인간의 신장 및 요로에서의 인간 알파 방어소 5 발현
Mar 16, 2022
자세한 정보: ali.ma@wecistanche.com
존 데이비드 스펜서 외
추상적인
배경:요로에서 불임을 유지하는 메커니즘은 불완전하게 이해됩니다. 최근 연구는 감염으로부터 요로를 보호하는 데 항균 펩티드(AMP)의 중요성을 시사했습니다. 여기에서 우리는 인간에서 AMP 인간 알파-방어신 5(HD5)의 표현과 관련성을 특성화합니다.신장및 정상 및 감염된 대상체에서의 요로.
방법론/주요 결과:인간에게서 분리한 RNA를 이용하여신장, 요관 및 방광 조직에 대해 정량적 실시간 PCR을 수행하여 HD5를 인코딩하는 유전자인 DEFA5가 요로 전체에서 구성적으로 발현된다는 것을 보여주었습니다. 신우신염으로 DEFA5 발현이 유의하게 증가했습니다.신장. 면역블롯 분석을 사용하여 HD5생산도 신우신염과 함께 증가했습니다. 방광 및 요관의 요로상피에 국소화된 HD5를 면역염색. 신장에서 HD5는 주로 원위 네프론과 집합세관에서 생성되었습니다. 면역블롯 및 ELISA 분석을 사용하여 HD5는 감염되지 않은 인간 소변 샘플에서 일상적으로 검출되지 않았지만, 이는 E.coli 요로 감염으로 소변 HD5 생성이 증가했음을 의미합니다.
결론/의의:DEFA5는 감염되지 않은 대상에서 요로 전체에 걸쳐 발현됩니다. 구체적으로, HD5는 하부요로의 요로피 전체와 소장의 집합세관에서 발현됩니다.신장. 감염으로 HD5 발현이 증가합니다.신장, 수준이 소변에서 감지될 수 있습니다. 우리가 아는 한, 우리의 발견은 인간 신장에서 HD5 발현과 생산을 최초로 정량화한 것입니다. 또한, 이것은 감염된 소변 샘플에서 HD5의 존재를 감지한 첫 번째 보고서입니다. 우리의 결과는 HD5가 요로 불임을 유지하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
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소개
요도는 요도를 제외하고는 분변 세균총과 인접해 있음에도 불구하고 일반적으로 무균 상태입니다. 요로가 불임을 유지하는 정확한 기전은 잘 알려져 있지 않습니다. 요로 방어에 기여하는 제안된 메커니즘에는 소변 흐름, 소변 pH 및 삼투압의 변화, 규칙적인 방광 비우기, 요상피의 화학적 방어 성분, 박테리아 자극에 의한 효과기 면역 세포의 상피 배출/유입이 포함됩니다[1]. 또한, 항균 펩타이드(AMP)는 최근 요로의 불임을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다[2]. 거의 모든 유기체에 의해 생성되는 천연 항생제 역할을 하는 AMP는 선천 면역계의 도처에 있는 구성요소입니다. AMP는 식세포 백혈구와 상피 세포에서 발현되는 양이온 분자입니다. 인간과 다른 포유류에서 방어소는 AMP의 주요 계열입니다. Defensin은 일반적으로 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물에 대해 광범위한 항균 활성을 가지고 있습니다[2,3]. Defensin은 초기에 preproprotein으로 합성되고 처리를 거쳐 성숙한 생물학적 활성 펩타이드가 됩니다[4]. 인간에서 방어소는 이황화 가교 패턴에 따라 알파 방어소 또는 베타 방어소의 두 가지 계열 중 하나로 분류됩니다[5].
