성되었으며 HSD 체제에 따른 야생 및 CLM의 장내 미생물 기능을 비교하는 데 사용되었습니다. 두 모델에서 HSD 소비에 대한 추가 분석을 위해 첫 번째(PC1), 두 번째(PC2) 및 세 번째 주성분(PC3)에 의한 wildling과 CLM 간의 변화에 가장 많이 기여한 미생물 군집 예측 기능을 선택했습니다. 그런 다음 예측 함수 풍부도가 있는 행렬을 정규화하고 CLR(중심 로그 비율) 값으로 변환하고 야생 및 CLM 모두에 대해 log2평균 비율(HSD/대조군)을 계산했습니다. 마지막으로 Wilcoxon-test를 통해 그룹 간 log2mean 비율을 비교하고 설형 그래프로 표시했습니다. 그룹 간의 차이는 Wilcoxon-test 및 Kruskal-Wallis 테스트 기능을 사용하고 Holm 또는 Benjamini-Hochberg 방법으로 조정된 p 값을 사용하여 R 소프트웨어에서 통계적으로 비교되었습니다.
3. 결과
3.1. HSD는 CLM 및 Wildling Gut Microbiota의 다양성과 구성에 영향을 미칩니다
생쥐의 야생 유래 장내 미생물 생태계에 대한 HSD의 영향을 조사하기 위해 우리는 야생 생쥐와 CLM에 HSD 또는 대조 식단을 공급했습니다. 마우스는 2주 동안 식이요법을 유지했으며, 14일째에 수집된 대변 펠릿에서 16S RNA 유전자 시퀀싱을 통해 대변 장내 미생물군 구성을 조사했습니다(그림 1A). 이전 보고서에 따르면 CLM 및 야생 생쥐의 대조군과 HSD 그룹 사이에 체중 측면에서 큰 차이가 발견되지 않았습니다[29]. 기준선에서 두 모델 CLM과 야생 쥐 사이의 서로 다른 장내 미생물군을 평가하기 위해 우리는 알파 다양성(Observed 또는 Richness, Chao1, Shannon, Simpson 및 Inverse Simpson 지수), 베타 다양성(Bray-Curtis 비유사성) 및 주요 분류학적 차이. 이전 연구[54]와 일치하여, 야생 장내 미생물군은 CLM보다 더 뚜렷하고 더 이질적인 미생물 조성뿐만 아니라 더 큰 미생물 풍부함(그림 1B, 모든 알파 다양성 지수)을 특징으로 합니다(그림 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, wildling 대 CLM 및 그림 S1). 미생물 특성 측면에서 CLM과 야생 쥐의 장내 미생물은 서로 다른 박테리아 분류군을 특징으로 합니다(그림 S1). Rosshart et al. [54], 야생 쥐의 박테리아 분류군은 Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter 및 병원성 속 Helicobacter에 속하며, 이 모델의 야생 유래 비-가축 프로필을 특징으로 합니다(그림 S1).
그림 1. CLM(n= 10/그룹) 및 야생 쥐(야생 Ctrl의 경우 n=11, 야생 HSD의 경우 n=12)의 박테리아 구성에 대한 HSD의 영향. (A) 실험 설계. C57BL/6 CLM 또는 wildling 생쥐에게 0.5% NaCl(대조군, Ctrl) 또는 고염도 4% NaCl(HSD)을 먹였으며 16S rRNA 유전자 앰플리콘 서열 분석을 특징으로 하는 장내 세균 공동체 장을 섭취했습니다. (B) CLM 및 야생 동물의 대변 장내 미생물의 알파 다양성 지수; 왼쪽부터 다음 인덱스가 표시됩니다: Observed(OUT 풍부함), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson(Inverse Simpson). 그룹 간의 차이는 Wilcoxon-test를 통해 통계적으로 평가됩니다. (C) CLM 대 Wildling(상단), CLM 제어 대 CLM HSD(왼쪽 하단), Wildling 제어 대 Wildling HSD(오른쪽 하단) 사이의 Bray-Curtis 비 유사성 측정법의 베타 다양성 안수에 대한 주요 좌표 분석 플롯. 그룹 간의 분리 및 균질성은 각각 PERMANOVA 및 PERMDISP 테스트를 통해 계산되었습니다. * p 0보다 작거나 같습니다.05; ** p 0보다 작거나 같습니다.01; **** p 0보다 작거나 같습니다.0001. 그림 1. CLM(n= 10/그룹) 및 야생 쥐(야생 Ctrl의 경우 n=11, 야생 HSD의 경우 n=12)의 박테리아 구성에 대한 HSD의 영향. (A) 실험 설계. C57BL/6 CLM 또는 야생 쥐에게 0.5% NaCl(대조군, Ctrl) 또는 고염도 4% NaCl(HSD)을 공급하고 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱을 특징으로 하는 장내 세균 공동체 장을 섭취했습니다. (B) CLM 및 야생 동물의 대변 장내 미생물의 알파 다양성 지수; 왼쪽에서 오른쪽으로 다음 인덱스가 표시됩니다: Observed(OUT 풍부함), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson(Inverse Simpson). 그룹 간의 차이는 Wilcoxon 테스트를 통해 통계적으로 평가됩니다. (C) CLM 대 Wildling(상단), CLM 제어 대 CLM HSD(왼쪽 하단), Wildling 제어 대 Wildling HSD(오른쪽 하단) 사이의 Bray-Curtis 비 유사성 측정법의 베타 다양성 안수에 대한 주요 좌표 분석 플롯. 그룹 간의 분리 및 균질성은 각각 PERMANOVA 및 PERMDISP 테스트를 통해 계산되었습니다. * p 0.05 이하; ** p 0.01 이하; **** p 0.0001보다 작거나 같습니다.
