고혈당증은 대식세포와 그 전구체에서 훈련된 면역을 유도하고 죽상경화증을 촉진합니다

배경:

당뇨병의 심혈관 위험은 포도당 저하 요법에도 불구하고 여전히 높게 유지됩니다. 우리는 고혈당증이 대식세포에서 훈련된 면역을 유도하여 지속적인 proatherogenic 특성을 촉진한다는 가설을 세웠습니다.

또한 각종 문헌에서 Cistanche라는 식물이 면역력 향상에 큰 효과가 있다는 사실도 알게 되었습니다. Cistanche는 광범위한 면역 조절 기능을 가진 한약입니다. 인자의 방출, 면역기관의 기능개선 등 인체의 면역력을 높이는 방법. 따라서 일상생활에서 Cistanche Deserticola를 적당히 섭취함으로써 면역력을 향상시켜 각종 질병을 예방하고 치료할 수 있습니다.

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행동 양식:

대조군 마우스 및 당뇨병이 있는 마우스의 골수 유래 대식세포를 생리학적 포도당(5mmol/L)에서 성장시키고 RNA 시퀀싱(n=6), 트랜스포사제 액세스 가능 염색질 ​​시퀀싱(n=6 ) 및 염색질 면역침전 시퀀싱(n=6)을 통해 고혈당증 유발 훈련 면역을 결정합니다. (n=9) 또는 (n=6) 당뇨병이 없는(n=6) 마우스에서 (정상혈당) Ldlr -/- 마우스로 골수 이식을 사용하여 생체 내 기능적 중요성을 평가했습니다. 통제 대상(n=16)과 비교하여 당뇨병 환자(n=8)의 인간 말초 혈액 단핵 세포와 레이저 포획 미세해부에 의해 절제된 인간 죽상경화반 대식세포에서 고혈당증 유발 훈련 면역의 증거를 찾았습니다. .

결과:

대식세포에서 높은 세포외 포도당은 해당작용에 의존하는 메커니즘을 통해 전염증성 유전자 발현과 전동맥경화성 기능적 특성을 촉진했습니다. 당뇨병 쥐의 골수 유래 대식세포는 생리학적 포도당에서 배양한 경우에도 이러한 특성을 유지했으며, 이는 고혈당증으로 유도된 훈련된 면역성을 나타냅니다. 당뇨병 마우스에서 (정상혈당) Ldlr -/- 마우스로의 골수 이식은 대동맥 뿌리 죽상동맥경화증을 증가시켰고, 훈련된 선천성 면역의 질병 관련 및 지속적인 형태를 확인했습니다. 트랜스포사제 접근 가능한 염색질, 염색질 면역침전, 조혈 줄기 세포 및 골수 유래 대식세포의 RNA 시퀀싱 분석을 위한 통합 분석에서 당뇨병에서 전염증성 프라이밍 효과가 밝혀졌습니다. 열린 염색질의 패턴은 전사 인자 Runt 관련 전사 인자 1(Runx1)과 관련이 있습니다. 유사하게, 제2형 당뇨병 환자의 죽상경화반 대식세포 및 말초 백혈구의 전사체는 인간 질병에서 잠재적인 역할과 일치하는 Runx1 표적에 대해 농축되었습니다. 체외에서 Runx1의 약리학적 억제는 훈련된 표현형을 억제했습니다.

결론:

고혈당증으로 유도된 훈련된 면역은 상승된 포도당을 표적으로 삼는 것이 당뇨병의 대혈관 위험을 줄이는 데 비효과적인 이유를 설명하고 질병 예방 및 치료를 위한 새로운 목표를 제안합니다.

키워드:

당뇨병 ◼ 후생유전학 ◼ 포도당 ◼ 염증 ◼ 대식세포

당뇨병은 죽상동맥경화증 및 심근경색을 포함한 그 합병증의 위험이 높습니다.1 고혈당증은 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두의 주요 특징이며 치료는 주로 혈당을 낮추는 데 중점을 두었습니다. 집중적인 포도당 저하 요법은 제1형 당뇨병 환자의 혈관 위험을 낮추는 데 효과적이지만 그 효과는 몇 년 동안 지연되고2 일시적으로 혈당 조절과 단절됩니다.3 제2형 당뇨병에서 포도당 감소는 효과가 없거나 급성 심근경색증과 같은 죽상동맥경화증 관련 혈관 결과에 약간의 영향을 미칩니다.4-6 혈당을 낮춘 후에도 심혈관 합병증의 지속적인 위험은 레거시 효과 또는 대사 기억4,7이라고 불렸지만 근본적인 메커니즘은 여전히 ​​모호합니다.

죽상동맥경화증은 변형된 지단백질의 침착 및 유지와 큰 동맥 벽에 면역 세포의 축적을 특징으로 하는 만성 염증성 질환입니다. 대식세포는 죽상동맥경화증의 모든 단계에서 핵심이며 치료 표적으로 널리 간주됩니다.8 그들은 이질적이며 기능적으로 미세 환경 단서에 반응합니다. 대식세포는 Toll-like receptor ligand lipopolysaccharide(LPS) 및 인터페론(IFN)에 대한 반응으로 프로염증성(proinflammatory)(M1), 예를 들어 인터루킨(IL )-4, 생체 내 기능 범위는 의심할 여지 없이 더 복잡합니다.9

고혈당증은 죽상동맥경화증 진행을 악화시키고 플라크 퇴행을 지연시키며,10 전염증성 유전자의 발현 증가와 M2- 관련 유전자 발현 유도에 대한 저항성을 동반합니다.10,11 단핵구와 대식세포에서 세포의 에너지 경로는 세포- 면역 관련 기능과 유전자 발현에 현저한 영향을 미칩니다.12 IL-4에 ​​대한 반응으로 M2 대식세포는 주로 지방산을 대사하고 산화적 인산화에 의존합니다.13 반대로 M1 대식세포는 포도당과 암의 Warburg 효과와 유사한 호기성 당분해로의 전환이 필요합니다.14,15 이러한 대사 변화는 사이토카인 자극의 결과로 발생하지만 대식세포 기능을 결정할 수도 있습니다.16 또한 최근 보고서에 따르면 단핵구와 대식세포 대사의 변화는 호기성 당분해 또는 메발로네이트 경로의 활성화를 포함하여,17,18 후생유전학적 변형 및 염색질 구조 변경을 통해 장기 선천 면역 세포 기억(훈련된 면역이라고 함)을 유도합니다.19 순환하는 훈련된 단핵구의 장기간 지속성은 재프로그래밍에 의해 구동됩니다. 그들의 골수(BM) 전구체.20

우리는 상승된 포도당에 대한 반응으로 훈련된 면역이 동맥경화증에 대한 당뇨병성 고혈당 기억을 설명한다고 가정했습니다. 따라서 우리는 단핵구 및 대식세포 기능에서 고혈당증 유발 질병 관련 변화와 이러한 변화가 정상 포도당 회복 후에도 지속되는지 여부를 결정하여 근본적인 재 프로그래밍을 의미합니다. 우리는 세포 기능, 대사체학, 전사체학 및 후성유전학에 대한 연구를 결합하여 고혈당증이 후생유전학적 변형을 통해 장기 활성화를 조절하기 위해 신진대사를 변경하는 방법을 정의했습니다. 우리는 이러한 변화가 조혈 줄기 세포(HSC) 수준과 분화된 대식세포에서 어떻게 발생할 수 있는지 조사했습니다. 죽상동맥경화증의 마우스 모델에서 BM 이식을 통해 기능적 중요성을 테스트하고, 결과는 레이저 포획 현미해부(LCM)에 의한 인간 말초혈액 및 죽상경화반에서 추출한 대식세포를 심문하여 검증합니다. 우리의 연구 결과는 기존의 포도당 저하 치료에 대한 당뇨병의 대혈관 합병증의 저항성을 설명할 수 있습니다.

행동 양식

데이터 리소스

이 연구에서 생성된 데이터는 National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus에 기탁되었으며 수탁 번호 GSE176068을 통해 액세스할 수 있습니다.

동물

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >13.9mmol/L를 안락사시키고 조직을 수집하였다.

세포주

모든 세포주는 37도 및 5% CO2에서 성장했습니다. L929 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS), 2% 페니실린-스트렙토마이신 및 2mmol/L 글루타민이 보충된 Roswell Park Memorial Institute 배지에서 성장했습니다. L929 세포를 7~8일 동안 완전 합류까지 성장시켰고, 조절 배지를 제거하고, 분취량으로 나누고, 필요할 때까지 -20도에서 보관했습니다. 피부 유래 마우스 내피 세포를 10% FBS, 2% 페니실린-스트렙토마이신 및 2mmol/L 글루타민이 포함된 25mmol/L 포도당 DMEM에서 배양했습니다.

BM 유래 대식세포

이 연구에 사용된 BM 유래 대식세포(BMDM)는 쥐의 대퇴골과 경골에서 BM을 플러시하고 완전한 5mmol/L 포도당 DMEM(10% FBS, 2% 페니실린이 보충된)에서 비조직 배양 처리된 페트리 접시에 플레이팅하여 생성되었습니다. -스트렙토마이신 및 2mmol/L 글루타민) + 분화를 위한 20% L929 세포 조절 배지. 7일 동안의 분화 후, BMDM을 긍정적으로 선택하고, 2×105개 세포/mL의 밀도로 플레이팅하고, 10ng/mL 재조합 뮤린 인터페론-(IFN - ; R&D Systems, UK) + 100 ng/mL LPS(Sigma-Aldrich, UK), 10 ng/mL 재조합 마우스 IL-4(R&D Systems, UK) 또는 사용 전 16시간 동안 배지 전용 대조군 . BMDM은 또한 다양한 혈당 조건(최종 농도가 11 또는 20mmol/L 포도당이 되도록 포도당을 첨가한 5mmol/L 포도당 DMEM) 또는 삼투 조절 조건(만니톨; 5mmol/L 포도당 DMEM)에서 동시에 배양되었습니다. 플러스 15mmol/L 만니톨). 대사 연구는 10mmol/L 디클로로아세테이트(Sigma-Aldrich, UK) 또는 1mmol/L 2-deoxy-d-glucose(Sigma-Aldrich, UK)의 부재 또는 존재 하에 수행되었습니다.