요로에서 베타 방어소는 요상피 전체에 걸쳐 널리 발현됩니다. 내벽을 이루는 상피세포신장헨레 루프, 원위 세뇨관 및 집합관은 구성적으로 인간 베타 방어 1(hBD1)을 발현합니다. hBD1의 소변 수준은 침입하는 박테리아를 죽이기에는 충분하지 않지만 hBD1은 관 내강에 빠르게 작용하는 항균 코팅을 제공하고 요로상피에 대한 박테리아 부착을 억제하여 감염을 예방합니다[6]. 최근 연구에 따르면 hBD1의 산화환원 상태는 항균력에 상당한 영향을 미치므로 환원된 펩타이드가 이황화 결합 산화형보다 훨씬 더 강력합니다[7]. 요로상피 표면에서 이것의 중요성은 결정되지 않았습니다. 또 다른 방어소인 인간 베타 방어소 2(hBD2)는 건강한 신장 조직에서 구성적으로 발현되지 않습니다. 그러나 hBD2 발현은 감염에 의해 유도된다[8].
베타 방어소와 달리 상피 유래 알파 방어소의 역할은 요로에서 잘 설명되어 있지 않습니다. alpha-defensin HD5와 HD6의 발현과 기능은 Panethcells에 의해 장내로 분비되고 장내 미생물 균형에 기여하는 소장에서 주로 보고되었습니다[9]. HD5는 또한 남성과 여성의 생식기에 국한되어 있으며 감염을 근절하는 데 유도 가능하고 중요하다는 증거가 있습니다[10,11,12]. 요실금 HD5는 회장 신방광 재건 및 회장 도관 요로 전환을 받은 환자에서 검출되었으며, 이에 따라 HD5 생산의 출처는 주로 회장 Paneth 세포로 간주됩니다[13,14]. HD5는 일반적인 요로병원성 그람 양성균과 그람 음성균에 대해 항균 활성을 가지고 있습니다[15]. HD5는 또한 아데노바이러스 및 BK 바이러스와 같은 요로병원성 바이러스에 대한 항균 활성을 가지고 있습니다[16,17,18]. 이 연구에서 우리는 인간에서 HD5 발현의 초기 설명과 정량화를 제공합니다.신장불임 및 감염 중 하부 요로에서의 발현을 추가로 정의합니다.
결과
DEFA5 mRNA는 인간의 방광, 요관 및 신장에서 구성적으로 발현됩니다.
정량적 실시간 PCR은 검사한 모든 방광, 요관 및신장감염이 없는 표본은 구성적으로 DEFA5를 발현했습니다. DEFA5 발현은 상부 요로보다 하부 요로에서 유의하게 높았다(p{2}}.014). 방광(n=4)에서 평균 DEFA5 발현은 10ng RNA당 4,656637 전사체였으며 요관(n=4)에서 평균 DEFA5 발현은 10ngRNA당 4,1126170 전사체였습니다(그림 1A) . 신장(n=6)에서 평균 DEFA5 발현은 10ng RNA당 2,9376274 전사체였습니다. DEFA5 발현은 신피질, 수질, 골반에서 별도로 분석하였다. DEFA5 발현은 신장 부위에 따라 유의한 차이가 없었다(p{22}}.45).
DEFA5 발현 및 HD5 펩타이드 발현은 신우신염과 함께 증가
정량적 실시간 PCR 분석 수행신장 조직신우신염은 감염되지 않은 신장 조직과 비교하여 DEFA5 발현의 유의한 증가를 보여주었습니다. 신우신염이 있는 경우(n= 6), 평균 DEFA5 발현이 10ng RNA당 전사체 7,82961,052개로 증가했습니다(p= 0.019)(그림 2A).
신우 신염으로 인한 이러한 발현 증가를 추가로 평가하기 위해 동일한 대상에 대한 면역 블롯 분석을 수행했습니다.신장HD5 펩티드 생산의 동시 증가를 평가하기 위해 실시간 PCR 분석에 사용된 조직(그림 2B, 중간 패널). 다클론 HD5 항혈청을 사용한 면역블롯 분석은 신우신염이 있는 신장 조직에서 훨씬 더 큰 HD5 펩티드 생산을 보여주었습니다(n {{5} }) 감염되지 않은 것과 비교신장조직(n=6). 감염되지 않은신장조직은 300625 ng HD5/g 젖은 조직 중량을 나타내었지만신장6{2}}0621ng HD5/g 젖은 조직 무게(p,0.0001)를 발현하는 신우신염이 있는 조직. 블롯은 로딩 제어 역할을 하기 위해 GAPDH로 다시 조사되었으며(그림 2B,중간 패널) 은색 염색도 동일한 단백질 로딩을 확인하기 위해 수행되었습니다(그림 2B, 상단 패널).
