신장 결석의 형성을 예방하고 줄이는 방법은 무엇입니까?

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파트 Ⅰ Ⅱ: 신장 결석 형성 초기 단계에서 TGF-1/Smad 신호에 의해 활성화된 인지질 스크램블레이스에 의해 조절되는 포스파티딜세린 역전

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

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소개

요로결석은 인간에게 가장 흔한 질병 중 하나로 여러 비뇨기과적 합병증과 관련이 있다[1]. 칼슘 옥살레이트(CaOx)는 배양된 세뇨관 세포를 손상시키는 것으로 보고되고 있으며, 그 후 세포막 포스파티딜세린(PS)은 시험관 내에서 내부 층에서 외부 층으로 반전되어 다음에서 중요한 역할을 합니다.신장 결석형성 [2]. 세포 수준에서 수행된 다양한 연구[{1}}]에서도 유사한 결과가 보고되었습니다. 그러나 CaOx 매개 손상으로 인한 신장 세뇨관 세포의 PS 외부화의 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 이전 연구에서는 고농도의 옥살산칼슘이 활성산소종(ROS)의 과잉생산을 초래하고[7], 이는 후속적으로 신세뇨관 세포에서 PS 외부화에 기여하여 CaOx 결정의 핵형성 및 성장을 초래하는 것으로 나타났습니다[8]. ROS와 지질 과산화는 인지질 스크램블라제(PLSCR)를 강력하게 활성화하는 반면[9], 글루타티온, 코엔자임 Q10 또는 이데베논(합성 코엔자임 Q10 동족체)과 같은 ROS 제거제에 노출되면 다낭성 신장 질환에서 PLSCR의 활성화가 감소합니다[10] . 세포막에 고정되어 있는 PLSCR[11]은 농도 구배를 따라 막 양쪽에서 PS의 빠른 양방향 이동을 촉매할 수 있는 세 가지 인지질 전환 효소 중 하나로 기능합니다[12]. 생리학적 조건에서 세포막은 비대칭 상태이며 PLSCR은 막에 영향을 미치지 않는다[13]. 그러나 진핵 세포가 손상되면 PLSCR이 활성화되어 PS를 내부층에서 외부층으로 이동시킵니다[14,15]. 또한 차이니즈 햄스터 난소 K1 세포에서 PLSCR의 과발현은 PS 외부화를 자극하여 세포자멸사 동안 PS가 세포 표면으로 외부로 이동하는 것을 향상시키는 것으로 보고되었습니다[16]. 따라서 우리는 PLSCR이 ROS의 활성화를 통해 세뇨관 세포막에서 PS 외부화에도 관여한다는 가설을 세웠다.

옥살산염 유도 ROS 생성의 잠재적인 분자 메커니즘은 ROS 생성에 역할을 할 수 있는 TGF{1}}/Smad 신호전달의 유도를 통해 발생합니다[17,18]. 실제로 TGF- 1/Smad 신호전달은 사구체신염, 신장 간질 섬유증 및 신결석증과 같은 수많은 신장 질환에 관여하는 것으로 보고되었습니다[19]. 또한 TGF{6}} 처리된 단핵세포는 PS의 내부층에서 외부층으로의 플립핑(flip-ping)을 일으켜 세포막에서 PSexternalization을 나타낸다[20]. 그러나 우리가 아는 한 신세뇨관 세포막에서 TGF- 1/Smad 신호전달과 PSeversion 사이의 관계는 아직 알려지지 않았습니다. TGF{10}}가 쥐의 초기 단계에서 PLSCR을 활성화하여 신세뇨관 세포막에서 PS 역전에 관여한다는 가설을 세웠습니다.신장 결석ROS에 의해 매개되는 형성.

따라서 우리는 TGF{0}}/Smad 신호가 ROS 활성화를 통해 PS 외부화를 자극하는지 여부와 TGF가 신장 세뇨관 세포막의 초기 단계에서 PLSCR을 활성화하는지 여부를 조사했습니다.신장 결석체외 및 생체 내에서 발달하여 병인학에 대한 이론적 토대를 마련합니다.신장 결석형성.

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재료 및 방법

초기 단계 CaOx 신장 결석 형성의 쥐 모델

하얼빈 의과대학 실험동물센터에서 무게 200±20g의 깨끗한 3-개월령 수컷 Wistar 쥐 60마리를 제공하고 실온(22도 ±2도) 및 50-70퍼센트 습도에서 사육했습니다. 적응 사육 3일 후, 무작위로 3개 그룹(20마리/그룹)으로 나누었다.신장 결석, 그리고신장 결석플러스 SB431542(TGF{1}}/Smad 신호전달 경로 억제제).

