Hyperoside는 SIRT1을 활동 Wnt/-Catenin 및 Sonic Hedgehog 경로에 대한 상향 조절을 통해 HT22 세포에서 염증을 약화시킵니다.
Mar 30, 2022
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신경염은 신경발달 변화, 감각신경성 난청, 특정 신경퇴행성 질환의 발병 및 진행에 중요한 역할을 합니다. Hyperoside(퀘르세틴{0}}O{1}}D-갈락토사이드)는 Hypericum 식물에서 분리된 활성 화합물입니다. 이 연구에서 우리는 신경 염증에 대한 과산화물의 보호 효과와 가능한 분자 메커니즘을 조사합니다. Lipopolysaccharide(LPS)와 hyperoside는 HT22 세포를 치료하는 데 사용되었습니다. 세포 생존율은 MTT assay로 측정하였다. 세포 사멸 속도는 유세포 분석법에 의해 측정되었습니다. 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL{9}})의 mRNA 발현 수준, 및 종양 괴사 인자-(TNF-a)는 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응에 의해 결정되었다. SOD(Superoxide Dismutase), ROS(Reactive Oxygen Species), CAT(CAT), glutathione(GSH), malondialdehyde(MDA)의 산화 스트레스 지수를 측정하였다. 신경영양인자의 발현과 hyperoside, 침묵교배형 정보조절 2 homolog{14}}(SIRT1) 및 Wnt/-catenin, 그리고 sonic hedgehog 간의 관계를 western blotting으로 조사하였다. LPS로 유도된 HT22 세포에서, hyperoside는 세포 생존을 촉진합니다. IL{19}}, IL{20}}, IL{21}}, TNF-, ROS, MDA, Bax 및 caspase{23}}의 수준을 완화합니다. CAT, SOD, GSH, Bcl{24}}, BDNF, TrkB 및 NGF의 발현을 증가시킵니다. 또한, hvperoside는 SIRT1의 발현을 상향조절하였다. 추가의 기계론적 조사는 하이퍼로사이드가 Wnt/-카테닌 및 소닉 고슴도치 경로를 활성화하기 위해 SIRT1을 상향 조절함으로써 LPS-유도 염증, 산화 스트레스 및 세포자멸사를 완화시키는 것으로 나타났습니다. 종합하면, 우리의 데이터는 hyperoside가 신경 염증의 보호제 역할을 한다고 제안했습니다.
1. 소개
신경염은 뇌 조직의 만성 염증으로, 신경 발달 변화, 감각신경성 난청 및 특정 신경퇴행성 질환의 발병 및 진행에 중요한 역할을 합니다[{0}}]. 중추청각경로의 초기 단계에서 소음성 난청과 전음성 난청은 신경염과 관련이 있다[6]. 또한, 신경염증은 염증유발인자와 산화스트레스의 생성을 증가시켜 신경세포의 죽음과 신경학적 악화에 기여한다[7]. 많은 연구에서 해마 뉴런이 신경염증에 민감하고 신경학적 합병증을 유발한다는 것이 밝혀졌습니다[8]. 그러나 아직까지 신경 염증으로 인한 신경 손상을 회복 및 예방하는 효과적인 약제나 방법이 없는 실정이다. 따라서 효과적인 염증 보호 후보 약제의 식별이 중요합니다.
Hyperoside(퀘르세틴3-O{1}}D-갈락토사이드)는 Hypericum 식물에서 분리된 활성 화합물입니다. 항산화 및 항염 작용을 하여 칼슘 과부하를 감소시키고 세포자멸사를 억제합니다[9, 10]. 이전 연구에서는 hyperoside가 신경 염증으로 인한 신경 합병증을 효과적으로 예방한다는 것이 확인되었습니다. 고혈당 유발 산화 스트레스 및 염증 급성 당뇨병 모델에서 hyperoside 투여는 TNF- /NF-Bx/caspase-3 신호 전달 경로를 통해 DM으로 인한 인지 기능 장애, 신경 염증 및 산화 스트레스를 예방했습니다[11]. 파킨슨병과 같은 질병에서 hyperoside는 LPS에 의해 유도된 microglia의 활성화를 약화시켜 보호제 역할을 합니다[12]. 지금까지 hyperoside가 신경염증에 미치는 보호 효과에 대한 연구는 거의 없으며 그 기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다.
지질다당류(LPS)는 선천성 면역 체계를 활성화하는 데 널리 사용됩니다. 이전 연구에서는 LPS가 일반적으로 염증 반응에 의해 유도된 신경염증 모델을 준비하는 데 사용되는 것으로 나타났습니다[13,14]. 이 연구에서 우리는 신경 염증의 세포 모델을 모방하기 위해 HT22 세포를 LPS에 노출시켰습니다. 동시에 이 모델을 통해 hyperoside가 신경염증에 미치는 보호 효과와 가능한 분자 메커니즘을 연구했습니다. 우리는 hyperoside가 LPS 유발 염증으로부터 HT22 세포를 보호한다는 것을 발견했습니다. 산화 스트레스와 세포 사멸은 SIRT1 수준과 밀접한 관련이 있습니다. 추가 분석은 hyperoside가 Wnt/-catenin 및 sonic hedgehog 경로를 활성화하기 위해 SIRT1을 상향 조절함으로써 LPS 유도 염증, 산화 스트레스 및 세포자멸사를 완화시키는 것으로 나타났습니다.