HD5 펩타이드는 인간의 신장과 요로 전체에서 생성됩니다.
요로에서 HD5 생산을 국소화하기 위해 면역염색을 수행했습니다. 면역조직화학(IHC)은 조사된 모든 표본의 요관 및 방광의 요로피 전체에 HD5 면역반응이 존재함을 보여주었습니다(n=4, 그림 3). IHC는 또한 HD5가 모든 신피질의 세관과 수질에서 생성됨을 보여주었습니다 표본(n= 6, 그림 4). 면역형광(IF)은 HD5 발현이 원위 네프론과 수집 세관에서 가장 크다는 것을 보여주었습니다(그림 5). 간질과 사구체는 HD5 면역반응을 나타내지 않았다. 도 3, 4 및 5에 나타낸 면역염색은 HD5 프로펩티드(Abcam, Cambridge, MA)를 인식하는 마우스 단일클론 항-HD5 항체(8C8)를 사용하여 수행되었습니다. 결과는 HD5 프로펩티드와 성숙한 펩티드를 인식하는 토끼 다클론 항-HD5 항체를 사용할 때 유사했습니다(데이터는 표시되지 않음). 이는 HD5가 프로펩티드로 저장됨을 시사합니다.
신우신염의 경우 HD5 면역염색이 현저하게 증가했습니다. HD5 면역반응은 근위 네프론, 원위 네프론 및 집합 세관 전체에서 증가했습니다(그림 4 및 그림 5). 감염되지 않은 검체에서와 같이 사구체와 간질은 감염에 따른 HD5 발현을 보이지 않았다. 음성 대조군은 HD5 면역반응성을 나타내지 않았습니다.
감염된 사람의 소변에는 측정 가능한 농도의 HD5 펩타이드가 포함되어 있습니다.
전구체 proHD5 및 추가 처리된 형태를 검출하는 토끼 다클론 항혈청을 사용한 면역블롯 분석은 요로병원성 대장균에 감염된 15개의 테스트된 소변 샘플 중 13개에서 HD5의 측정 가능한 수준을 확인했습니다(그림 6A 및 B). 존재하는 경우, 소변 크레아티닌으로 정규화된 HD5 수준은 299.8–669.7630ng HD5/mg 소변 Cr(110.67ng/mL–276.67ng/mL) 범위이며, 이는 11.10–27.67nmol/L에 해당합니다. 감염되지 않은 소변 샘플(n=15), HD5는 검출 한계(,50ng) 이하였습니다. proHD5 전구체만을 검출하는 마우스 단클론항체(8C8)를 사용하여 동일한 소변 샘플에 대한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)은 테스트한 15개의 감염된 샘플 중 13개에서 측정 가능한 수준의 proHD5를 검출했습니다. 소변 proHD5 농도는 존재하는 경우 122.78–490.060.03ng HD5/mg 소변 Cr(30.02ng/mL–200.5ng/mL) 범위였습니다(그림 7).
논의
이 연구에서 우리는 인간에서 HD5의 초기 특성화를 제공합니다.신장, 요관 및 방광. HD5는 장의 침습적 감염을 예방하고 감염 동안 생식기에서 상향 조절되는 중요한 AMP인 것으로 나타났습니다[11,18,19,20,21]. HD5와 같은 상피 유래 AMP는 요로에서 불임을 유지하는 데 중요한 것으로 나타났습니다[8,22,23,24]. 이러한 선천적 점막 방어의 결핍은 급성 및/또는 만성 감염을 유발할 수 있습니다[25,26].