신장 결석형성은 신세뇨관 세포 손상 후 초기 병리학적 변화로 시작됩니다[21,22]. 이 손상 과정을 연구하기 위해 초기 단계의 쥐 모델신장 결석표준화된 접근 방식이 아직 보고되지 않았기 때문에 형성이 확립되었습니다. 신세뇨관 세포 손상 후 초기 변화를 관찰하기 위해 Liet al.에서 보고한 방법을 적용했습니다. [23]. 간단히 말해서, 대조군의 쥐에게는 경구 위관영양법을 통해 매일 2mL의 증류수를 투여한 반면, 대조군의 쥐에게는신장 결석그룹은 경구 위관영양법을 통해 매일 1% 에틸렌 글리콜 용액 2mL와 1% NH4Cl 용액을 투여했습니다. 쥐들이신장 결석플러스 SB431542 그룹은 SB431542 공용매(5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Shanghai, China)를 7일마다 복강 내 주사하였다[24]. 음식과 물은 임의로 제공되었습니다. 14일째에, 쥐를 마취 과량 투여(펜토바르비탈 나트륨, 200 mg/kg, 복강 내 주사)로 안락사시키고 신장을 적출하였다. 왼쪽 신장은 후속 단백질 검출을 위해 액체 질소에 즉시 보존되었습니다. 우측 신장을 고정한 후 탈수하여 파라핀 왁스에 포매하였다. 모든 동물 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다. 실험 절차는 하얼빈 의과대학 제1부속병원 동물실험사용윤리위원회(승인번호:2020005, 중국 하얼빈)의 승인을 받았습니다.

신장 조직의 결정 형성

조직 샘플은 Pizzolato 방법을 사용하여 염색되었고[23], CaOx 결정은 편광 광학 현미경(Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, China)으로 관찰되었다. ImageJ 1.49v(National Institutes of Health, USA)를 사용하여 Pizzolato 양성 영역을 측정하고 단면의 전체 조직 면적의 permill age로 표현하였다.

유세포 분석에 의한 생체 내 신세뇨관 세포막의 PS 검출

신장 상피 세포 PS 노출은 이전에 설명된 바와 같이 fluorescein isothiocyanate(FITC)로 표지된 Annexin V 염색 분석을 사용하여 평가되었습니다[2]. 세포는 공초점 레이저 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 (각 그룹에서) 관찰되었다. PS 외부화의 양은 Annexin V-양성 세포의 백분율로 결정하였다. 샘플의 Annexin V 형광은 유세포 분석기(488 nm 여기/530 nm 방출; Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 측정되었습니다.

Western blotting에 의한 신세뇨관 세포막의 TGF{0}} 및 Smad7 수치 측정

동결된 조직 시료를 회수한 후 천연막 단백질 추출키트인 ProteoExtract(M-PEK)(MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였고, Bio-Rad protein assay를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 제조업체의 지침에 따라 키트(미국 캘리포니아주 허큘리스). 이어서, 4ug의 단백질을 300mA의 전극 정전류에서 1시간 동안 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔(스택 겔 100V, 분해 겔 200V)에 로딩했습니다. 젤의 단백질을 니트로셀룰로오스 막(Kexing Co., Beijing, China)으로 옮기고 5% 탈지분유에서 37도에서 1시간 동안 차단하고 양 항쥐 TGF 1( ab208466, Abcam, Cambridge, UK) 및 Smad7(66,478; Proteintech, 중국 우한) 항체[25]. 고추냉이 과산화효소 표지 토끼 항양 2차 항체(1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Beijing, China)를 첨가하고 37도에서 1시간 동안 배양하였다. 신호는 향상된 화학발광 시약(Abcam)을 사용하여 감지되었습니다. Gel-Pro 4.0 겔 광학 밀도 분석 소프트웨어를 사용하여 양성 밴드를 분석하고 누적 광학 밀도(IOD 값)를 측정했으며, R-값은 다음과 같이 상대 단백질 함량을 나타냅니다. PLSCR(표적)/GAPDH(참조 단백질)의 참조 IOD 값.

세포 배양 및 RNA 간섭

신장 상피 세포주(MDCK 세포, CCL34, 계대 53-90; ATCC, Manassas, VA, USA)를 항생제(10{{1{14} }}} U/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 및 10% 소 태아 혈청(Life Technologies Co.), 37도, 5% CO, 대기 및 0.25%로 계대 배양 트립신 및 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(Life Technologies Co., CA, USA). 세포를 CaOx(0.5mM; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)로 2시간 동안 처리하고 0.5mM CaOx 및 100ug/mL 중화 항-TGF{18}} 항체(R&D Systems, Minneapolis , 미네소타, 미국) 2시간 동안. 모든 실험은 삼중으로 수행되었습니다.