HSD는 박테리아 다양성의 상당한 감소(그림 1B, 모든 알파 다양성 지수)와 CLM 구성의 상당한 미생물 변화를 유도했습니다(그림 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl 대 CLM HSD). 대조적으로, 야생 생쥐의 장내 미생물은 CLM과 다르게 HSD에서 더 높은 다양성을 특징으로 하며(그림 1B, 관찰 및 Chao1 지수), CLM에 비해 HSD에서 덜 뚜렷한 미생물 구성 변화를 특징으로 합니다(그림 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, wildling Ctrl 대 wildling HSD).
3.2. Wildling 생쥐의 장내 미생물 구성은 CLM보다 HSD에 더 강합니다
Wildling과 CLM 사이의 세균 구성 차이는 분류학적으로 추가로 특성화되었습니다. 문 수준에서 상대적 풍부도 측면에서 가장 풍부한 문은 다음과 같습니다: Firmicutes(CLM: 52 ± 12%, wildling: 32 ± 34%), Bacteroidota(CLM: 24 ± 23%, wildling: 57 ± 19%), Actinobacteriota(CLM: 1{{10}} ± 7%, wildling: 0.7 ± 1.3%) 및 Verrucomicrobiota(CLM: 24 ± 23%, wildling: 0%/검출되지 않음)(그림 2). 장내 미생물 프로필은 야생 쥐와 CLM 사이의 대변 샘플에서 검출된 모든 문에 대해 더욱 다양한 풍부함을 보여주었습니다(그림 2). 특히 핵심 미생물군인 Firmicutes, Bacteroidota 및 Verrucomicrobiota는 두 모델 간에 크게 달랐습니다(그림 2). 보다 구체적으로, 가족 수준에서 Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae 및 Akkermansiaceae를 포함하여 이전에 HSD에 민감한 것으로보고 된 대부분의 박테리아에 대해 wildling 대 CLM 장내 미생물에서 다른 기여가 관찰되었습니다 (그림 3). 이에 따라 앞서 언급한 가족의 주요 구성원에 대한 야생 표본과 CLM 표본 사이의 속 수준에서 유사한 경향이 확인되었습니다. 이들 중 가장 대표적인 것은 Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum 및 Akkermansia였습니다(그림 S1 및 4). CLM 및 야생 장내 미생물 구성에 대한 HSD의 영향을 추가로 특성화하기 위해 우리는 다양한 분류 수준에서 식이요법의 영향도 분석했습니다. 문 수준에서 HSD로 처리된 CLM 장내 미생물은 Firmicutes의 상당한 고갈과 Verrucomicrobiota의 농축을 특징으로 했지만(그림 2), 야생 샘플에서 주요 문 중 어느 것도 HSD의 영향을 받지 않았습니다(그림 2). 가족 수준에서 CLM 장내 미생물은 Lactobacillaceae와 같은 젖산 생산 박테리아뿐만 아니라 Peptostreptococcaceae 및 Clostridiaceae와 같은 SCFA 생산 박테리아의 상당한 고갈을 특징으로 합니다 (그림 3). 또한 HSD 공급 CLM에서는 Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae 및 Eggerthellaceae의 증가를 관찰했습니다 (그림 3). 대조적으로, HSD는 야생 장내 미생물총의 다양한 박테리아군에 영향을 미쳤으며, 그 중 두 가지 매우 풍부한 Muribaculaceae 및 Prevotellaceae가 HSD에 따라 증가했습니다(그림 3). CLM에서 HSD 효과에 가장 크게 기여한 박테리아 조절에는 Akkermansia, Parasutterella 및 Enterorhabdus 속의 증가와 Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxyreducens 그룹, Muribaculum 및 Anaerovorax의 감소가 포함되었습니다(그림 4). Roseburia를 제외하고 앞서 언급한 속 중 어느 것도 야생 장내 미생물군에서 HSD의 영향을 받지 않은 반면, Anaerovorax 속은 CLM과 반대 경향을 보였습니다(그림 4).