우리의 정량적 실시간 PCR 결과는 DEFA5가 인간에서 구성적으로 발현된다는 것을 보여줍니다.신장, 요관 및 방광. DEFA5 발현은 상부 요로에서 하부 요로로 증가합니다. 이는 요로의 흐름과 미생물총의 침입 지점이 가까워짐에 따라 증가합니다. 우리가 아는 한, 이것은 인간의 신장과 방광에서 DEFA5 발현을 정량화한 첫 번째 연구입니다. 최근 Townes 등은 정상 원위 요관이 DEFA5를 발현할 수 있음을 입증했습니다[14]. 우리의 결과는 또한 DEFA5가 원위 요관에 의해 구성적으로 표현된다는 것을 시사합니다. 요로에서의 DEFA5 발현은 위장 조직에서 발견되는 것보다 거의 100-배 낮지만, DEFA5의 기저 요상피 발현은 카텔리시딘, hBD-1, hBD와 같은 이전에 설명된 요로 암의 발현과 유사합니다. -2 및 리보뉴클레아제 7[6,8,22,24,27].
DEFA5가 건강 상태와 감염/염증 상태 모두에서 높은 수준으로 발현되는 성숙한 위장관과 대조적으로, 당사의 정량적 실시간 PCR 데이터는 DEFA5 발현이신장감염에 의해 유의하게 상향 조절된다[27,28,29]. 이러한 유도 가능한 발현 패턴은 여성 생식기에서 DEFA5 발현이 난관염과 함께 증가하는 DEFA5 발현과 유사합니다[30]. 요로에서 Townes 등은 회장 도관 요로 전환을 겪은 UTI 환자에서 DEFA5의 더 큰 요관 발현 경향을 보여주었습니다[14]
우리의 면역블롯 분석은 HD5 펩타이드 생산이 신우신염과 함께 증가한다는 것을 보여줌으로써 실시간 PCR 데이터를 보완합니다. HD5 생산의 이러한 유도성 패턴은 베타-디펜신 계열의 일부 구성원에서 볼 수 있는 것과 유사합니다. hBD2는 요로 감염 및/또는 만성 신우신염과 함께 유도 가능한 생산 패턴을 보여줍니다[8,31,32]. HD5펩티드 생산은 염증이 있는 상부 여성 생식기 및 남성 요도에서 증가하는 것으로 나타났습니다[11,30].
면역 염색을 사용하여 HD5가 요관과 방광의 요로상피 전체에 걸쳐 균일하게 생성됨을 보여줍니다. 대부분의 UTI는 방광으로 올라가는 분변 세균총에서 발생하기 때문에 이러한 결과는 HD5 발현이 미생물 노출이 가장 자주 발생하는 위치에 존재함을 시사합니다[33]. 따라서 HD5는 상승하는 미생물 감염을 예방하는 데 이상적입니다. 에서신장, HD5는 주로 원위 네프론과 집합세관에서 생성됩니다. 이러한 발견은 HD5가 최적의 항균 활성을 가질 수 있는 위치에서 생산됨을 시사합니다. 이전 연구에 따르면 defensin의 항균 특성은 염 농도에 의존하며 염 농도가 높을수록 항균 활성이 감소합니다[23,34,35]. 우리는 원위 네프론과 집합 세관의 낮은 염 농도가 HD5 항균 활성에 유리한 환경을 제공한다고 추측합니다.
Immunoblot 및 ELISA 분석도 HD5가 낮은 수준으로 소변으로 분비된다는 것을 보여줍니다. proHD5 및 완전히 처리된 HD5의 크기(8.1kDa 및 3.7kDa)와 양전하를 감안할 때 일부 요 HD5 펩타이드는 적어도 부분적으로 혈장 여과액에서 유래할 수 있습니다. 그러나 HD5가 혈장에서 지속된다는 증거는 거의 없습니다[27]. 또한, HD5가 소변에 나타나려면 근위 세뇨관에서 효율적인 펩타이드 흡수 메커니즘을 벗어나야 합니다[6,36]. 마지막으로, 사용된 소변 샘플은 분석이 수행되기 전에 원심분리를 거쳐 HD5의 세포 소스를 제거했습니다.
