Mylabris Phalerata Pallas와 Mylabris Cichorii Linnaeus 간의 판별을 위한 HPLC 지문 및 스펙트럼-항종양 효과 관계
Mar 09, 2022
Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li
1 중국 쥰이 의과대학 약학부,
2 중국 구이저우성 준이시 준이의과대학 교육부 기초약리학 핵심연구실 및 교육부 민족의학 국제공동연구실.
3 기초 의학부, Zunyi Medical University, Zunyi, China, 4Guizhou Provincial College 기반 종양 예방 및 독특한 약물 치료를 위한 Key Lab, Zunyi Medical University, Zunyi, China.
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하이라이트
이 연구는 두 개의 Mylabris 종을 구별하기 위한 적용 가능하고 신뢰할 수 있으며 보다 효율적인 HPLC 방법을 제공합니다. 그리고, HPLC 핑거프린팅 및 스펙트럼-항종양 효과통합되었고 Mylabris의 새로운 마커에 대해 세 가지 중요한 감별 마커가 발견되었습니다.
추상적인
목적: HPLC 핑거프린팅 및 스펙트럼 기반 두 Mylabris 종의 구별 평가항종양 효과관계. 방법: 본 연구에서는 화학분석 및 스펙트럼 분석을 통합한 간단하고 효율적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법을항종양 효과Mylabris phalerata Pallas(MP)와 Mylabris cichorii Linnaeus(MC)의 두 종 간의 구별을 위해 관계가 개발되었습니다. 결과: 지문 분석에서 14개의 특징적인 피크를 선택하여 MP와 MC의 차이를 평가하기 위해 유사도와 패턴 인식 분석을 PCA와 OPLS-DA를 사용하여 평가했습니다. 중국 10개 지역 샘플의 HPLC 크로마토그램은 MP와 MC 사이에 차이를 보였고 7개의 특징적인 화학적 마커가 발견되었습니다. 스펙트럼에서-항종양 효과관계 분석에서 4가지 활성 마커는 IC50을 감소시키는 데 중요한 역할을 했으며 회색 관계 분석 및 다변량 선형 회귀 분석에 의해 Mylabris의 항종양 성분일 수 있습니다. 스펙트럼 효과 관계 결과와 결합된 화학 측정 분석은 피크 2(사이토신), 4(알 수 없음) 및 14(알 수 없음)가 Mylabris의 두 종을 구별하기 위한 중요한 차등 마커임을 나타냅니다.
결론: 이 방법은 MP와 MC를 구별하는 데 적용 가능하고 신뢰할 수 있으며 더 효율적이며 곤충 의약품의 품질 관리를 용이하게 하는 새로운 방법을 제공할 것입니다.
키워드: HPLC, 지문, 스펙트럼-항종양 효과, 마일라브리스, 차별
배경
중국에서 반마오라고 하는 마일라브리스는 종기, 뿌리 깊은 궤양, 복부 종괴를 치료하는 중국 전통 의학(TCM)으로 사용되어 왔으며 중요한항종양에이전트. 또한 유럽에서는 민간요법으로 널리 사용된다[1]. Mylabris의 주요 활성 성분은 효과적인 칸타리딘입니다.항종양화합물 [2]. 현대 약리학 연구에 따르면 Mylabris는 여러 활성을 가지고 있으며 이중 이중성으로 인해 종양 치료에 매우 가치가 있습니다.항암특성 및 백혈구 수를 증가시키는 능력 [3-4]. 현재 Mylabris는 Aidi 주사 및 Compound ban mao 캡슐과 같은 중국의 일부 임상 항암종 TCM 처방에 널리 사용되었습니다.
중화인민공화국 약전(2015년판)에 따르면 Mylabris는 Mylabris phalerata Pallas(MP)와 Mylabris cichorii Linnaeus(MC)의 건조체로 정의되며 식물 특성, 인구 역학 및 생태가 다릅니다. 5-6]. Mylabris는 또한 매우 독성이 강한 약물입니다. 중국에서 구할 수 있는 약물은 보통 MP와 MC가 혼합되어 있기 때문에 두 종 간의 화학적 및 활성 차이를 식별할 필요가 있습니다.