HSC 격리

MagniSort Mouse Hematopoietic Lineage Depletion Kit(ThermoFisher Scientific, UK)를 사용하여 쥐의 대퇴골 및 경골에서 BM을 플러시하고 마커와 배양하여 계보 커밋된 세포(CD3, CD4, B220, Ter119 및 Gr1)를 제거하고 HSC. HSC는 100 ng/mL LPS와 10 ng/mL IFN이 첨가된 완전한 5 mmol/L DMEM(또는 표시된 야생형 자극에 대해 20 mmol/L 포도당 또는 만니톨)에서 5 mL 형광 활성화 세포 분류 튜브에서 배양되었습니다. - 또는 10 ng/mL 재조합 마우스 IL-1(R&D Systems, UK) 웨스턴 블롯 분석의 경우 16시간 동안 또는 ATAC-seq(전위효소 액세스 가능 염색질 ​​시퀀싱) 분석을 위한 분석의 경우 2시간 동안.

BMDM 체외 메모리 모델

마우스 BM은 1, 2, 4 또는 7일 동안 5 또는 20 mmol/L 포도당에서 위에서 설명한 대로 BMDM으로 분화되었습니다. 접착을 통해 BMDM을 양성으로 선택하고, 완전한 5mmol/L DMEM으로 재도입하고, 48시간 동안 배양하여 포도당 정상화 기간을 허용했습니다. 그런 다음 0.25, 0.5, 1, 5 또는 10 µmol/L Ro의 부재 또는 존재에서 16시간 동안 BMDM을 10 ng/mL IFN- 및 100 ng/mL LPS 또는 제어 매체와 함께 사용하도록 자극했습니다. 5-3335(Merck Millipore, UK) 유전자 발현 분석에 사용하기 전.

마우스 단핵구 분리

제조업체의 프로토콜에 따라 EasySep 마우스 단핵구 분리 키트(Stemcell Technologies, Canada)를 사용하여 쥐 단핵구를 말초 혈액으로부터 분리했습니다. 정적 접착 분석을 위해 세포를 즉시 사용했습니다.

Seahorse XFe 96 실시간 ATP 속도 분석 키트

제조업체의 지침에 따라 BMDM(웰당 8×104개 세포, 동물 및 조건당 5개의 복제 웰)에서 XFp RealTime ATP 속도 분석 키트를 사용하여 세포외 플럭스 분석을 수행했습니다. 다양한 농도의 포도당(5 또는 20mmol/L) 또는 대조군(만니톨; 주입 포트 A) 분석 배지를 주입하기 전에 세 가지 기준선 산소 소비율 및 세포외 산성화율 측정을 수행했습니다. 추가 7회 측정 후, XFp Real-Time ATP Rate Assay에서 화합물 올리고마이신(2µmol/L; 주입 포트 B)과 결합된 안티마이신 A(0.5µmol/L) 및 로테논(0.5µmol/L; 주입 포트 C) 키트, 3개의 후속 측정과 함께 순차적으로 주입되었습니다. 해당과정에 의해 생성된 ATP의 양과 ATP 속도 지수(mitoATP 생성률/해당 ATP 생성률)는 Wave(version 2.6, Agilent)로 자동 계산되었습니다.

정적 접착 분석

피부 유래 마우스 내피 세포를 12-웰 ​​플레이트의 유리 커버슬립에서 융합되도록 성장시키고 10ng/mL 재조합 마우스 종양 괴사 인자(R&D Systems, UK)로 16시간 동안 활성화했습니다. 무자극 또는 IFN-+ LPS-자극 말초 혈액 단핵구(또는 5mmol/L 포도당에서 배양된 streptozotocin 당뇨병 마우스의 BMDM)는 제조업체의 지침에 따라 PKH67 형광 세포 링커 키트(Sigma-Aldrich, UK)를 사용하여 녹색으로 형광 표지되었습니다. 표지된 세포를 커버슬립당 5×104개 세포의 밀도로 1시간 동안 내피 세포에 첨가한 후 배지 및 부착되지 않은 세포를 제거하고 인산완충식염수(PBS)로 세척하고 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 커버슬립당 4개의 이미지를 획득했습니다. 부착되고 표지된 세포의 수를 세었다; 커버슬립당 이미지의 평균을 구했습니다. 표시된 이미지는 ImageJ에서 밝기가 동일하게 조정되었습니다.

거품 세포 분석

비자극 또는 자극(LPS + IFN-) BMDM을 12-웰 ​​플레이트의 유리 커버슬립에서 성장시키고 48시간 동안 25µg/mL DiI-아세틸화 저밀도 지단백질(LDL; Bioquote, US)과 함께 배양했습니다. 배지 및 남아있는 DiI-아세틸화 LDL을 제거하고, 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 지질은 Oil Red O로 염색되었고 커버슬립은 DAPI 장착되었습니다. Oil Red O 염색의 위상차 이미지와 핵의 형광 이미지를 촬영하고(coverslip당 4개의 이미지) ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각각 지질의 양 또는 세포 수를 정량화하는 데 사용했습니다. 그런 다음 이미지당 지질 면적을 이미지당 세포 수로 정규화하고 결과를 5mmol/L 포도당 대조군 샘플(BMDM 포도당 실험용) 및 대조군 샘플(당뇨병 BMDM 실험용)에 대한 배수 변화로 표현합니다. 표시된 이미지는 균일하게 밝기가 조정되었습니다.

당뇨병성 BM 이식 실험

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >13.9mmol/L 및 동일한 연령의 대조군 CD68-GFP 마우스를 BM 공여자로 사용하였다. 기증자 마우스로부터 BM을 수집하고, 5×106개의 생존 세포를 치명적으로 조사된(2×500 rads) LdLr-/- 수용자 B6.129S7- Ldlr-tm1Her/J 마우스(JAX 재고 번호 002207)에 정맥 주사했습니다. ). 생착 후, 모든 수용 동물은 12주 동안 서양식이(Open Source Diets D12079B; 1% 지방, 40% kcal)에 놓였습니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 유세포 분석을 위해 생착 후 4, 8 및 12주에 전혈을 수집하고 생착 수준을 모니터링하고 백혈구 집단 수를 평가했습니다. 생착 후 매 4주마다 평가되는 생착은 항CD45로 세포를 염색하고 전체 CD45 플러스 집단 중에서 CD45 플러스 GFP 플러스 세포의 상대적인 비율을 평가함으로써 모니터링되었습니다. 12주에 마우스를 안락사시키고, 전혈을 수집하고, 트리글리세리드, 비에스테르화 지방산, LDL 및 고밀도 지단백 콜레스테롤 측정을 위해 혈청을 처리했습니다. 마우스를 PBS로 관류시킨 후, 밤새 관류 및 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 심장과 대동맥을 해부하고 처리할 때까지 70% 에탄올에 넣었습니다.

대동맥근판 분석 및 면역형광법

플라크 부담을 정량화하기 위해 파라포름알데히드 고정 대동맥 뿌리를 최적의 절단 매체에 놓고 심방과 평행한 평면에서 절단했습니다. 플라크 부피, 플라크 지질 함량,21 및 콜라겐 함량을 정량화하기 위해 대동맥 근부를 통해 고르게 분포된 5개의 절편을 Masson-Goldner trichrome 염색(Merck, UK)했습니다. 간략하게, 절편을 실온에서 1시간 동안 Bouin 용액에 재고정하고 흐르는 물에서 5분 동안 세척한 다음 제조업체의 지침에 따라 두 번째 70% 에탄올 배양에서 Masson-Goldner 염색 키트 프로토콜을 거쳤습니다. 프로토콜 타이밍. 그런 다음 자일렌 습식 슬라이드를 Neo-Mount로 장착하고 커버 유리로 밀봉했습니다. 플라크 특성은 Image Pro Plus 소프트웨어 버전 6.0(Media Cybernetics, Silverspring, MD)에서 정량화되었으며 데이터는 모든 섹션의 평균으로 표시되었습니다.

Immunofluorescence는 6개의 인접 섹션에서 수행되었습니다. 섹션은 GFP(rabbit anti-GFP, A6455, Invitrogen) 또는 대식세포 마커 galectin-3(goat anti-galectin 3, AF1197, R&D Systems)을 사용하여 대식세포 함량에 대해 염색되었으며, 평활근 세포 함량에 대해서는 -actin( 토끼 항-평활근 액틴, ab32575, Abcam PLC), 후생유전학 마크 H3K4me3(히스톤 H3[트리메틸 K4]에 대한 토끼 다클론성, Ab8580, Abcam PLC) 및 H3K27ac(히스톤 H3[아세틸 K27]에 대한 토끼 다클론성, Ab4729, 앱캠 PLC). 면역 형광 염색을 위해 절편을 실온에서 5분 동안 PBS로 재수화하고 DAKO 차단 완충액(Agilent, UK)으로 1시간 동안 차단했습니다. 1차 항체를 DAKO에서 1 μg/mL로 희석하고 섹션에 밤새 4도에서 첨가했습니다. 2차 항체를 DAKO에서 1:200으로 희석하고 실온에서 1시간 동안 첨가했습니다(당나귀 항토끼[A488], A21206, Life Technologies; 당나귀 항염소[A594], A11058, ThermoFisher Scientific). 섹션은 최종적으로 DAPI 장착되었습니다(DAPI 및 DABCO, Abcam, UK가 포함된 글리세롤 장착 매체). 형광 이미지는 Image J 소프트웨어로 분석되었습니다.