완전히 처리된 HD5는 일반적인 그람음성 요로병원성 세균에 대해 6-10 mg/mL 사이의 최소 억제 농도(MIC)를 가지므로 검출된 농도에서 요중 HD5는 요로병원성 미생물에 대해 직접적인 항균성을 나타내지 않을 것입니다[15]. 그러나 점막 표면 농도는 더 높을 가능성이 있습니다. 또한, 면역블롯 분석은 HD5 농도가신장. 이러한 결과는 HD5가 요로의 점막 방어에 관여함을 시사합니다. 유사한 패턴이 hBD1에서도 볼 수 있는데, 여기서 hBD1의 소변 농도는 항균 활성을 나타내기에 불충분하지만 신세뇨관 근처에서 더 높은 펩타이드 농도가 검출됩니다[6,31].
IHC는 proHD5가 HD5의 주요 형태임을 보여주기 때문에신장성숙한 형태와 proHD5가 모두 소변에서 검출되기 때문에 HD5는 주로 전구체 분자로 분비된 다음 단백질 분해 처리를 거쳐 위장관 및 비뇨생식기 관과 유사한 성숙한 형태를 생성한다고 추측합니다[11,30,37]. 소장에서 Paneth 세포는 트립신을 생산하여 HD5 프로펩티드를 절단하여 완전히 처리된 펩티드가 장 내강에서 우세한 형태가 되도록 합니다[37]. 남성 요도에서 HD5의 주요 처리 및 활성화 효소는 감염 부위로 모집된 호중구에 의해 기여되는 호중구 프로테아제입니다[11]. 감염 동안 요로에서 HD5 처리에 대한 상피 트립시노겐, 요로 트립신 및/또는 호중구 프로테아제의 기여는 결정되어야 합니다. 또한 HD5 기능(삼투압 농도, pH 및 양이온 농도의 변화)에 대한 비뇨기 환경 변화의 영향도 결정해야 합니다.
결론적으로 이것은 요로에서 HD5의 발현과 생성을 확인하고 정량화한 최초의 연구이다. 우리의 결과는 HD5가 침입하는 병원균이 순환계로 이동하는 것을 방지하는 인간 요로상피의 타고난 면역에서 중요한 역할을 할 수 있는 상피 유래 AMP임을 시사합니다. HD5생산을 조절하는 요인에 대한 설명은 요로감염의 위험이 있는 환자와 만성 감염 환자에서 요로감염의 발병기전에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
행동 양식
연구 승인
이 연구에 참여한 모든 환자로부터 사전 서면 동의를 받았습니다. 18세 미만의 피험자의 경우 서면 부모/보호자의 동의를 얻었습니다. NCH(NationwideChildren's Hospital) 기관 검토 위원회는 동의 절차 및 문서(IRB07-00383)와 함께 이 연구를 승인했습니다.
인간 조직 및 소변 샘플
감염되지 않은 원위 요관 및 방광 조직(n= 4)은 재발성 감염 이외의 이유로 요관 재이식을 받은 어린이에게서 얻었습니다. 감염되지 않은신장샘플(n=6)은 신장 종양으로 신장 절제술을 받은 환자로부터 얻었습니다. 조직 샘플에는 질병이나 염증의 거시적 징후가 없었습니다.신장만성 신우신염 환자의 조직은 Cooperative HumanTissue Network(n=6)에서 제공했습니다[38]. 두 명의 독립적인 병리학자가 신우신염의 조직병리학적 진단을 확인했습니다. 조직 샘플을 급속 동결하거나 중성 포르말린 고정 파라핀 포매 섹션으로 보존했습니다. 감염되지 않은 신장 조직의 절편을 피질, 수질 또는 신우로 절개하여 보관했습니다(n=4).
감염되지 않고 감염된 소변 샘플은 NCH 응급실이나 신장내과 진료소에 내원하는 어린이들로부터 얻었습니다. UTI의 진단은 American Academy of PediatricsGuidelines[39]에 따라 요배양 양성으로 내려졌다. 감염된 모든 소변 샘플에는 0.106 CFU/mL의 대장균이 있었습니다. 소변의 pH 값은 5.5에서 8.5 사이였습니다(평균 소변 6.9). 소변 이온 조성은 측정되지 않았습니다. 소변 샘플을 원심분리하여 소변 침전물을 제거하고 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가했습니다(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
리보핵산 분리 및 역전사
PromegaTotal RNA Isolation System(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 냉동 조직에서 Total RNA를 분리했습니다. ForcDNA 합성, 공급자의 프로토콜(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 따라 올리고-(dT)12-18프라이머를 사용하여 Superscript III 역전사효소를 사용하여 4-8mg의 총 RNA를 역전사했습니다.