그림 2. CLM의 장내 미생물군(n= 10/그룹) 및 야생 쥐(야생 Ctrl의 경우 n=11, 야생 HSD의 경우 n=12)의 박테리아 문에 대한 HSD 효과. 문(phyla)의 상대적 풍부함 측면에서 총 구성은 각 개체당 막대 그래프(상단)와 특정 문(하단)에 대한 상자 그림으로 표시됩니다. Wilcoxon-test를 통해 그룹 간 통계적 비교를 수행했습니다. * p 0보다 작거나 같습니다.05; ** p {{10}}.01보다 작거나 같음; *** p 0.001 이하; **** p 0.0001보다 작거나 같습니다.
그림 3. 고염분 식품 섭취가 CLM 박테리아군(n=10/그룹) 및 야생 생쥐(야생 Ctrl의 경우 n=11, 야생 HSD의 경우 n=12)에 미치는 영향. 가족 수준의 전체 구성은 각 개인별 막대 그래프(위)와 특정 가족에 대한 상자 그림(아래)으로 표시됩니다. Wilcoxon-test를 통해 그룹 간 통계적 비교를 수행했습니다. * p 0보다 작거나 같습니다.05; ** p {{10}}.01보다 작거나 같음; *** p 0.001 이하; **** p 0.0001보다 작거나 같습니다.
그림 4. CLM(n= 10/그룹) 및 야생 쥐(야생 Ctrl의 경우 n=11, 야생 HSD의 경우 n=12)의 박테리아 속의 변화. 속 수준의 전반적인 상대적 존재비 기여도는 각 개체당 원형 막대 그래프(위)와 특정 속에 대한 상자 그림(아래)으로 표시됩니다. Wilcoxon-test를 통해 그룹 간 통계적 비교를 수행했습니다. * p 0보다 작거나 같습니다.05; ** p 0보다 작거나 같습니다.01; *** p 0.001 이하; **** p 0.0001보다 작거나 같습니다.
3.3. HSD는 CLM의 예측 미생물 기능에 영향을 주지만 Wildling 생쥐에는 영향을 미치지 않습니다.
PICRUSt 2 출력은 KEGG Orthology 및 MetaCyc 경로 주석 모두에 대해 wildling HSD와 처리되지 않은 wildling 마우스의 미생물 군집 기능 사이에 유의미한 차이를 감지하지 못했습니다. KEGG Orthology(그림 5A). CLM에 대한 HSD의 영향은 KEGG Orthology에 대한 예측 기능의 현저한 감소를 특징으로 하며, 그중에는 전분 및 자당 대사에 관여하는 유전자 spp(자당-6-포스파타제) 및 pfkA(포스포프럭토키나제 1)가 포함됩니다. 이전 연구 결과 [28] (그림 5A). 또한, HSD를 공급한 CLM의 장내 미생물은 막 수송(철 수송을 위한 feoB, AB 2P AB 2 투과효소 단백질, AB 2A AB 2 ATP 결합 단백질), 글루타민 생합성(glnA)에 관여하는 유전자의 예측 기능 감소를 특징으로 합니다. , LacI 계열 전사 조절제(lacI, galR) 및 트랜스케톨라제(tktA, tktB)(그림 5A). MetaCyc 경로의 경우 HSD는 질산염 감소(탈질화 경로), 갈락토오스 분해(D-갈락타레이트 분해, D-글루카레이트 및 D-갈락타레이트 분해의 상위 경로), 페닐-프로파노에이트 분해, 지방과 관련된 예측 기능의 CLM 장내 미생물군을 상당히 풍부하게 했습니다. 산성 회수, 부탄산으로의 석신산염 분해 및 아미노산 분해(방향족 아민 분해, L-류신 분해)(그림 5B). 또한, 이전 연구 결과[28]와 일치하여, CLM의 HSD 장내 미생물군은 아미노산 생합성(L-알라닌 생합성의 상위 경로, L-라이신 생합성), 혼합 산 발효에 대한 예측 기능을 상실했으며, N-와 같은 추가적인 새로운 특징이 상실되었습니다. 아세틸글루코사민/N-아세틸-만노사민/N-아세틸뉴라미네이트 분해 및 데옥시리보뉴클레오사이드 분해(피리미딘 및 퓨린 분해, 이노신5포스페이트 생합성 III)(그림 5B).