유전자 발현

총 RNA는 RNeasy Plus Mini 키트(Qiagen, UK)로 분리하고 Nanodrop 2000 UV-visible spectrophotometer로 정량화했습니다. 제조업체의 지침에 따라 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen, UK)를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 0.2~2μg RNA로 cDNA 합성을 수행했습니다. B2m(Mm00437762), Il{9}}(Mm00446190), Il-1(Mm00462531_m1), iNos에 특이적인 Taqman 프로브를 사용하여 5ng/µL cDNA에서 실시간 정량 PCR을 수행했습니다. (Mm00440502), Ym1(Mm00657009) 및 Fizz1(Mm00556208). Quantitative PCR은 QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR System(ThermoFisher)에서 UNG와 함께 TaqMan 범용 마스터 믹스 II로 수행되었습니다. 모든 PCR 데이터는 내부 하우스키퍼 유전자 발현(B2m)으로 정규화되었고 상대 mRNA 발현을 계산하기 위해 2-ΔCT 방법으로 분석되었습니다.

웨스턴 블롯 분석

세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 방사면역침전 분석 용해 완충액(150mmol/L NaCl, 1.0% IGEPAL CA-630, 0.5 퍼센트 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1퍼센트 SDS, 50mmol/L 트리스, pH 8.0) 프로테아제 및 포스파타아제 억제제로 보충됨. 분석 지침에 따라 비신코닌산 분석(Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific, UK)으로 단백질 농도를 측정했습니다. 동일한 농도의 단백질을 로드하고 SDS-PAGE 젤(4%에서 12% Bis-Tris Gel, Life Technologies, UK)에 실행하여 분리했습니다. 단백질을 니트로셀룰로스 막(Bio-Rad, UK)으로 옮기고 -액틴(마우스 항- -액틴[15G5A11/E2], Invitrogen)을 하우스키퍼 및 로딩 컨트롤로 표시한 특정 항체로 조사했습니다. 멤브레인은 개발되었으며(SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate, Thermo Scientific, UK) Biorad Image Station에서 화학발광으로 감지되었습니다.

플라크 대식세포의 인간 샘플 및 LCM 분리

모든 임상 조사는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 샘플은 UK Human Tissue Act(2004)에 따라 보관되었습니다. 이 연구는 관련 윤리 심사 위원회의 승인을 받았으며 모든 피험자는 서면 동의서를 제공했습니다. 경동맥 내막 절제술을 기다리는 환자를 모집하고 경동맥 플라크를 수술 당시 새로 수집했습니다(환자 특성은 데이터 보충 자료의 Excel 파일 I에 요약되어 있음). 외식한 경동맥 플라크를 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 세척하고 최적의 절단 배지에서 급속 냉동하고 처리할 때까지 -80도에서 보관했습니다.

LCM은 PALM Microbeam LCM 시스템(Carl Zeiss GmbH, Germany)으로 개조된 "가이드 슬라이드" 접근법을 사용하여 수행되었습니다.22,23 경동맥 플라크 샘플은 15μm에서 새로 절단되었습니다. 가이드 슬라이드는 3개의 연속 섹션으로 구성됩니다. 첫 번째 섹션은 미세해부학적 위치 결정을 돕기 위해 Masson-Goldner 염색 키트 프로토콜로 염색되었고, 다음 2개 섹션은 대식세포(마우스 항인간 CD68 [클론 KP{{7} }], Dako, Cambridge UK) 또는 평활근 세포(mouse antihuman-actin [clone 1A4], Dako, Cambridge UK). 후속 섹션(최대 15개)을 LCM 멤브레인 슬라이드(ThermoFisher Scientific, UK)로 자르고 즉시 처리할 수 있도록 크레실 바이올렛으로 염색했습니다. 대식 세포 클러스터는 PALM RoboSoftware(버전 4.5, Carl Zeiss GmbH, 독일)를 사용한 가이드 슬라이드 염색을 기반으로 수동으로 식별되었습니다. Zeiss PALM AdhesiveCap(Carl Zeiss GmbH, Germany)에서 총 3~5×106 µm2의 관심 영역을 레이저 캡처했습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 세포를 즉시 용해시키고, 드라이아이스 상에서 급속 동결시키고, RNEasy 마이크로 키트(Qiagen, UK)로 RNA를 추출할 때까지 -80도에서 보관하였다.

인간 플라크 대식세포 마이크로어레이

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >5는 RNA 증폭, 비오티닐화 및 유전자 발현 마이크로어레이 분석을 위해 사용되었습니다. 이 샘플은 추가 처리를 위해 Cambridge Genomic Services(영국 캠브리지 대학교 병리학과)에 제출되었습니다. Ovation Pico WTA V2 키트(Nugen Technologies Inc, US)를 사용하여 증폭 및 비오티닐화를 수행한 다음, 배치를 최소화하기 위해 2 Illumina Human HT12 v4.0 BeadChips(Illumina, US)에서 무작위 순서로 혼성화를 다양화했습니다. /칩 변형. Illumina BeadArray는 일반 지수 정규화를 사용하여 Bioconductor 비드 어레이 패키지(버전 2.24.0)24,25로 처리되었습니다. 프로브 세트는 극한 값을 피하지만 모든 샘플에서 변동성을 포착하기 위해 최대 사분위수 범위를 기준으로 유전자별로 축소되었습니다. 주석이 없는 제어 프로브 세트는 추가 분석에서 제외되었습니다. 21036개 유전자의 최종 목록의 차등 발현(DE)을 Bioconductor limma 패키지(버전 3.30.13)26로 평가하여 당뇨병과 대조군을 비교하고 증상/무증상 상태를 조정했습니다. 직교 데이터 세트와 그룹당 8개 샘플의 가용성을 감안할 때 상대적으로 관대하게 조정된 P 값을 사용했습니다.<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

인간 단핵구 분리

K2-EDTA 코팅 튜브(BD Vacutainer, New Jersey)에서 건강한 기증자로부터 말초 정맥혈(15–20 mL)을 채취하여 1시간 이내에 처리했습니다. 전혈을 Accuspin Histopaque-1077 컬럼(Sigma-Aldrich, US)에서 제조업체의 지침에 따라 원심분리하여 혈장 및 단핵 세포 농축 분획을 얻었습니다. 제조업체의 설명된 프로토콜에 따라 음성 선택 비드 분리 키트(CD16 고갈이 없는 EasySep 인간 단핵구 농축 키트, StemCell Technologies, Canada)를 사용하여 단핵구 분리를 위해 단핵 세포 농축 분획을 진행했습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포 분리 및 자극

스톡홀름의 Karolinska Institute(2011/1002-31/1 및 2009/1881-31/1)에서 현지 및 지역 윤리 승인을 받은 후 당뇨병 환자 및 대조군 환자를 임상 연구에 모집했습니다. 제조업체의 지침에 따라 SepMate(StemCell Technologies) 및 Lymphoprep(StemCell Technologies)으로 밤새 금식한 후 수집한 말초 혈액 샘플에서 PBMC를 분리했습니다. 분리된 PBMC는 동결되어 90% FBS 및 10% dimethyl sulfoxide에 보관되었습니다.

저장된 PBMC를 해동하고 원심분리(500g에서 10분)에 의해 PBS에서 세척하고 생존 세포를 계수하고 12- 웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 생리학적(낮은) 포도당 DMEM, 10% FBS, 2 mmol/L l-글루타민 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신. PBMC를 밤새 방치하고 PBS-비히클 또는 100ng/mL LPS 및 10ng/mL의 재조합 IFN-(R&D Systems)로 6시간 동안 처리했습니다. 자극 후, PBMC를 RLT(QIAGEN)에서 용해시키고 급속 동결하고 -80℃에서 보관하였다. 설명된 대로 RNA를 분리하고 RNA 시퀀싱(RNAseq)을 수행했습니다.

대사체학 및 대사산물 측정

분리된 인간 단핵구는 완전한 5mmol/L 포도당 DMEM에서 샘플당 3.5×105개 세포의 밀도로 배양되었으며, 배지는 포도당으로 보충되어 최종 농도가 20mmol/L 포도당이 되도록 했습니다. , 또는 12시간 동안 5 mL 형광 활성화 세포 분류 튜브에 15 mmol/L 만니톨이 포함된 배지. 세포 용해물은 얼음처럼 차가운 메탄올로 20분 동안 드라이 아이스에서 추출하고 액체 질소에서 급속 냉동하여 준비했습니다. 분석 당일 시료를 볼텍싱한 후 10000g에서 4도에서 10분 동안 원심분리했습니다. 풀링된 품질 관리 샘플은 각 샘플 추출물 60µL를 혼합하여 준비하고 전체 분석 실행 동안 주기적으로 분석하여 방법 성능을 확인했습니다. 샘플을 0.1-µm Ultrafree-MC 원심분리 필터(5000g, 3분)로 여과한 다음 액체 크로마토그래피-질량 분석 바이알로 옮겼습니다. 비표적 대사체학 분석은 이전에 설명한 대로 수행했습니다.27 간단히 말해서 샘플은 70000의 질량 분해능에서 작동하는 극성 전환(양성-음성) 획득을 사용하여 Q-Exactive Orbitrap과 결합된 Thermo Ultimate 3000 초고성능 액체 크로마토그래피에서 분석되었습니다. 전체 너비는 최대 절반입니다. 친수성 화합물은 Merck Sequant ZIC-HILIC 컬럼(150×4.6mm, 5-µm 입자 크기)에서 크로마토그래피로, 소수성 화합물은 Thermo Accucore aQ RP C18 컬럼(150×2.1mm, 2.{{38 }}µm 입자 크기). 대사 산물은 사내 데이터베이스를 사용하여 식별되었습니다.27 MetaboAnalyst(버전 4.0)를 사용하여 모든 대사 산물 측정에 대해 대사 산물 집합 농축 및 대사 경로 분석을 수행했습니다.