표준 곡선에 대한 유전자 특이적 플라스미드의 클로닝
DEFA5 및 GAPDH를 인코딩하는 cDNA를 제조업체 지침에 따라 4-Topo 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 클로닝했습니다. 플라스미드의 염기서열이 정확한지 확인하기 위해
구축물을 얻었다. 유전자 특이적 플라스미드의 연속 희석액을 정량화하고(260도에서의 분광광도계 흡광도 및 에티듐 브로마이드 염색 아가로스 겔 전기영동에 의해) 실시간 PCR에 사용하여 각 반응에 대한 표준 곡선을 생성했습니다.
정량적 실시간 PCR
인간의 단일 가닥 cDNA를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행했습니다.신장7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍이 있는 요관 및 방광 조직. DNAstarH Laser Gene SeqBuilder(DEFA5 forward primer)를 사용하여 PCR 엑손 접합 스패닝 프라이머를 설계하고 서열을 확인했습니다. : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 및 DEFA5 역방향 프라이머 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
간단히 말해서, 10ng RNA에 해당하는 cDNA는 2.{21}}mM의 각 프라이머와16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green 혼합물을 포함하는 25ml 반응에서 주형으로 사용되었습니다. PCR 조건은 95℃에서 10분 동안 초기 변성 후 94℃에서 30초간 변성, 64℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30초 연장으로 구성된 각 사이클의 40주기였습니다. 주기 간 형광 방출을 530 nm에서 모니터링하고 7500Software V2.0.3(Applied Biosystems)을 사용하여 분석했습니다. 유전자 특이적 플라스미드 표준은 모든 반응 세트에 포함되었습니다. 양성 대조군으로서 말단 회장 RNA가 각 반응 세트에 포함되었고 결과는 이전에 발표된 표준과 비교되었습니다[27].
목적 생성물의 PCR 증폭을 확인하기 위해 대표 샘플을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분석하였다. 생성물을 에티듐 브로마이드염색으로 시각화하고 DNA 크기 표준과 비교하여 확인된 생성물 크기(표시되지 않음)를 확인했습니다. 또한, 모든 PCR 반응의 용융 온도 프로파일 곡선은 각 반응이 끝날 때 결정되었습니다.
HD5 항체
HD5 프로펩티드(AA20-94) 및 부분적으로 처리된 형태(AA36-94 및 56–94)는 시판되는 마우스 모노클로날(8C8) 항-HD5 항체(Abcam)를 사용하여 확인되었습니다. HD5 프로펩티드 및 성숙한 펩타이드(AA{10}})는 이전에 설명한 토끼 다클론 항혈청을 사용하여 확인되었습니다[13,40].
면역블롯
동일한 섹션신장정량적 실시간 PCR 분석에 사용된 표본(3-6 mg 습중량)을 액체 질소에서 막자사발과 막자를 사용하여 분쇄하고 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 완충액에 용해시켰다. ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit(Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canada)를 사용하여 소변 샘플에서 소변 단백질을 추출했습니다. 수정된 Bradford Assay를 사용하여 신장 및 소변 단백질 농도를 정량화하고 anOD280 nm 판독값을 사용하여 확인했습니다. 동일한 농도의 신장 조직 또는 소변 단백질을 18% 나트륨 도데실 설페이트 구배 젤에 로딩하고 전기영동을 실시했습니다. 동일한 단백질 로딩을 보장하기 위해 은색 염색을 수행했습니다.