TCM에는 알려진 많은 성분과 알려지지 않은 성분이 포함되어 있기 때문에 화학 성분의 정량적 프로파일 분석은 상당한 도전 과제가 됩니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 핑거프린팅은 복잡한 시스템에 있는 대부분의 화합물에 대한 전반적인 프로파일 특성 때문에 TCM의 품질 관리(QC)에서 중요한 역할을 합니다. 또한 TCM의 지문 분석은 종 인증 및 품질 평가를 위한 재현성과 안정성이 우수하며 세계 보건 기구, 중국 국가 식품의약국(SFDA) 및 유럽 의약품 평가청(EMEA)에서 인정하고 있습니다. 최근에는 QC와 다양한 복합 천연 공급원을 식별하기 위해 HPLC 핑거프린팅을 결합한 화학 측정 분석이 개발되었습니다[7]. 그러나 한의학의 차이를 구별하는 것은 임상적 사용에 더 중요한 활성성분의 차이를 반영할 수 없기 때문에 비효율적이다. 지금까지 스펙트럼항종양 효과관계 접근법은 TCM의 생리 활성 성분을 성공적으로 식별하는 데 사용되었습니다[8]. 화학 측정 분석 및 스펙트럼-항종양 효과 관계와 결합된 HPLC 지문은 여러 TCM 소스의 차이를 더 잘 설명할 것입니다.
최근에 Mylabris의 품질을 결정하는 데 사용할 수 있는 cantharidin의 함량을 결정하는 몇 가지 방법이 보고되었습니다[9]. 일부 크로마토그래피 지문은 QC [10-11]에도 적용되었습니다. 단 하나의 연구에서만 HPLC를 기반으로 하는 Mylabris의 수용성 화합물의 구배 용출을 포함하는 방법을 사용했습니다. 한편, 10개의 샘플만 사용되었으며 MC 샘플은 사용되지 않았습니다[12]. 우리가 아는 한, 화학적 조성과 활성을 기반으로 MP와 MC를 구별하는 것은 이전에 연구된 적이 없습니다.
본 연구는 HPLC 핑거프린팅과 화학분석 및 스펙트럼 분석을 결합하여 두 종류의 Mylabris를 구별하는 간단하고 효율적인 방법을 개발하는 것을 목표로 하였다.항종양효과Mylabris의 QC를 위한 기반을 제공할 관계입니다. 이 방법은 다른 TCM의 QC 마커를 식별하는 데에도 적용될 수 있습니다.
재료 및 방법
총 20개 배치의 Mylabris phalerata Pallas(MP)와 Mylabris cichorii Linnaeus(MC)가 중국의 여러 지역에서 수집되었으며(표 1) Xiao-Fei Li 교수가 식별했습니다. 바우처 표본은 우리 연구실에 보관되었습니다.
참조 표준 시토신, 우리딘, 구아노신 및 아데노신은 ChengduPush Biotechnology Co., Ltd.(중국 청두)에서 구입했습니다. HPLC 등급 아세토니트릴 및 메탄올은 Thermofisher Scientific(Fairlawn, NJ, USA)에서 구입했습니다. 연구 내내 왓슨의 순수한 물을 사용했습니다. 기타 화학 물질 및 용매는 분석 등급이며 Aladdin Reagent(중국 상하이), Chengdu Kelong Reagent(중국 청두) 및 Sinopharm Chemical Reagent(중국 베이징)에서 입수했습니다.
장치 및 크로마토그래피 조건
HPLC 분석은 지문 채취를 위해 Phenomenex Synergy Polar-RP80(4.6mm x 250mm, 5μm)에서 3{26}}도에서 Agilent 126{21}} Infinity HPLC 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 용리액 A(물/빙초산, 100:1, v/v) 및 B(메탄올)를 사용한 선형 구배 용리를 분리에 사용했습니다. 기울기 프로그램은 다음과 같이 개발되었습니다. 0-1 min, 3.{12}}.6% B; 1-9분, 4.{16}}.8퍼센트 B; 9-25 분, 6.{20}}.0퍼센트 B; 25-30분, 51.{24}}퍼센트 . 이동상의 유속은 1.0 mL/min이었다. 크로마토그램을 254 nm에서 모니터링했습니다. 15분의 평형 기간 후, 10 μL의 샘플을 주입에 사용했습니다.
샘플 준비
건조된 샘플을 분말로 분쇄하고 각 분말 샘플 2.5g을 75% 에탄올 5{14}}mL로 1.5시간 동안 환류하여 2회 추출했습니다. 추출된 샘플을 혼합하고 감압 하에 20mL로 농축하였다. 그 다음 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 80mL의 물로 침전시켰다. 그 후 추출물을 3000g/min으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 분리했습니다. 상청액을 감압 하에 25mL로 농축시켰다. 마지막으로 상층액은 HPLC 분석 전에 0.22μm Millipore 필름을 통해 여과되었습니다.