BMDM 및 HSC 대사산물 측정을 위해 세포를 이전에 설명한 대로 웰당 5 x 105 밀도로 배양하고 배양 상청액을 ABX Pentra 400(Horiba)에서 실행하여 포도당(ABX Pentra Glucose PAP CP, Horiba, UK)을 측정했습니다. 및 젖산염(ABX Pentra Lactic Acid) 수준. 동일한 조건 하에서 배양되었지만 세포의 존재 하에서는 배양되지 않은 대조군 완전 세포 배양 배지에 존재하는 포도당 및 젖산 농도에 대해 측정치를 정규화하였다. BMDM 세포 용해물은 제조자의 지시에 따라 석시네이트 수준을 측정하기 위해 사용되었다(Succinate Assay Kit, Abcam, UK).

ATAC-seq 분석

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200bp. DNA 농도는 Qubit 형광계(Life Technologies)로 측정했고 라이브러리 크기 분포는 Bioanalyser DNA HighSensitivity Chip(Agilent, UK)으로 평가했습니다. 맞춤형 Nextera 프라이머로 라이브러리 증폭을 수행했습니다.28 라이브러리는 Illumina HiSeq 3000/4000 플랫폼과 50-bp 단일 읽기 구성을 사용하여 CeMM의 Biomedical Sequencing Facility에서 시퀀싱되었습니다.

품질을 위해 읽기를 제어하고 나머지 어댑터를 다듬었습니다. 그런 다음 읽기는 "민감한 로컬" 모드에서 Bowtie(버전 2.2.6)를 사용하여 마우스 게놈(Mm10)에 정렬되었습니다. 정렬된 읽기는 저품질 일치(10 이하의 매핑 품질) 또는 미토콘드리아 서열에 대한 매핑 읽기를 제거하기 위해 필터링되었습니다. 정렬 시작 위치는 MACS2(버전 2.1.129)로 피크 호출 전에 가닥 인식 방식(4bp, -5bp,28)으로 이동되었습니다. 피크 센터링(summits=100) 및 edgeR.31이 있는 DiffBind(버전 2.4.830)를 사용하여 차등 바인딩된 영역을 식별했습니다.

그런 다음 피크 염색체 위치를 Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool(주석의 게놈 영역 강화)에 입력하여 당뇨병 샘플이 풍부한 피크(FDR[False Discovery Rate] {{0}}.1 이하)에 대해 경로 분석을 수행했습니다. 버전 3.0).32 그런 다음 미분 피크 영역을 MEME-염색질 면역침강법(ChIP; 버전 4.12.0)33으로 분석했습니다.33 이 분석은 포괄적인 모티프 분석을 수행하여 농축된(농축된) 알려진 또는 알려지지 않은 결합 모티프를 식별합니다. 모티프 E<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

런트 관련 전사 인자 1 표적 식별

ATAC-seq 영역의 MEME-ChIP은 Runt 관련 전사 인자 1(RUNX1)을 IL-1 및 비자극 당뇨병 HSC 모두에서 잠재적인 조절자로 확인했습니다. MEME GOMo(버전 4.12.0)33은 컨센서스 RUNX1 모티프(MA002.2)에 대해 마우스 및 인간 프로모터(-1000, 플러스 200)를 스캔하는 데 사용되었습니다. Gene Ontology 농축 분석 외에도 GOMo는 대상으로 식별된 유전자 목록을 반환합니다. 이러한 적중은 경험적 P 값을 가진 마우스와 인간 모두에 결합된 보존된 프로모터로 제한되었습니다.<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

RNA-seq 분석

5mmol/L에서 배양되고 LPS + IFN-으로 6시간 동안 자극된 대조군 또는 당뇨병성 BMDM(n=6) 또는 자극되지 않은 대조군 세포를 RNA-seq 분석에 사용했습니다. 간단히 말해서, 제조업체의 지침에 따라 mirVana mRNA/miRNA Isolation Kit(ThermoFisher Scientific, UK)를 사용하여 RNA를 분리했습니다. 전체 RNA의 양은 Qubit Fluorometric Quantitation 시스템(Life Technologies)으로 정량화되었고, RNA 무결성 번호는 Experion Automated Electrophoresis System(Bio-Rad)으로 결정되었습니다. RNA-seq 라이브러리는 Sciclone 및 Zephyr 액체 취급 로봇(PerkinElmer, UK)을 모두 사용하는 TruSeq Stranded mRNA LT 샘플 준비 키트(Illumina, UK)로 준비되었습니다. 라이브러리 농도는 Qubit Fluorometric Quantitation 시스템(Life Technologies, UK)으로 정량화되었고 크기 분포는 Experion Automated Electrophoresis System(Bio-Rad, US)으로 평가되었습니다.

시퀀싱을 위해 샘플을 희석하고 등몰량으로 풀링했으며 CeMM의 Biomedical Sequencing Facility에서 50-bp 단일 읽기 구성으로 Illumina HiSeq 3000/4000 기기에서 시퀀싱했습니다. Illumina 실시간 분석 소프트웨어에서 제공하는 기본 호출은 이후에 Illumina2bam 도구(1.17.3)를 통해 개별 샘플별 이진 정렬 맵 파일로 디멀티플렉싱(BamIndexDecoder)하기 전에 이진 정렬 맵 형식(Illumina2bam)으로 변환되었습니다. CeMM의 Biomedical Sequencing Facility에서 라이브러리를 준비하고 시퀀싱했습니다.

리드는 Gencode(버전 M16) 주석이 있는 유전자 계수 모드(quantMode GeneCounts)에서 STAR(버전 2.5.3a34)를 사용하여 마우스 게놈(GRCm38/mm10)에 정렬되었습니다(메가 전사체 Gm20388은 개입 유전자의 중첩을 피하기 위해 제거됨). 카운트를 R(버전 3.3.3)에 로드하고 다음을 사용하여 성적표를 제거한 후 edgeR(버전 3.16.535)로 분석했습니다.<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1.5는 DE로 간주되었습니다. DE 테이블과 유전자 목록은 Data Supplement(비자극)에 Excel File II로, Data Supplement(LPS + IFN 자극)에 Excel File III로 포함됩니다. edgeR 함수 cpm은 히트 맵 및 기타 플롯에 대한 로그 정규화(데이터 보충 자료의 Excel 파일 IV)에 사용되었습니다. 히트맵은 R 패키지 히트맵(버전 1.0.836)으로 생성되었습니다. 대조군 LPS + IFN-샘플과 비교하여 당뇨병 환자에서 DE 유전자 중 RUNX1 표적 유전자 분석의 과대대표는 인간 어레이 데이터에 대해 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다.

칩 시퀀싱

총 1×106개 세포/mL를 1% 포름알데히드로 실온에서 10분 동안 고정하고 PBS로 세척한 후 -80도에서 보관하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라 Chromatin EasyShear Kit-Low SDS(Diagenode, Belgium)로 세포를 전단하고 Bioruptor Pico 초음파 처리 장치(카탈로그 번호 B01080010, 벨기에 Diagenode)로 초음파 처리했습니다. MAGnify Chromatin Immunoprecipitation System(Thermo Scientific)을 사용하여 항히스톤 H3(트리메틸 K4; ab8580) 또는 항히스톤 H3(아세틸 K27; ab4729)를 사용하여 염색질 단편을 선택했습니다. 제조업체의 지침에 따라 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 준비했습니다. 간단히 말해서, 정제된 ChIP 또는 입력 DNA는 말단 수리되었고 A-테일은 어댑터 결찰에 이어졌습니다. 어댑터 결찰 DNA는 SPRI Ampure XP 비드(Agencourt)로 크기를 선택하고 Illumina 호환 시퀀싱 프라이머로 강화했습니다. 최종 라이브러리를 SPRI Ampure XP 비드로 정제하여 어댑터 다이머를 제거하고 Illumina HiSeq 3000/4000 플랫폼 및 50-bp 단일 읽기 구성을 사용하여 CeMM의 생물의학 시퀀싱 시설에서 시퀀싱했습니다.

생물 정보학

자극받지 않은 BMDM에서 염색질 개방성과 유전자 발현 사이의 관계를 조사하기 위해 당뇨병 대 대조군 ATAC-seq 피크(log2 배 변화) 및 근접 유전자의 mRNA 수준(log2 배 변화)을 Pearson 선형 상관관계로 비교했습니다.

ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-sequencing(ChIPseq) 및 H3K27ac ChIP-seq 실험의 판독값은 Integrative Genome Browser를 사용하여 대표적인 샘플에서 시각화되었으며, 판독 깊이의 체계적인 차이를 설명하기 위해 실험 및 셀 유형별로 트랙 높이가 조정되었습니다.

통계 분석

모든 비시퀀싱 데이터 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어에서 수행되었습니다. 데이터는 Shapiro-Wilk 정규성 검정에 의해 정규 분포에 대해 분석되었습니다. 두 그룹 간의 비교는 각각 2-정규 분포 또는 비정규 분포 데이터에 대한 꼬리 학생 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정으로 계산되었습니다. 여러 그룹 간의 비교는 1- 방식 또는 2- 방식 ANOVA 분석과 Bonferroni 사후 수정으로 계산되었습니다. 데이터는 정규 분포 데이터의 경우 평균±SD로, 비정규 분포 데이터의 경우 중앙값±사분위수 범위로 보고됩니다. 그림 범례에서 여러 복제 및 기타 통계 세부 정보를 찾을 수 있습니다. 생체 내 및 시험관 내 실험 모두에서 n은 개별 동물 또는 개별 건강한 지원자 또는 환자의 수입니다. 폴드 변화는 평균 테스트 조건 값을 평균 제어 값으로 나눈 값으로 계산됩니다.

결과

당뇨병성 고혈당증은 세포 대사를 변화시켜 전 염증성 유전자 발현 및 기능을 유도합니다

호기성 해당작용은 전염증성(M1) 유전자 발현을 증가시키고,37 고혈당증은 또한 M1- 관련 유전자 발현을 촉진합니다.10,11 따라서 우리는 높은 세포외 포도당이 해당작용을 증가시켜 M1 표현형을 향한 대식세포의 양극화를 강화한다는 가설을 세웠습니다. .