전기영동 분리 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. TBS 중 0.05% 글루타르알데히드로 고정한 후 막을 5% 무지방 우유에서 30~60분 동안 차단하고{8}} 토끼 다클론성 HD5 항혈청의 1:1 희석액에서 밤새 배양했습니다. . 세척 후, 1:10으로 희석된 항토끼양고추냉이 퍼옥시다제 결합 항토끼 IgG(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)인 이차 항체를 실온에서 1시간 동안 적용했습니다. 면역 블롯신장조직을 또한 실온에서 2시간 동안 항-GAPDH 항체(Sigma Aldrich)로 탐침한 다음, 상기 기재된 2차 항체와 인큐베이션하였다. 단백질은 제조사의 지침(BioExpress, Kaysville, UT, USA)에 따라 ECL 검출 시스템 및 화학발광 필름을 사용하여 시각화되었습니다.
HD5는 생성된 밴드 강도를 재조합 표준 proHD5 단백질(Peptides International, Louisville, KY, USA)의 연속 희석액과 비교하여 정량화되었습니다.신장HD5 농도는 습윤 조직 중량으로 표준화되었습니다. UrinaryHD 5 농도를 소변 크레아티닌으로 나누어 소변 희석을 설명하기 위해 표준화된 소변 HD{2}}대 크레아티닌 비율(mg/mg)을 설정했습니다. 소변 크레아티닌 농도는 Oxford Biomedical Research creatinine microplate assay(Rochester Hills, Michigan, USA)를 사용하여 결정되었습니다.
면역조직화학
탈파라핀화, 재수화 및 항원 회수 후 비오틴 차단 및 무혈청 단백질 차단을 수행하였다(Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). 슬라이드를 단클론 마우스 HD5(8C8) 항체(1:2{{1{12}}}0; Abcam) 또는 토끼 다클론 항혈청(1:500)과 함께 4uC에서 밤새 배양한 다음 항 다가 비오틴화 항체를 혼입했습니다. 스트렙타비딘/HRP(ScyTek 연구소). 절편은 0.1% diaminobenzidine tetrachloride와 0.02% 과산화수소를 사용하여 전개하고 hematoxylin으로 대조염색했습니다. 음성 대조군 섹션을 HD5 항체 대신 비면역 혈청과 함께 인큐베이션했습니다.
면역형광
이중 표지된 면역형광은 HD5 발현을 국소화하는 것을 돕기 위해 수행되었습니다.신장. 집합관은 염소 폴리클로날 항-인간 아쿠아포린{2}} 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 주 세포에 대해 이중 표지되었습니다[41]. Henle의 루프는 mousepolyclonal anti-human uromodulin 항체(Sigma-Aldrich)로 이중 표지되었고 근위 세뇨관은 염소 polyclonalantihuman aquaporin-1(Santa Cruz)으로 이중 표지되었습니다[41,42]. 로다민 당나귀 다클론 항염소(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), 로다민 염소 항마우스(JacksonImmunoResearch Laboratories) 및 FITC 당나귀 다클론 항토끼(Santa Cruz)가 2차 항체로 사용되었습니다.
모든 섹션은 위에서 설명한 대로 준비되었습니다. 이들은 HD5(1:200)(Abcam), AQP{3}}(1:500), uromodulin(1:500), AQP-1(1:400)에 대한 마우스 항혈청 혼합물과 함께 atroom에서 배양되었습니다. 90분 동안 온도를 유지합니다. 2차 항체를 실온에서 90분 동안 적용하고 DAPI가 있는 장착 배지를 사용하여 섹션을 장착했습니다. 비면역 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 슬라이드는 aLeica DM4000B 현미경으로 검사하고 Spot RT 카메라/소프트웨어(Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA)를 사용하여 디지털 사진으로 촬영했습니다.
엘리사
Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) 마우스 단일클론항체를 실온에서 2시간 동안, streptavidin-horse radish peroxidase(Biolegend, San Diego CA, USA)를 30분 동안 첨가하였다. TMB 기질 용액(Kem-En-Tec Diagnostics)과 15분간 인큐베이션한 후, STOP 용액(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)으로 반응을 종료하고 450 nm의 파장에서 판독했습니다. ELISA 분석의 HD5 농도를 소변 크레아티닌으로 나누어 위에서 설명한 대로 소변 희석을 설명하기 위해 표준화된 소변 HD{8}}대 크레아티닌 비율(mg/mg)을 설정했습니다.
참고문헌
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