PLSCRin PS 역전의 역할을 결정하기 위해 신세뇨관 상피 세포를 PLSCR siRNA로 형질감염시켰다[26]. siRNA는 Anhui General Biological System(중국 Anhui, 표 1 참조)에 의해 설계 및 합성되었습니다. LipofectamineTM 2{12}}00(Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)은 제조업체의 지침에 따라 형질감염에 사용되었습니다. . 형질감염 24시간 후, 세포를 트립신으로 분해하고, 1000xg에서 5분 동안 원심분리하고, PBS로 2회 세척하고, 다시 원심분리하였다. 상청액을 버리고 펠렛을 PBS에 현탁시켜 밀도 1 x 10도 세포/mL의 단일 세포 현탁액을 형성하였다. FAM(카르복시플루오레세인) 발현의 양성 비율은 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 93% ±5%였습니다. TGF 1과 PLSCR 사이의 관계를 추가로 평가하기 위해 세포를 0.5mM CaOx 또는 10ng/mL TGF{15}}로 2시간 동안 처리한 후 PLSCR siRNA로 형질감염시켰습니다.

Western blotting에 의한 신세뇨관 세포막의 PLSCR 수치 측정

단백질은 천연막 단백질 추출키트인 ProteoExtract(Chemical Book Co., Beijing, China)를 이용하여 추출하였고, 단백질 농도는 Bio-Rad protein assay kit(Noble-Ryder Co., Beijing, China)를 이용하여 측정하였다. 이어서, 4{26}} ug의 단백질을 8% SDS-polyacrylamide gel(stacking gel 100V, resolving gel 200V)에 300mA의 정전류에서 1시간 동안 로딩하였다. 젤의 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Kexing Co., Shenzhen, China)으로 옮기고 37C에서 1시간 동안 5% 탈지유로 차단하고 양 항쥐 PLSCR 모노클로날 항체(1:200, PAB781HuO1, Abcam, 중국 광저우). 그 다음 양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 토끼 항-양 2차 항체를 첨가하고(1:400), 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 세척한 후, 강화 화학발광 시약(Abcam, Guang-zhou, China)으로 신호를 검출하였다. Gel-Pro 4.0gel 광학 밀도 분석 소프트웨어를 사용하여 양성 밴드를 분석하고 IOD 값을 측정했으며 R-값은 위에서 설명한 상대 단백질 함량을 나타냅니다.

표 1 PLSCR에 대한 siRNA 서열

막 포스파티딜세린 분포 측정

세포막 PS 역전의 양은 Kim et al.[27]에 의해 기술된 형광 소광법을 사용하여 결정되었습니다. 그리고 우리 연구팀[2]은 니트로벤젠-2-옥사-1,3-디아졸(NBD, 상하이, 중국)을 형광 프로브로 사용했습니다. 세포막 외층의 PS를 NBD로 표지한 후, 세포를 5mM 디이소프로필플루오로포스페이트를 함유하는 PBS에서 배양하였다. 그 후, 칼슘 옥살레이트(1.{7}}mM)를 함유하는 PBS를 첨가하고 세포를 37도에서 인큐베이션하였다. 동일한 양의 세포 현탁액을 10분마다 방출하고 RF 분광 형광계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 형광 강도를 기록했습니다. 분광형광계의 설정은 다음과 같았다: 530 nm의 방출 파장에 대해 10 nm 슬릿 폭; 및 470 nm의 여기 파장에 대한 5 nm 슬릿 폭. 다음으로 50초 동안의 평균 형광값(FT)을 기록하였다. 평균 감소 형광 강도(FD)는 또한 디티오나이트 용액을 사용하여 세포의 외부 층에서 NBD 형광을 켄칭한 후에 기록되었습니다. 그 후, 1%(w/v)Triton X{17}}를 첨가하여 세포막을 투과화했습니다. 그런 다음 세포막의 내부 층에서 NBD 형광을 켄칭하고 형광 강도(FO)를 기록했습니다. 내부 소엽에서 NBD-PS의 백분율은 나중에 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다.

PS 외부화의 백분율은 NBD-PS 내부화 측정에 사용된 원리에 따라 결정되었습니다. 외부 소엽에서 NBD-PS의 비율은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다. 외부 소엽에서 NBD-PS 비율=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

통계 분석

연속변수는 평균±표준편차로 표현된다. non-parametric paired rank-sum test, t-test, chi-square test를 사용하였다. 모든 분석은 SPSS 소프트웨어 190(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었습니다. P를 사용한 결과<0.05 were="" considered="" statistically="">

결과

TGF{0}}/Smad 신호전달은 생체 내에서 PS 외부화를 자극합니다.