일차 인간 단핵구의 대사체 분석은 높은 세포외 포도당(20mmol/L)이 삼투적으로 일치하는 생리적 포도당(5mmol/L) 조건과 비교하여 대사 프로필을 이동시켰음을 나타냅니다. 경로 분석(그림 1A)은 고혈당이 트리카르복실산 주기(FDR, 0.002) 및 피루브산 대사(FDR, 0.005)에서 상당한 변화를 일으켰으며, 이는 석시네이트, 말레이트 증가로 표시됨( 그림 1B), 젖산염 및 피루브산(그림 1C) 수준은 각각 대사산물 세트 농축 분석(그림 1D)과 함께 Warburg 효과(FDR, 0.04)를 강조합니다.

그림 1. 높은 포도당은 세포 대사를 변화시킵니다. 대사 경로 분석. (B) 석시네이트, 말레이트, (C) 락테이트 및 피루베이트 및 (D) 인간 단핵구 세포 용해물 대사체학 샘플(n=5)에 대한 대사체 세트 농축 분석(Metaboanalyst)에 대한 개별 측정. 마우스 골수 유래 대식세포(해마 생체분석기; n=6마리의 개별 동물)에 대한 세포외 플럭스 분석은 다양한 세포외 포도당에 대한 반응으로 (E) 세포외 산성화율(ECAR) 및 (F) 산소 소비율(OCR)을 측정했습니다. 삼투 조절(만니톨) 및 대사 억제제 주사. 높은 포도당(G)은 해당 ATP(glycoATP) 생성을 증가시켰고 (H) ATP 속도 지수(미토콘드리아 ATP 생성 속도/glycoATP 생성 속도)를 감소시켰으며, 이는 더 해당 표현형으로의 이동을 나타냅니다. 데이터는 (B 및 C) 2- 방식 ANOVA 또는 (E–H) 1- 방식 ANOVA 및 Bonferroni 사후 테스트로 분석되었습니다. 표시된 모든 데이터는 평균±SD입니다. AU는 임의의 단위를 나타냅니다. FDR, 허위 발견률; 및 TCA, 트리카르복실산. *피<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

마우스 BMDM에서 높은 포도당(20mmol/L)에 대한 반응으로 더 많은 해당(및 덜 산화적인) 표현형이 확인되었으며, 이는 세포외 산성화 속도의 증가, 해당 ATP 생산 증가(2-배; P<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

해당 비율의 이러한 증가는 해당 분해 디클로로아세테이트의 억제제에 의해 방지되었습니다(데이터 보충 자료의 그림 Ia 및 Ib).

BMDM에서 고혈당은 전염증성 M1-관련 Il-6 발현(2.7-배; P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

그림 2. 고혈당은 대식세포 유전자 발현과 기능을 변화시킵니다. M1(지질다당류[LPS] + 인터페론-[IFN-] 자극) 골수 유래 대식세포(BMDM) (A) Il-6 및 (B)는 디클로로아세테이트(DCA)의 존재 또는 부재 하에서의 유전자 발현입니다. M2(interleukin-4 자극됨) BMDM (C) Ym1 및 (D) Fizz1 유전자 발현. A에서 D까지, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 데이터는 B2m 발현으로 정규화됩니다. n=7 ~ 10. E, 내피 세포에 대한 마우스 단핵구 부착의 이미지 정량화(n=5). F, BMDM에 의한 아세틸화 저밀도 지단백질 흡수의 이미지 정량화, 이미지당 세포 수로 정규화. 대표적인 (G) 내피 세포에 대한 형광 PKH67- 표지 마우스 단핵구의 정적 접착 이미지 및 (H) 오일 레드 O(ORO)- 및 DAPI 염색 거품 세포 이미지. 모든 데이터(A–H)는 평균±SD로 표시됩니다. (A–D) 1-방향 ANOVA 또는 (E 및 F) 2-Bonferroni 사후 분석을 통한 ANOVA 방식. 각 점은 개별 동물을 나타냅니다(정적 접착 및 거품 세포 형성에 대한 평균 4개의 이미지). AU는 임의의 단위를 나타냅니다. NS는 중요하지 않습니다. *피<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

염증 촉진에 미치는 영향을 고려하여 높은 세포외 포도당이 죽종형성과 관련된 단핵구 및 대식세포 기능을 변경하는지 테스트했습니다.38,39 높은 포도당은 활성화된 내피 세포에 대한 마우스 단핵구 부착을 증가시켰습니다(2.6-배; P<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

당뇨병 마우스의 BM 유래 세포는 고혈당증으로 유도된 훈련된 면역을 나타냄

우리는 다음으로 당뇨병의 마우스 모델을 사용하여 포도당 정상화 후에도 고혈당증이 대식세포에서 지속적인 전염증성 변화를 유발하는지 여부를 테스트했습니다. 우리는 비 당뇨병, 연령 일치 대조군 마우스 및 streptozotocin에 의해 고혈당증이 유도되고 생체 내에서 6 주 동안 유지되는 동계 ​​당뇨병 마우스에서 BM을 얻었습니다 (데이터 보충 자료의 그림 IIIa-IIId). 세포는 생리학적 포도당(5mmol/L; 그림 3A) 하에서 BMDM으로 분화되었습니다. 자극 후, 당뇨병 마우스 기원의 BMDM은 향상된 M1-관련 Il-6 유전자 발현(4.1-배; P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

그림 3. 당뇨병 마우스의 골수(BM) 유래 대식세포(BMDM)는 유전자 발현에서 고혈당 기억을 나타냅니다. A, 당뇨병 및 제어 BMDM 프로토콜의 개략도(n=10–12). (B) Il-6(P<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

또한 활성화된 내피에 대한 접착력이 증가했습니다(6.3-배; P<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

그림 4. 당뇨병 마우스의 골수 유래 대식세포(BMDM)는 포도당 정상화에도 불구하고 변경된 기능을 나타냅니다. 당뇨병 마우스의 BMDM은 5mmol/L(n=5-8)로 분화되었습니다. A, 내피 세포에 대한 BMDM 부착의 이미지 정량화(n=8). B, BMDM에 의한 아세틸화 저밀도 지단백질 흡수의 이미지 정량화, 이미지당 세포 수로 정규화. 내피 세포에 대한 형광(PKH67) 표지된 BMDM의 대표(C) 정적 접착 이미지 및 (D) 오일 레드 O(ORO)- 및 DAPI 염색 거품 세포 이미지. 모든 데이터는 평균±표준편차로 표시되며 각 점은 개별 동물을 나타냅니다(정적 부착 및 거품 세포 형성에 대한 평균 4개 이미지). 데이터는 Bonferroni 사후 테스트와 함께 2-way ANOVA로 분석되었습니다. IFN-는 인터페론-을 나타내고; 및 LPS, 리포폴리사카라이드. *피<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

고혈당증으로 유도된 훈련된 면역이 죽상동맥경화증을 유발합니다

따라서, 죽상동맥경화증에서 고혈당증 유발 훈련 면역의 기능적 중요성을 테스트하기 위해 우리는 정상혈당 조절 또는 streptozotocin 유발 당뇨병 기증자 마우스(혈당, 33.9±6.9mmol/L)의 BM을 죽상동맥경화증이 발생하기 쉬운(정상혈당) Ldlr-/ - 수령 마우스(그림 5A). 각각의 경우에 기증자 마우스는 인간 CD68 프로모터의 통제 하에 GFP에 대해 형질전환되었습니다.40 PBMC의 유세포 분석에 의해 효과적이고 동등한 생착이 나타났으며 CD45 + GFP + CD11b 또는 Ly6C에 대해 양성인 세포의 존재를 확인했습니다. 데이터 보충 자료의 그림 IVa 및 IVb). 서양식 식단을 12주 동안 섭취한 후, 혈중 지질 측정치(데이터 보충 자료의 그림 IVc 및 IVd) 또는 유동 세포 계측법으로 평가한 백혈구 하위 집합(자료 보충 자료의 그림 IVe)에는 차이가 없었습니다.

당뇨병성 BM을 받은 쥐는 죽상동맥경화증이 현저하게 증가했으며 대다수는 비당뇨병 환자에서 가장 큰 죽상경화증 부담을 가졌습니다(중간 플라크 면적, 44461 µm2 [사분위수 범위, 18368–59597 µm2] 대 79809 µm2 [44745–177740 µm2] ; Mann-Whitney, P=0.036). 이 마우스는 또한 플라크의 대식세포 함량 증가(P=0.052; 데이터 보충 그림 V), 지질이 풍부한 괴사 코어 영역(2.8-배, P{{18 }}.0076; 데이터 보충 자료의 그림 VIa) 및 지질이 풍부한 괴사 코어 비율(2.4-fold, P=0.046; 자료 보충 자료의 그림 VIb) 콜라겐 함량(플라크 퍼센트; 데이터 보충 자료의 그림 VIc 및 VId) 또는 평활근 세포(플라크 퍼센트; 자료 보충 자료의 그림 VIe 및 VIf)의 차이.