그림 5. 계속
그림 5. HSD가 CLM(n=10/그룹) 및 야생 동물(야생 Ctrl의 경우 n=11, 야생 HSD의 경우 n=12) 장내 미생물군에서 장 예측 메타게놈 기능에 미치는 영향. KEGG Orthology 주석(A) 및 MetaCyc 경로(B)에 대한 설형 문자 플롯으로 플롯된 PICRUSt2 출력은 HSD 대 Ctrl 샘플 간의 예측 함수 수의 log2 평균 비율로 표현됩니다. 모든 통계적 비교는 Wilcoxon-test를 통해 Ctrl 그룹과 HSD 그룹 간에 수행되었습니다.
4. 토론
복잡하고 다양한 야생 장내 미생물군은 특정 질병 모델[51] 및 고지방 섭취와 같은 식이요법에 더 탄력적인 것으로 알려져 있습니다[54,55]. 그러나 이전 연구에서는 높은 나트륨 섭취가 쥐의 야생 유래 장내 미생물에 미치는 영향을 평가한 적이 없습니다. 여기에서 우리는 HSD가 CLM과 비교하여 야생 장내 미생물에 어떻게 영향을 미치는지 처음으로 조사했습니다. 흥미롭게도, 우리의 결과는 CLM에 비해 야생 미생물군집이 구성 및 예측 기능 수준 모두에서 HSD 장애에 더 강한 것으로 나타났습니다. 높은 소금 섭취가 장내 미생물 구성과 면역 항상성을 변화시켜 심혈관 질환이나 자가면역 질환과 같은 다양한 질병의 위험을 악화시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다 [25,29,31,34,63-65]. 이전 보고서와 마찬가지로, CLM에서 HSD로 인한 장내 미생물의 변화는 미생물 다양성, 구성 및 예측 기능의 상당한 변화를 특징으로 합니다[28]. Peptostreptococcaceae 계열 및 Lactobacillus, Roseburia 및 Tuzzerella 속과 같은 건강 증진 박테리아는 CLM의 상대적 풍부함 측면에서 감소한 반면 Akkermansia는 HSD 공급 그룹에서 크게 증가했습니다. 우리는 또한 Defluvitaleaceae, Enterorhabdus 및 Parasutterella에서 HSD의 상대적 풍부도가 더 높은 것을 발견했습니다. 흥미롭게도 Parasutterella 속은 CLM과 인간 모두의 장내 미생물총의 핵심 구성 요소이며, 여기서 무사카로리틱 및 숙신산염 생산자로 작용합니다[66]. Eggerthellaceae 계통의 Enterorhabdus와 Sutterellaceae 계통의 Parasutterella는 모두 IBD 환자에서 풍부한 것으로 알려져 있으며 [67,68] HSD가 질병 발병에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 추가로 나타냅니다. 그러나 흥미롭게도 야생 생쥐는 CLM과 같은 HSD로 유발된 미생물 이동과 유사한 개체를 나타내지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 관찰된 OTU 및 Chao1 측정항목에 대해 HSD에서 야생 다양성이 크게 증가했으며 Erysipelatoclostridium, Roseburia 및 Lachnospiraceae의 감소와 함께 Anaerovorax의 증가와 함께 야생 장내 미생물의 HSD 교란에 소수의 분류군만이 관여했습니다. UCG-004 속. 로즈뷰리아는 HSD를 먹인 CLM이 여전히 HSD를 먹인 야생 쥐에 비해 이 박테리아가 더 많이 존재한다는 특징이 있음에도 불구하고 해당 대조군과 비교하여 HSD 그룹 간에 일반적으로 공유되는 유일한 박테리아 특징이었습니다. 주목할 만한 점은 Roseburia와 같은 부티레이트 생성 박테리아가 궤양성 대장염 환자에서 상대적으로 더 적은 것으로 나타났으며[69], 이러한 감소는 인간 피험자의 IBD 유전적 위험과도 상관관계가 있는 것으로 관찰되었습니다[70]. 이는 Roseburia 또는 Lactobacillus와 같은 박테리아 속의 변화가 고혈압 위험과 관련이 있는 것으로 밝혀진 이전 연구 결과와 일치하며, 이는 아마도 서구식 식단에 의해 촉진될 수 있습니다[71]. 장의 박테리아 구성은 장 운동성 및 생리학과도 연관되어 있습니다[72].