방법론 검증
HPLC 방법은 정밀도, 재현성 및 안정성({0}} h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h)에 대해 검증되었습니다. 검증은 머무름 시간(RT) 및 피크 면적(PA)을 기반으로 추정되었습니다. 마지막으로 20개 배치의 Mylabris에 대한 화학적 지문을 설정하여 여러 화합물의 통합된 화학적 특성을 식별했습니다. 일부 화학 측정 기술은 분석을 위해 화학적 지문에 도입되었습니다.
패턴 인식 분석
두 종의 피크 영역 간의 차이는 짝지어지지 않은 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적 유의성에 대해 평가되었습니다. 0.05보다 작은 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 고전적인 비지도 방법으로서 주성분 분석(PCA)은 통계 데이터 분석에 널리 적용됩니다. 많은 변수를 사용하는 대신 PCA는 많은 정보를 잃지 않고 적은 수의 PC를 사용하고 점수 플롯을 시각화하여 관찰을 자유롭게 분리합니다. 이 연구에서는 두 종의 Mylabris 간의 구별을 찾기 위해 SIMCA-P plus 14.0 소프트웨어(Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 HPLC 지문의 각 성분의 정규화된 피크 영역에 대해 PCA를 수행했습니다.
두 마일라브리스 종 간의 보다 바람직한 구별을 위해, 감독된 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA) 방법을 적용하여 HPLC 지문에서 각 성분의 정규화된 피크 면적의 차이를 분석했습니다. VIP 값은 모델에 대한 각 X 변수의 상대적 기여도를 반영하는 OPLS 가중치의 제곱합입니다. VIP > 1인 변수는 S-플롯과 함께 OPLS-DA 분석에서 생성된 스코어 플롯에서 샘플 분리에 영향을 미치는 것으로 간주되었습니다. 그 다음, 구별을 위한 특징적인 화학적 마커를 얻었다.
스펙트럼-항암 효과 관계 분석
탐험하기항종양지문 데이터와 통합된 Mylabris 샘플의 피크 면적에 영향을 미치고 두 종 간의 차이점, 지문 피크와안티-종양효과를 연구했다. SPSS19.{1}}(IBM, USA) 및 GM6.{3}} soft(Grey Systems Theory Institution, NUAA, 중국)는 회색 관계 분석과 다변량 선형 회귀 분석(MLRA)을 결합한 두 가지 방법을 적용했습니다. 그만큼안티-종양시험은 우리의 공개된 방법[12]에 의해 수행되었으며, 인간 간세포 암종 세포주 HepG2 세포는 10% 소태아 혈청이 보충된 RPMI1640 배지에서 유지되었습니다. 세포는 37 C에서 5% CO2를 포함하는 가습된 대기에서 성장했습니다. SRB 방법을 사용하여 증식을 평가했습니다.안티-종양활동, 그런 다음 HepG2 세포의 IC50을 계산하고, 마지막으로 IC50 및 정규화된 피크 면적을 화학 분석에 사용했습니다. 그런 다음 Mylabris의 특징적인 활동 마커를 얻었습니다.
결과 및 논의
추출 조건 최적화
Mylabris에서 물-용질 화합물의 충분한 추출을 위해 추출 시스템이 최적화되었습니다. 초음파 및 환류는 이러한 화합물이 환류에 의해 최적으로 추출될 수 있음을 보여주었습니다.
HPLC 방법의 최적화
허브의 전반적인 특징을 설명하는 최대 크로마토그래피 피크를 얻기 위해 크로마토그래피 컬럼의 구성, 이동상 및 검출 파장(200, 254, 265 및 278 nm)을 조사했습니다. 결과는 Phenimenex Synergy Polar-RP80 컬럼, 물(1% 빙초산 함유) 및 메탄올, 254 nm가 Mylabris HPLC 분석에 가장 적합한 조건임을 보여주었으며(그림 1), 4가지 표준 물질의 구조는 그림 2에 나와 있습니다. .
방법 검증
본 연구에서는 14개의 피크를 잘 분리하여 "공통 피크"로 사용하였다. 정밀도, 반복성 및 안정성은 머무름 시간(RT) 및 피크 면적(PA)을 기반으로 했습니다. 정밀도(n=6)에 대한 RT 및 PA의 RSD 값은 각각 0.2 및 4%를 초과하지 않았습니다. 반복성(n=6)에 대한 RA 및 PA의 RSD 값은 각각 0.2 및 4% 미만이었고 안정성(0-24h)에 대한 RSD 값은 { {10}}.4 및 5%, 이는 샘플이 24시간 이내에 안정적임을 나타냅니다. 이러한 결과는 연구된 샘플의 품질과 HPLC 방법이 안정적이고 잘 제어되었음을 보여줍니다.