쥐 모델의 신장 조직에서 결정 형성

초기 단계의 쥐 모델을 확립하기 위해신장 결석에틸렌글리콜과 염화암모늄을 쥐의 위에 2주간 투여한 후 디지털 현미경으로 각 신장 절편을 관찰하였다. 대조군 표본에서는 14일째에 결정 형성 없이 정상적인 신세뇨관 구조가 관찰되었다(Fig.1A). 신장 조직에서신장 결석그룹은 현미경으로 관찰되었으며, 신세뇨관은 가시적 미세결정으로 확장된 것으로 나타났습니다. 일부 신세뇨관에서 가끔 CaOx 결정의 축적이 관찰되어 초기 단계의 쥐 모델이 성공적으로 확립되었음을 나타냅니다.신장 결석형성 및 신세뇨관 세포 손상의 생성.

신세뇨관 세포막에 PS의 존재

세포 표면의 PS에 결합하는 형광 분자인 Annexin V-FITC는 PS 재배포를 감지하는 데 널리 사용됩니다. 우리 연구에서 정상 대조군의 MDCK 세포,신장 결석, 그리고신장 결석플러스 SB431542 그룹은 공초점 레이저 현미경으로 관찰되었습니다(그림 1B). PS-eversion 비율이 증가했습니다.신장 결석대조군과 비교한 군(P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">신장 결석플러스 SB431542 그룹은 PS 외부화의 기초 수준이신장결석그룹(P<0.05, fig.="" 1c,="">

TGF{0}} 및 Smad7 수준 측정

TGF{0}} 수준신장 결석그룹을 웨스턴 블롯팅으로 정량화하였다. 일반적인 웨스턴 블롯은 TGF- 1 수준의 농도계 분석과 함께 그림 2A에 나와 있습니다. 값은 대조군의 값으로 정규화되었고 TGF- 1 대 튜불린의 비율로 표시되었습니다. 에틸렌 글리콜 및 NH4Cl의 첨가는 대조군 세포에 비해 TGF- 1 수준을 유의하게 증가시키고 Smad7 수준을 감소시켰다(도 2A). 그러나 SB431542 + 에틸렌 글리콜 및 NH 처리는 에틸렌 글리콜 및 NH, Cl로 처리된 세포에서와 비교하여 TGF- 1 수준을 상당히 감소시키고 Smad7 수준을 증가시켰다고 합니다.

TGF는 시험관 내에서 신세뇨관 세포막에서 PLSCR 활성을 활성화합니다

PLSCR

PLSCR의 수준은 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 세포를 CaOx로 2시간 동안 처리하였다. PLSCR 수준은 대조군 세포에서는 무시할 수 있었지만 CaOx 그룹에서는 유의하게 증가했습니다(P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

NBD-PS 안쪽 움직임 장애

우리는 PLSCR 활성을 평가하기 위해 신세뇨관 상피 세포막에서 PS의 내부 및 외부 움직임을 결정했습니다. PLSCR이 외부 전단지에서 원형질막의 내부 전단지로 PS의 이동에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 형광 표지된 PS(NBD-PS)를 원형질막의 외부 전단지에 통합하고 내재화를 모니터링했습니다(그림 3). 대조군 및 CaOx 그룹에서 MDCK 세포에 의해 내재화된 NBD-PS의 양은 각각 약 46.2% 및 17.8%였다. 따라서 CaOx 그룹 세포의 PS 내재화 속도는 대조군 세포보다 현저히 낮았습니다 (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

그림 1. 대조군, 신장 결석, 신장 결석과 SB431542 그룹에서 결정 형성 및 PS 외부화가 관찰되었습니다.

(A) 14일째에 신장 조직에서 결정 형성; 화살표는 미세 결정 구조를 나타냅니다. (B) MDCK 세포는 공초점 레이저 현미경으로 관찰되었습니다.

(C) 역전율의 유세포 측정 플롯. (D) 회피율(퍼센트). 삼각형은 P를 나타냅니다.<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">신장 결석그룹

향상된 NBD‑PS 바깥쪽 움직임

PS 외부 수송이 옥살레이트에 의해 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해 MDCK 세포를 NBD-PS로 세포 내 표지하고 예시-마이크 전단지로의 이동 정도를 결정했습니다. 배양 배지는 소혈청 알부민(1% w/v)을 함유하였고, 이는 표면 발현 NBD-PS를 빠르게 추출하였다. NBD-PS의 약 34.5%가 대조군 세포에서 바깥쪽 전단지로 이동한 반면 CaOx 그룹 세포에서 바깥쪽으로 PS 이동 속도는 전체 내부 표지된 NBD-PS의 속도와 비교하여 75.3%로 증가했습니다. 대조군 세포(P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

그림 2. 대조군, 신장 결석 및 신장 결석 + SB431542 그룹에서의 TGF- 1/Smad 발현 및 신세뇨관 세포막에서의 PLSCR 발현.

(A)TGF- 1/Smad 식. (B) 상대 인지질 스크램블라제(PLSCR) 수준 및 GAPDH.P의 것으로 정규화된 발현을 갖는 대표적인 오점<>

삼각형은 P를 나타냅니다.<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

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