남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능
Anaerovorax 속은 이전에 장의 생리가 비정상이고 운동성이 감소된 생쥐에서 관찰되었습니다[73]. 그러나 야생 생쥐에 대한 HSD의 Anaerovorax 농축은 장 항상성과 적절한 기능의 맥락에서 이 분류군의 다른 역할로 이어질 수 있습니다. 이전 연구 결과와 일치하여 우리는 CLM의 HSD 그룹에서 Akkermansia 속의 증가를 관찰한 반면[28] 야생 생쥐의 장내 미생물은 이 속의 고갈되었으며 이는 이 모델에 대한 이전 연구와도 일치합니다[51, 53~55]. Akkermansia 속은 숙주 면역학적 및 대사 프로필(예: 비만 및 제2형 당뇨병) 개선에 대한 긍정적인 효과로 인해 잠재적인 프로바이오틱스이지만[42,74-77], 이 속의 역할은 부정적으로 인해 여전히 불분명합니다. 대장암[78], 파킨슨병[79,80] 및 다발성 경화증 환자[81]의 임상 결과와의 상관관계. MetaCyc 경로를 통해 얻은 이전 결과와 일치하여[28], HSD에 따른 CLM은 KEGG 정형화에 대한 전분 및 자당 대사와 관련된 예측 미생물 기능이 감소한 것으로 나타났습니다. 그러나 HSD를 먹인 야생 쥐의 장내 세균 구성의 사소한 변화는 예측 박테리아 기능에 중요한 변화를 유도하지 못했으며, 이는 야생 새끼에서 유래된 장내 미생물군과 대사/생태적 네트워크가 훨씬 더 안정적이고 훨씬 더 쉽게 적응할 수 있음을 나타냅니다. CLM 장 생태계와 비교하여 HSD로 인한 식이 변화는 추가 조사가 필요합니다. 또한 언급할 가치가 있는 것은 차별적인 식이 요법에 따라 장내 세균 네트워크에 장내 곰팡이 군집이 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 이전 연구에서는 박테리아와 곰팡이 사이의 잠재적인 상호 작용이 숙주 면역 체계의 항상성과 질병 발병에 어떻게 연관되어 있는지 이미 제안했습니다[82-85]. 이러한 맥락에서 CLM은 야생 쥐에 비해 박테리아 복잡성이 낮기 때문에 더욱 제한되며, 이는 다양한 장내 균총의 확립을 방해할 수 있습니다[54]. 향후 연구에서는 Wildling 모델을 사용하여 장내 미생물군 및 숙주 면역 환경에서 장내 곰팡이 군집의 기여도를 확인할 수 있을 것입니다. 요약하자면, 우리의 연구는 CLM의 길들여진 장내 세균 공동체와 비교하여 높은 나트륨 섭취가 천연 야생 유래 장내 미생물 생태계에 얼마나 영향을 미치는지에 대한 데이터를 제공합니다. 우리의 연구는 HSD가 CLM의 가축화된 장내 미생물에 영향을 미치는 것과 동일한 방식으로 야생 쥐의 박테리아 분류군과 장내 미생물에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다. 고지방식과 같은 다른 식이 요법이나 조건에 대해 이전에 언급한 바와 같이 이러한 차이는 더 복잡한 장 생태계에 대한 식이 개입의 영향을 요약하고 추정하기 위해 자연 쥐 모델 시스템에 대한 향후 연구가 필요함을 나타냅니다. 인간처럼.
cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.