2. 재료 및 방법
2.1.시약 및 약물. LPS, hyperoside 및 3-(4,5- 브로마이드 디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨
(MTT)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지는 Gibco(Carls-bad, USA)에서 구입했습니다. 100U/ml penicillin과 100mg/ml streptomycin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. LiCl 및 소닉 고슴도치 효능제 SAg는 Merck(San Diego, CA, USA)에서 구입했습니다. Bcl-2,Bax, caspase-3,BDNF,NGF, SIRT1,Wnt1, -catenin, Shh, Patch, GAPDH에 대한 1차 항체와 2차 항체는 모두 Cell Signaling(Boston, MA, 미국). 2.2. 세포 배양 및 치료. HT22 뮤린 신경 세포주는 중국 과학 아카데미(중국 쿤밍)의 쿤밍 세포 은행에서 구입했습니다. HT22 세포를 6-웰 플레이트에 2 x 104개 세포로 시딩하고 10% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 37℃, 5% CO, 가습 부란기. HT22가 24시간 후 70% confluency에 도달하면 다른 농도의 hyperoside와 LPS(1ug/ml)로 전처리된 세포 형질감염이 수행되었습니다.
Cistanche는 면역력을 향상시킬 수 있습니다
2.3.세포 생존력. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 결정되었습니다.
간단히 말해서, HT22 세포를 2x104 cells/ml의 밀도로 24시간 동안 {{1}웰 플레이트에 접종했습니다. 세포를 밤새 기아 상태로 만든 다음 24시간 동안 다양한 농도의 hyperoside로 전처리한 다음 LPS(1ug/ml)로 24시간 동안 배양했습니다. 배지를 새로고침하고 37℃에서 4시간 동안 50ul의 MTT(인산염 완충 식염수에서 제조된 5mg/ml)와 함께 인큐베이션했습니다. 다음으로, 용액을 제거하고 DMSO를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트 판독기를 사용하여 570nm에서의 흡광도를 측정했습니다.
2.4.서부 블로팅.
RIPA 완충액을 HT22 세포(Invitrogen, USA)에 첨가하여 총 단백질을 수집하였다; 그런 다음 BCA 방법(Invitrogen, USA)을 사용하여 단백질 농도를 측정했습니다.
단백질 샘플을 5x 로딩 완충액과 혼합하고 끓일 때 변성시켰다. 단백질을 15% SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 다음으로, 막을 4Covernight에서 1차 항체(Bcl-2, Bax, caspase-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wntl, -catenin, Shh, Patch 및 GAPDH)와 함께 배양했습니다. 그 다음, 다음 날 PBS로 막을 세척하고 이차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질 밴드를 측정했습니다. 데이터는 최소 3개의 독립적인 실험에서 수집되었습니다.
2.5.qRT-PCR. HT22 세포의 총 RNA는 TRIzol RNA Extraction Kit(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 분리되었고, 분리된 total RNA는 역전사 키트(Takara, Kyoto, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사되었습니다.다음, SYBR Premix Ex Taq II(Takara, Kyoto, Japan)를 사용하여 qRT-PCR 증폭을 수행했습니다. IL-1, I{7}} 및 TNF-증폭 프라이머는 IL-1, 5'-GATGGTCGCATTAGCTCC{12}}' 및 5'-GGCTGTAGCTGTAGCGTC{15} }';IL-6,5'-ATTG CGGCGGCTGACGCGTAG-3'및 5'-GTCTGTTGCGC GAGCTGGTA-3';IL-8,5'-GTCGAGCTGCCGCGTAGCG T{{26} }'및 5'-CGGCGATGCGTGCAGC-3'; 및 TNF-a,5'-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3'및5'-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3'. mRNA의 상대적 발현은 2-Act 방법을 사용하여 분석되었습니다.
2.6.SOD, GSH 및 MDA 분석. 산소종(ROS), 카탈라제(CAT), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 글루타티온(GSH) 및 말론디알데히드(MDA) 수준 활성을 해당 분석 키트(Nanjing Jian-cheng Bio Company, 중국)를 사용하여 측정했습니다.
2.7.유세포분석.
Flow cytometry assay는 이전 보고서에 따라 세포의 세포자멸사 비율을 측정하는 데 사용되었습니다[15]. 각 그룹의 HT22 세포를 수확하고 재현탁했습니다. 아폽토시스 세포는 아넥신 V-FITC/PI 아폽토시스 검출 키트(Beyotime Biotechnology, China)를 사용하여 암실에서 실온에서 30분 동안 아넥신 V-FITC 및 PI로 이중 표지되었다. 그런 다음, 세포의 형광 강도를 유세포 분석에 의해 정량화하였다.
2.8. 통계 분석.
본 연구에서는 t-test를 이용하여 두 그룹 간의 차이를 비교하였고, 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)으로 분석하였다. 모든 데이터는 평균값±으로 나타내었다.
그림 1:Hyperoside는 LPS로 유도된 HT22 세포에서 세포자살과 염증을 완화했습니다. HT22 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 측정되었습니다. 세포 생존율은 현미경(100x)(a, b)으로 관찰했습니다. HT22 세포에서 Bcl-2, Bax 및 caspase-3의 발현을 웨스턴 블롯팅(c)으로 측정하였다. HT22 세포 사멸 속도는 유세포 분석법(d)으로 측정하였다. IL-1 ,IL{10}} 수준입니다. HT22 세포의 IL{11}} 및 TNF-mRNA는 art-PCR(e)에 의해 측정되었습니다.*는 대조군(*P<0.05);# was="" considered="" significant="" compared="" to="" lps="" ("p=""><>
이 기사는 Hindawi Neural Plasticity Volume 2021, Article ID 8706400, 10페이지 https://doi.org/10.1155/2021/8706400에서 발췌한 것입니다.