HSC에서 고혈당증으로 유도된 훈련된 면역은 후생적 재프로그래밍으로 이어지는 대사의 변화에 ​​의해 유발됩니다

고혈당 마우스의 BM이 시험관 내 BMDM에서 발견되는 지속적인 전 염증성 유전자 발현 및 기능적 반응과 함께 죽상 동맥 경화증을 촉진한다는 시연을 감안할 때 우리는이 기억이 BM 유래 세포에서 훈련 된 면역의 징후라고 추론했습니다. 훈련된 면역은 H3K4me3 및 H3K27ac와 같은 오래 지속되는 염색질 변경 후생유전학적 표지를 유도하는 세포 대사의 변경과 관련이 있습니다.17,18,41 , B 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구 세포: 세포외 포도당이 높은 조건에서 배양된 CD3-, CD4-, B220-, Ter119, Gr1-도 포도당 섭취와 젖산 생성이 증가하여 당분해 조절 장애를 나타냅니다. (피<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

대동맥 근판에서 H3K4me3에 대해 양성으로 염색된 대식세포 관련 핵의 비율은 당뇨병 기증자로부터 BM을 받은 마우스에서 더 높았습니다(1.8-배, P<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

그림 5. 당뇨병성 골수(BM)는 장기간의 포도당 정상화에도 불구하고 죽상동맥경화증을 유발합니다. A, BM 이식 실험의 개략도. B, 골수 이식 12주 후 마우스에서 말초 백혈구 집단의 유세포 분석. C, 당뇨병 기증자 또는 대조군 기증자 CD68- GFP BM을 받은 Ldlr-/- 마우스의 대표적인 대동맥 뿌리 이미지. BM 이식 유래 대식세포(녹색은 녹색 형광 단백질[GFP]를 나타냄) 또는 모든 대식세포(빨간색은 갈렉틴-3[GAL3]을 나타냄)에 대한 Masson Trichrome 염색(왼쪽) 및 면역형광 염색. (D) 플라크 부피의 이미지 정량화(P=0.036). 데이터는 Bonferroni 사후 테스트(B)를 사용하여 1-way ANOVA로 분석된 평균±SD로 표시되거나 Mann-Whitney U 테스트(D)로 분석된 중앙값 ±사분위수 범위로 표시됩니다. 대조군 n=6, 당뇨병 환자 n=9. E, 당뇨병 또는 대조군 BM 이식을 받은 Ldlr-/- 마우스의 대표적인 대동맥 근부 이미지. F, GAL3 대식세포 양성 영역 내에서 H3K4me3 또는 H3K27ac에 대해 양성으로 염색된 핵 백분율의 정량화. 각 데이터 포인트는 개별 동물을 나타냅니다(평균, 6개 섹션, n= 7 ~ 10). 평균 ± SD로 표시됩니다. 단방향 ANOVA 분석. BMDM은 BM 유래 대식세포를 나타냅니다. HSC, 조혈 줄기 세포; IFN-, 인터페론-; 및 LPS, 리포폴리사카라이드. *피<0.05.

이 비암호화 게놈 영역 세트의 생물학적 관련성을 탐색하기 위해(추정적인 시스-조절 기능에 중점을 두어) 당뇨병 세포에서 접근성이 증가된 염색질 영역을 2개의 가장 가까운 유전자(10{{ 11}}0 kb) Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool로 분석했습니다.33 이 경로 분석은 백혈구 활성화(3.3-배; FDR, 0.0005)를 포함한 여러 염증 관련 경로의 증가를 나타냈습니다. ) 및 대식세포에서 LPS 내성과 관련된 유전자(2.7-fold; FDR, 0.0009). 단독으로 높은 포도당이 염색질 변형을 유도할 수 있는지 여부를 이해하기 위해 ATAC-seq를 사용하여 IL-1 자극이 없는 대조군과 당뇨병 마우스의 HSC를 관찰했습니다. 자극을 받지 않은 HSC는 357개의 차등 피크(FDR 0.2 이하)를 표시했으며, 그 중 51%는 대조군과 비교하여 당뇨병 기원 세포에서 접근성이 증가했으며 대부분은 인트론(48%) 또는 유전자간(21%) 영역에서 증가했습니다.

HSC에서 이러한 결과를 감안하여 다음으로 파생 BMDM에서 염색질 접근성과 유전자 발현을 조사했습니다. 우리는 무자극 또는 전염증성 자극(LPS + IFN-) 조건 하에서 대조군 및 당뇨병 마우스의 BMDM에 대해 ATAC-seq 및 RNA-seq를 수행했습니다. 당뇨병 마우스의 BMDM은 비자극 조건에서 1047개의 차등 영역(FDR<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5). 종합하면, ATAC-seq 및 RNAseq 데이터는 당뇨병이 전염증성 자극에 대한 과장된 반응에 대해 대식세포를 프라이밍했음을 시사합니다.

그림 6. 당뇨병은 H3K4me3 및 H3K27ac의 수준과 염색질 접근성을 변경합니다. (A)자극되지 않은 또는 (B)자극된 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 트랜스포사제 액세스 가능한 염색질 시퀀싱 염색질 읽기에 대한 모든 분석의 MA 플롯,<0.05, fold change >1.5)은 분홍색으로 강조 표시됩니다(자극되지 않은 1047개, 자극된 40개, n=6). C, H3K4me3 및 H3K27ac의 가변 영역은 조혈 줄기 세포(HSC) 및 대조군 대 당뇨병 마우스(그룹당 n=6)의 BMDM에서 염색질 면역침전 시퀀싱에 의해 정량화되었습니다. D, 전사 시작 부위에서 HSC, 비자극 BMDM 및 전염증 자극 BMDM(지질다당류[LPS] + 인터페론-[IFN])에서 H3K27ac 및 K3K4me3의 평균 적용 범위의 히스토그램 증가된 영역에 근접한 단백질 코딩 유전자의 ±1kb 자극받지 않은 BMDM(대조군, n=405)의 접근성 및 선택되지 않은 지역의 배경 수준과 비교.

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0.5 각각), 차동 ATAC-seq 피크의 배수 변화와 DE의 배수 변화를 비교했습니다. 연속 변수로 조사한 결과, 염색질의 변화와 근접 유전자의 발현 사이에 강한 상관관계가 있었습니다(R=0.65; P<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >주석이 달린 전사 시작 사이트에서 1kb. 유전자 프로모터 영역(전사 시작 사이트±1kb)이 가장 가능성이 높은 규제 대상을 나타내기 때문에 이러한 인핸서에 근접한 유전자에 초점을 맞췄습니다. ATAC-seq는 차별적으로 열린 염색질(P<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

그림 6. 당뇨병은 H3K4me3 및 H3K27ac의 수준과 염색질 접근성을 변경합니다. (A)자극되지 않은 또는 (B)자극된 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 트랜스포사제 액세스 가능한 염색질 시퀀싱 염색질 읽기에 대한 모든 분석의 MA 플롯,<0.05, fold change >1.5)은 분홍색으로 강조 표시됩니다(자극되지 않은 1047개, 자극된 40개, n=6). C, H3K4me3 및 H3K27ac의 가변 영역은 조혈 줄기 세포(HSC) 및 대조군 대 당뇨병 마우스(그룹당 n=6)의 BMDM에서 염색질 면역침전 시퀀싱에 의해 정량화되었습니다. D, 전사 시작 부위에서 HSC, 비자극 BMDM 및 전염증 자극 BMDM(지질다당류[LPS] + 인터페론-[IFN])에서 H3K27ac 및 K3K4me3의 평균 적용 범위의 히스토그램 증가된 영역에 근접한 단백질 코딩 유전자의 ±1kb 자극받지 않은 BMDM(대조군, n=405)의 접근성 및 선택되지 않은 지역의 배경 수준과 비교.

이러한 차이는 분화 후 비당뇨 기원 세포에서 H3K27ac가 증가했기 때문에 부분적으로 BMDM에서 감소했습니다(그림 6D). 그러나 HSC의 이러한 프로모터에서 H3K4me3 마크가 증가했으며, 식별 가능한 차이는 사이토카인 자극 후를 포함하여 분화된 대식세포에서 지속되었습니다(그림 6D). 일시적인 H3K27ac 및 지속적인 H3K4me3 표시의 이러한 패턴은 조직 배양(데이터 보충 자료의 그림 VIII) 및 마우스 플라크 대식세포에서의 면역조직화학(그림 5E 및 5F) 모두에서 우리의 발견과 일치합니다.

ATAC-seq에 의해 식별된 차별적으로 열린 염색질 영역은 근접 유전자의 전사 변화와 매우 유의하게 연관되어 있습니다. 또한, 염색질 접근성(당뇨병 대 대조군)의 차이 정량화 및 근접 유전자의 mRNA 발현 수준 변화와의 직접적인 비교는 높은 상관관계가 있었습니다(R=0.5; P=6.2e). -15, 그림 7A). 관련 게놈 유전자좌에서 이러한 효과를 조사하기 위해 우리는 이전에 당분해 유도 훈련 면역에 연루된 2개 유전자의 프로모터에서 ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-seq 및 H3K27ac ChIP-seq 데이터를 결합하고 염증 유발에 관련된 제품을 결합했습니다(Il -6) 및 포도당 대사(Hk1). 이 유전자는 전사 시작 부위에서 접근 가능한 염색질 영역을 나타내며, 이러한 게놈 유전자좌에서 H3K4me3 및 H3K27ac 피크와 관련이 있습니다(그림 7B).

어떤 전사 인자가 이러한 고혈당증 유발 훈련 면역 패턴의 매개체로 관련될 수 있는지에 대한 통찰력을 얻기 위해 Motif Enrichment Analysis33는 당뇨병 상태에서 접근성이 증가한 염색질 영역에서 수행되었습니다. 현저하게 강화된 전사 인자 모티프에는 이전에 면역 기억과 관련된 RUNX1(FDR, 0.0001),46 및 PU.1(FDR, 0.04) 및 CCCTC 결합이 포함되었습니다. 계수(FDR, 1.8×10-7; 그림 8A). 바인딩 모티프의 접근성을 기반으로 전사 인자 RUNX147을 연관시킨 결과, 우리는 RUNX1 표적 유전자가 LPS와 IFN 자극 BMDM의 DE 유전자 사이에서 상당히 과장되었는지 여부를 조사했습니다. 이 분석은 1348개의 DE 유전자 중 95개를 RUNX1 표적으로 식별했습니다(P<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

인간 플라크 대식세포 기능 프로파일이 마우스 대식세포의 기능 프로파일과 일치하는지 여부를 확인하기 위해 당뇨병 대 대조군 마우스의 자극된 BMDM에서 측정된 발현을 가진 39개의 M1 및 M2 유전자 세트와 비교했습니다(그림 3G). 이들은 양성 또는 음성 로그 배수 변화(당뇨병 대 대조군)로 요약되었고 제2형 당뇨병 환자의 인간 플라크 대식세포(대조군)의 동등한 변화와 비교되었습니다. Fisher 정확 테스트는 당뇨병 환자와 대조군에서 상향 조절되거나 하향 조절되는 유전자에 대한 마우스 BMDM과 인간 플라크 대식세포 데이터 세트 사이에 유의미한 관계가 있음을 보여주었습니다(P=0.0155; 교차비, 6.83).