지문 유사성 평가
The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921, 유사점은 각각 0.888 및 0.887인 MC 샘플(Guizhou2 및 Guizhou4)을 제외하고. 이 데이터는 한 종 내에서 Mylabris의 품질이 안정적임을 나타냅니다. 그러나 참조 HPLC 지문과 비교한 단 3개의 MP 샘플의 유사성은 > 0.930이었습니다. 기준 HPLC 지문과 비교한 2개의 MC 샘플의 유사성은 > 0.921이었습니다. 이러한 결과는 두 종류의 Mylabris가 일부 피크 지역에서 상당한 변동을 보였다는 것을 보여주었습니다.
패턴 인식 분석을 통한 MP, MC 판별
For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, 피크 1, 2, 4, 7, 9, 12, 14가 두 종을 구별하는 가장 중요한 변수일 수 있습니다(그림 6). 피크 그룹(1, 2, 4, 7, 9, 12, 14)은 특징적인 화학적 마커로서 MP와 MC를 구별하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다.
회색 관계 분석에 의한 스펙트럼 효과 관계
To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.
MLRA에 의한 스펙트럼 효과 관계
MLRA 모델은 둘 이상의 변수와 응답 간의 관계 복잡성을 추론하는 가장 일반적인 모델링 방법으로 다음 공식으로 구성됩니다.
여기서 Y는 추정값이며 응답을 나타냅니다. Xn은 독립 변수이고 b{{0}}는 절편이며 bn은 Xn에 대한 회귀 계수입니다. 본 연구에서는 MLRA를 적용하여 HPLC 지문의 피크 면적 값과 항-HepG2의 IC5{50}} 사이의 지문-효능 관계를 설정하고 가능한 항종양 성분을 찾습니다. 데이터의 대조는 Y(IC50)와 X(PA) 간의 상관 관계를 탐색하는 데 적합하지 않은 일반적인 MLRA 모델에 의해 발견되었습니다. PCA MLRA 모델을 사용하여 지문-효과 관계를 연구했으며 누적 분산 기여율이 91.068%인 처음 6대의 PC가 분석을 위해 선택되었습니다. 마지막으로 SPSS 출력과 PC에 따라 다음 방정식이 설정되었습니다. IC50=1.115864 plus (1.87268PA1- 699.722PA2 plus 25.7138PA{18}}.1528PA4 plus 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 더하기 2.95283PA7- 15.5305PA8 더하기 13.0297PA9 더하기 22.5683PA10 - 10.3462PA11 더하기 123.762PA12 더하기 31.0428PA.7{44} (R은 0.682, P <>
두 Mylabris 종의 통합 분석
이 실험은 HPLC 핑거프린팅이 Mylabris의 화학적 특성을 반영하는 데 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 유사성 알고리즘, PCA 및 OPLS-DA를 적용하여 MC와 MP의 차이점을 찾았습니다. 피크 그룹(1, 2, 4, 7, 9, 12 및 14)은 특징적인 화학적 마커로 정의되었습니다.
또한 GRA와 MLRA 모두 추가 판별에 만족스러운 방법임이 입증되었습니다. GRA 및 MLRA 분석 결과를 통합하면 Mylabris의 활성 마커인 피크 2, 4 및 14는 Mylabris의 약력학적 재료 기반이 될 수 있는 항종양 효과를 담당해야 합니다.
특징적인 화학적 및 활성 마커 특성을 갖는 피크에 대해 중요한 차등 마커가 정의되었습니다. 따라서 스펙트럼 효과 관계 분석 후 HPLC 지문의 MC와 MP 사이에서 피크 2(사이토신), 4(알 수 없음) 및 14(알 수 없음)는 그림 7과 같이 MP와 MC의 차이에 대한 중요한 차등 마커였습니다.
결론
결론적으로 본 연구에서는 MP와 MC의 화학적 핑거프린팅을 위한 HPLC 방법을 제안하였다. HPLC 핑거프린팅, PCA, 스펙트럼 효과 관계 분석(예: GAS 및 MLRA)을 결합하여 두 가까운 종의 Mylabris의 화학적 및 약리학적 특성을 식별할 수 있습니다. 이는 중요한 감별 표지자인 피크 2(사이토신), 4(알 수 없음) 및 14(알 수 없음)의 화합물이 MP와 MC를 구별하는 데 지배적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 피크 4와 14의 구조는 다른 기술로 식별해야 합니다. 통계, 화학분석 및 스펙트럼-효과 관계 분석과 결합된 HPLC 핑거프린팅 방법은 마커 성분의 발견 또는 QC 촉진에 효과적인 것으로 입증되었습니다.약초.
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