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >3000개의 유전자를 일치하는 비당뇨 대조군과 비교했습니다. 변경된 유전자의 유전자 집합 농축 분석은 염증 반응(P=1.70×10-5) 및 IL-6 JAK STAT3 신호를 포함하여 Hallmark 경로에 대해 자극된 당뇨병 PBMC(대조군)에서 긍정적인 농축을 보여주었습니다. P=0.0221) 및 반응성 산소 종 및 반응성 질소 종 생성(P=0.0049), IL-/IL- 신호 전달(P=0.0110)을 포함한 Reactome 경로 및 Toll-like 수용체 1/2 캐스케이드(P=0.0033). 이러한 경로는 이러한 말초 세포가 당뇨병 마우스의 BMDM에서 보고한 것과 유사한 프라이밍 특성을 보여주었다는 것을 보여줍니다(그림 3G).

마지막으로, 고혈당증 유발 훈련 면역 반응에서 RUNX1의 가능한 인과적 역할을 더 탐구하기 위해 이전에 생리학적 또는 고혈당에서 분화된 BMDM을 5mmol/L 포도당으로 복원한 다음 약리학적 RUNX의 부재 또는 존재에서 자극했습니다. 1-특정 억제제 Ro5-333551(그림 8D). 높은 포도당에서 분화된 세포는 Il-6(2-배, P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

그림 8. RUNX1 고혈당증 유발 훈련 면역의 역할. 자극되지 않은 대조군 조혈 줄기 세포(HSC)와 비교하여 트랜스포사제 액세스 가능 염색질 ​​시퀀싱(ATAC-seq) 피크 차등 농축(A) 비자극 당뇨병 HSC(n=3)에 대한 분석에서 확인된 상위 3개의 전사 인자 모티프; n{{6 }}). (B) 당뇨병(n=6) ​​또는 대조군(n=6) 골수(BM) 유래 대식세포(BMDM)의 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 분석에서 차등적으로 발현된 유전자의 감독되지 않은 계층적 클러스터링 리포폴리사카라이드(LPS)와 인터페론(IFN-)으로 자극됩니다. (C) 당뇨병(n=8) 또는 대조군(n=16) 레이저 캡처 미세해부 인간 경동맥 플라크 대식세포 샘플에서 차별적으로 발현된 유전자의 감독되지 않은 계층적 클러스터링. B 및 C, Runt 관련 전사 인자 1(Runx1) 표적 유전자(RUNX1)(P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

논의

집중적인 포도당 조절에도 불구하고 당뇨병 환자에서 높은 비율의 심혈관 합병증이 지속됩니다.52 여기에서 우리는 고혈당증이 HSC와 대식세포에서 훈련된 면역을 유도하고 이것이 죽상동맥경화증을 현저하게 악화시킨다는 증거를 제시합니다. 우리는 고혈당증이 호기성 분해 작용을 유도하여 BM HSC에서 지속적인 변형을 유도하여 분화된 대식세포로 지속되는 전 염증성 프라이밍 상태에 대한 증거와 함께 염색질 접근성의 특정 패턴을 유도한다는 것을 보여줍니다. 우리의 연구 결과는 전사 인자, 특히 RUNX1이 훈련된 면역의 매개체임을 의미합니다. RUNX1의 약리학적 억제는 체외에서 고혈당증으로 유발된 훈련된 면역의 이러한 징후를 제거했습니다.

세포 대사의 변화는 훈련된 면역을 유도할 수 있습니다. 이 용어는 산화된 LDL 및 지단백질(a)을 포함하여 미생물 제품 또는 내인성 죽상경화성 물질로 짧은 자극 후에 발달할 수 있는 타고난 면역 기억을 나타내는 용어입니다. 칸디다 알비칸스의 세포벽 성분인 는 dectin-1–Akt–mTOR–HIF-1 경로의 활성화를 통해 매개되며, 이는 산화적 인산화에서 호기성 해당작용으로의 전환을 일으킵니다(바르부르크 효과). 18 실제로 해당과정과 트리카르복실산 회로의 여러 대사산물은 히스톤 변형 효소의 보조 인자로 작용하여 염색질 접근성을 결정합니다. 예를 들어, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 및 데아세틸라제는 아세틸-CoA 및 NAD 플러스를 필요로 하는 반면, Tet 및 JmjC와 같은 데메틸라제는 -케토글루타레이트를 보조인자로 사용합니다.19,54 최근 대식세포 염증 유전자 발현의 대사 조절은 히스톤 변형과 직접적으로 연결되어 있습니다. 증가된 젖산 수치에서 파생된 아세틸화.55

당뇨병 환자의 고혈당 기억을 시사하는 관찰과 결합된 포도당 대사와 후생유전적 변형 사이의 직접적인 연관성은 고혈당 자체가 세포 대사의 변화를 유도하여 당뇨병의 선천적 면역 기억으로 이어질 수 있다는 가설을 세웠습니다. α-글루칸의 경우, 대식세포에서 증가된 호기성 해당작용은 히스톤 3 Lys4 트리메틸화(H3K4me3) 및 히스톤 3 Lys27 아세틸화(H3K27ac)를 증가시켰습니다. 이 두 가지 염색질 변형 마커는 모두 높은 포도당 유발 해당 작용의 맥락에서 증가했습니다. 여기와 이전 연구에서 입증된 바와 같이 염증(예: Il-6) 및 포도당 대사(예: Hk1)와 관련된 유전자의 프로모터에 H3K4me3이 풍부해졌습니다. fumarate는 histone과 DNA demethylases의 길항제로서 작용하는 것으로 보고되었으며,54 이와 일치하게 우리는 tricarboxylic acid cycle 대사산물인 succinate와 malate가 고혈당 세포에서 증가한다는 것을 발견했습니다.

Metropolis et al20은 골수 세포 전구체에서 α-글루칸 유도 선천 면역의 맥락에서 사이토카인이 훈련된 면역을 매개할 수 있음을 보여주었습니다. 구체적으로 수용체 길항제인 아나킨라에 의한 IL-1의 억제는 α-글루칸 유도 훈련 면역을 억제했습니다. 서양 식단은 또한 BM 전구 세포에서 후생적 재프로그래밍을 유도하여 inflammasome 매개 훈련 면역으로 이어져 훈련 면역에서 IL-1 신호 경로를 의미합니다.56 IL-1이 여러 병리학적 과정을 매개한다는 점을 감안할 때 당뇨병에서44 우리는 IL-1이 훈련된 면역 발달에서 고혈당의 효과를 증가시키는지 여부를 조사했습니다. 당뇨병 단독으로 염색질 접근성에 영향을 미쳤지만(PU.1, RUNX1 및 CCCTC 결합 인자를 포함하는 모티프 분석 포함), IL-1의 영향은 당뇨병에 의해 프라이밍된 세포의 맥락에서 훨씬 더 두드러졌습니다( ERG, ZNF263[zinc finger protein 263] 및 RUNX1과 관련됨). 이것은 대식세포가 고혈당에 의해 준비되었지만 두 번째 자극에 대한 반응으로 더 많은 변화를 나타내는 계층적 관계를 시사합니다.43 사실, 프로모터에서 염색질 상태의 변화가 서로 다른 대식세포 활성화 자극 사이의 복잡한 기능적 상호 작용의 기초가 될 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다. 예를 들어, IFN-은 많은 LPS 유도 유전자를 활성화할 수 없지만 프로모터에서 히스톤 아세틸화 및 염색질 리모델링을 유도하여 LPS에 대한 반응으로 향후 활성화를 위해 세포를 준비할 수 있습니다.57

열린 염색질 부위의 모티프 분석은 RUNX1 결합 부위의 농축을 감지했습니다. 기능적 관점에서 RUNX1은 HSC의 생성 및 유지와 다양한 계통의 분화에 필요합니다.58 단핵구 및 대식세포에서 RUNX1은 PU.1(또한 여기에 관련됨)과 협력하여 대식세포 콜로니 자극 인자(콜로니 자극 인자)를 조절합니다. -1) 수용체, 이는 대식세포의 생존, 분화 및 확장에 필수적입니다.59 단핵구 부착에서 관찰된 기능적 기억 효과와 관련하여 RUNX1은 또한 다음을 통한 단핵구-내피 상호작용의 중요한 조절자입니다. 림프구 기능 관련 항원 1/CD11a의 조절.31 마지막으로, Toll-like receptor 4 매개 염증 및 RUNX1 과발현은 Toll-like receptor 4로 유도된 IL-6 및 IL-1 생성을 핵 인자-κB 서브유닛 p50에 결합하는 RUNX1은 전사 보조활성화제로서 상승작용을 합니다.60 종합하면 대식세포에서 RUNX1 기능이 동맥경화에서 중요한 조절 과정으로 강력하게 수렴된다는 증거가 있습니다.

따라서 우리는 마우스 BMDM에서 파생된 세포의 전사 프로필과 관련 인간 생체 내 설정의 대식세포에서 RUNX1의 추정 통제하에 있는 유전자를 상호 참조했습니다. 당뇨병이 있는 인간 죽상동맥경화반 대식세포와 BMDM은 이전에 염증 및 죽상동맥경화증과 관련된 몇 가지를 포함하여 RUNX1- 조절 유전자의 DE를 보여주었습니다.49,50 우리의 작업은 최근에 시험관 내에서 6일 동안 배양된 당뇨병 유래 인간 대식세포는 염증 유발 프라이밍을 유지하고 LPS 및 IFN- 또는 종양 괴사 인자로 자극될 때 염증 유발 표현형으로 과분극됩니다.

흥미롭게도, 이러한 RUNX1 표적 유전자 중 일부는 당뇨병 환자의 플라크 대식세포, 즉 CRNKL1 및 PLA2G5에서 증가된 발현을 나타내는 반면, ZNF32(zinc finger protein 32) 및 NUP214(nucleoporin 214)와 같은 다른 유전자는 당뇨병 환자와 비당뇨병 환자에서 더 낮은 발현을 보였습니다. 플라크 대 ​​식세포. 이것은 표면적으로 일관성이 없어 보일 수 있지만 RUNX1은 유전자 발현을 촉진하고 전사 억제인자 역할을 하는 것으로 입증되었습니다.62 이것은 주로 HDAC1 및 HDAC663과 같은 히스톤 데아세틸라아제와 히스톤 메틸트랜스퍼라아제의 동원을 통해 발생합니다.62 더욱이 RUNX1의 물리적 상호작용은 염색질과 함께 세포 자손의 정체성에 기여할 수 있습니다. 예를 들어, 유사분열 동안 RUNX1 상호작용의 중단은 상피에서 중간엽으로의 전이로 이어집니다.64 Ro5-3335로 RUNX1을 약리학적으로 억제하면 시험관 내 고혈당증 유발 훈련 면역과 관련된 변경된 염증 유전자 발현이 정상화됩니다. RUNX1에 대한 표적 개입은 대식세포에서 고혈당증 유발 훈련 면역의 다운스트림 효과에 RUNX1이 관련되어 있다는 추가 증거를 제공합니다.

말초 대식세포에서 고혈당에 의해 유도된 훈련 면역의 유도만으로 질병 진행을 유도할 수 있었지만 훈련 면역의 장기적인 영향과 말초 골수 세포의 상대적으로 짧은 수명을 고려할 때 훈련 면역도 유도되었을 가능성이 있다고 추론했습니다. 최근 α-글루칸 및 서양식 식단에 대해 입증된 바와 같이 HSC 수준에서.20 이전 연구는 일반적으로 시험관 내 표현형(예: 사이토카인 생산)에 대한 훈련된 면역의 후생유전학적 변화와 관련이 있지만, 우리는 훈련된 면역이 어떻게 직접적으로 통합 염증 요소가 있는 중요한 병리학인 죽상동맥경화증의 진행을 촉진합니다. 당뇨병 쥐의 BM을 정상혈당 죽상동맥경화증이 발생하기 쉬운 쥐에 이식하면 병변 진행에 현저한 영향을 미치고 지질이 풍부한 괴사 코어 증가와 관련이 있으며 이는 사람의 당뇨병에서 볼 수 있는 공격적인 형태의 죽상경화증과 일치합니다.65

이 연구는 고혈당/고혈당증의 영향에 대한 조사를 중심으로 작성되었습니다. 당뇨병의 주요 특징인 고혈당증의 장기적인 영향을 특성화하기 위해 제2형 당뇨병 마우스 모델 대신 streptozotocin 당뇨병 마우스 모델을 사용했습니다. 포도당의 영향에 대한 연구. 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 사이에는 실질적으로 중요한 차이가 있습니다. 그러나 고혈당증은 그들의 진단에 공통적이며 각각 심혈관 위험을 유발하며 수년 동안 두 유형의 당뇨병에 대한 치료 및 모니터링의 주요 대상이었습니다. 우리는 여기에 보고된 새로 식별된 고혈당증 유발 훈련 면역이 다른 많은 잠재적 영향(예: 식이 설탕,66 포도당 상승 패턴67, 수반되는 고지혈증57)에 대한 보다 구체적인 조절을 고려하기 위해 미래에 정교화될 것으로 기대합니다.

우리의 연구 결과는 당뇨병의 죽상 동맥 경화 합병증 관리에 중요한 의미가 있습니다. 가장 중요한 것은 골수 세포와 BM 전구체의 전동맥경화 특성이 혈당 정상화 후에도 지속된다는 것입니다. 이것은 기존 치료법의 효능 부족을 설명하는 데 도움이 될 수 있으며 당뇨병의 혈관 위험 및 합병증 관리에 대한 접근 방식에 근본적으로 도전합니다. 대사 동인 및 특정 후생유전학적 변형의 식별은 또한 잠재적인 새로운 치료 목표를 권장합니다.

기사 정보

2020년 2월 27일 수신; 2021년 6월 23일에 승인되었습니다.

소속

영국 옥스포드 대학교 Radcliffe 의과 심혈관 의학부(LE, NA, ATB, JB, JTC, MA, KZ, RA, TJC, MJC, KMC, RC, RPC). 오스트리아 비엔나, 오스트리아 과학 아카데미의 분자 의학을 위한 CeMM 연구 센터(TK, AFR, CB). 스웨덴 스톡홀름의 카롤린스카 연구소(Karolinska Institutet)의 생리화학 II부, 의학 생화학 및 생물물리학부(HG-A., CEW). 호흡 의학 및 알레르기학과(HG-A., CEW) 및 의학과(H7)(JL, MR), 카롤린스카 대학 병원, 스톡홀름, 스웨덴. 영국 옥스퍼드 대학교 케네디 류마티스 연구소(ALC, TEK, IAU). 인공 지능 및 의사 결정 지원 연구소, 오스트리아 비엔나 의과 대학 의료 통계, 정보학 및 지능 시스템 센터(CB). Bioinfo, Plantagenet, ON, Canada(MEL). Radboud University Medical Centre, Nijmegen, 네덜란드 내과(NPR., MGN). 독일 본 대학교(MGN) 생명의학연구소(LIMES) 유전체학 및 면역조절학과.

감사의 말

저자는 Lisa Heather, Maria da Luz Sousa Fiahlo 및 Thomas Milne의 도움에 감사드립니다. RPC, NA 및 LE가 연구를 구상했습니다. LE는 모든 시험관 내 실험, 유전자 발현 분석 및 설명된 면역블롯팅을 수행했습니다. MA는 인간 샘플 연구에 기여했습니다. CEW 및 HG-A. 질량 분석 기반 대사체학을 수행했습니다. JTC는 인간 플라크 대식세포 LCM 작업 및 어레이 준비를 수행했습니다. LE는 JB의 지도와 MJCALC의 감독하에 Seahorse Bioanalyser 실험을 수행하고 세포 분류 분석을 수행했습니다. LE는 RNA-seq 샘플을 준비했습니다. LE는 TEK의 지침과 IAU의 감독하에 ATAC-seq 샘플을 준비했습니다. NA는 모든 ChIP 시퀀싱 세포 준비를 수행했습니다. 시퀀싱은 CB의 감독하에 TK와 AFR에 의해 수행되었습니다. MEL 및 ATB는 시퀀싱 데이터 정렬, 정규화 및 품질 관리를 실행했으며 LE는 다운스트림 분석을 수행했습니다. MEL 및 ATB는 어레이 및 시퀀싱 데이터 분석을 수행했습니다. KZ, RA, RC가 동물 조사를 주도했습니다. LE, NA, TJC, NPR 및 MGN이 실험 설계 및 실행에 참여했습니다. RPC, LE, NA 및 MEL이 원고를 준비했습니다. 모든 저자는 원고의 최종 제출을 읽고 승인했습니다.

자금 출처

이 작업은 영국 심장 재단 옥스퍼드 연구 우수 센터(RE/13/1/30181), 영국 심장 재단 프로젝트 보조금(Akbar 및 Choudhury 박사: PG/18/53/33895), 국립 보건 연구소(National Institute for Health Research)의 지원을 받았습니다. Oxford Biomedical Research Center, the Tripartite Immunometabolism Consortium–Novo Nordisk Foundation(보조금 NNF15CC0018486; Drs Choudhury, Udalova, Rydén, Channon, and Wheelock), 당뇨병 스펙트럼 질환의 대사산물 관련 염증: 포도당을 넘어선 새로운 표적(MeRIAD–Novo Nordisk Foundation) , 교부금 0064142, Drs Choudhury, Udalova, Rydén, and Channon) 및 4-년 British Heart Foundation Ph.D. 학생 및 Doris Field Trust(Dr. Edgar). Wellcome Trust Center for Human Genetics의 High-Throughput Genomics Group은 Wellcome Trust 부여 참조 090532/Z/09/Z 및 MRC Hub 부여 G0900747 91070에서 자금을 지원받았습니다. 오스트리아 비엔나에 있는 오스트리아 과학 아카데미의 분자 의학을 위한 CeMM 연구 센터의 생의학 시퀀싱 시설. Drs Riksen과 Netea는 보조금 계약 667837에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 받았습니다. Netea 박사는 ERC 통합 보조금(No. 310372) 및 네덜란드 과학 연구 기구의 지원을 받았습니다.

공개

없음.

보충 자료

데이터 보충 그림 I–XI

데이터 보충 Excel 파일 I–VII

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로렌스 에드가, DPhil*; Naveed Akbar, Ph.D.*; Adam T. Braithwaite, Ph.D.; Thomas Krausgruber 박사; Héctor Gallart-Ayala 박사; 제이드 베일리, DPhil; 알라스테어 L. 코빈, DPhil; Tariq E. Khoyratty, DPhil; Joshua T. Chai, DPhil; Mohammad Alkhalil, DPhil; André F. Rendeiro, Ph.D.; 클레멘 지베르나, DPhil; 리투 아리아, MRes; Thomas J. Cahill, DPhil; 크리스토프 복 박사; Jurga Laurencikiene 박사; Mark J. Crabtree, Ph.D.; Madeleine E. Lemieux, Ph.D.; Niels P. Riksen, MD, Ph.D.; Mihai G. Netea, MD, Ph.D.; Craig E. Wheelock, Ph.D.; Keith M. Channon, MD; Mikael Rydén, MD, Ph.D.; Irina A. Udalova, Ph.D.; 리카르도 카니서 박사; Robin P. Choudhury, DM.

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