일과성 전뇌 허혈 후 옥스카르바제핀에 의해 유발된 저체온증은 게르빌의 일과성 수용체 전위 바닐로이드 유형 1 및 4를 통해 치료적 신경 보호를 발휘합니다. 3
Jul 26, 2024
4. 재료 및 방법
4.1. 실험동물
수컷 저빌(총수=252)은 6개월령(체중, 63~78g)에 사용되었습니다. 저빌은 강원대학교 실험동물센터(한국 춘천)에서 사육되었습니다.
저빌은 매우 귀여운 작은 동물입니다. 그들은 사막 지역에 살고 있으며, 동굴을 파는 데 능숙하며, 음식을 저장하고 찾는 데 강한 본능을 가지고 있습니다. 이 작은 녀석들 중에서 수컷 저빌은 특히 기억력이 좋아서 사람들이 그들의 비밀을 알고 싶어하게 만듭니다.
첫째, 수컷 저빌은 먹이를 찾을 때 랜드마크나 지형과 같은 일련의 신호를 사용하여 방향을 결정합니다. 오랜 관찰과 실천을 통해 그들만의 '지리정보 시스템'을 구축했습니다. 대조적으로, 암컷 저빌은 특히 끊임없이 변화하는 환경에서 이러한 신호에 대한 기억력이 더 나쁩니다.
둘째, 수컷 저빌 역시 천적과 싸울 때 강한 기억력을 보인다. 과학자들에 따르면, 저빌은 위협을 받으면 재빨리 굴 속으로 들어가 탈출을 시도합니다. 그러나 같은 위협에 직면하면 수컷 저빌은 천적의 공격 모드를 기억하고 피함으로써 생존 가능성을 높입니다.
마지막으로, 수컷 저빌의 기억은 서로간의 사회적 행동에도 있습니다. 각 저빌에는 독특한 냄새가 있습니다. 다른 저빌을 만나면 후각을 이용해 서로의 신원과 지위를 파악하게 됩니다. 이러한 기억 능력은 저빌이 상대적으로 안정적인 사회적 관계를 구축할 수 있게 할 뿐만 아니라 번식을 위한 중요한 보장이기도 합니다.
요약하면, 수컷 저빌과 기억의 관계는 뗄래야 뗄 수 없는 관계입니다. 자연 속에서 생존과 번식을 추구하는 과정에서 강한 기억력을 바탕으로 끊임없이 환경에 적응하고 자신을 향상시킨다. 인간으로서 우리는 끊임없이 변화하는 세상에 더 잘 적응하기 위해 이 작은 사람들로부터 배우고 끊임없이 기억력을 연마해야 합니다. 기억력 향상이 필요하다는 것을 알 수 있는데, 시스탄체는 기억력과 학습에 매우 중요한 아세틸콜린과 성장인자의 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 또한 Cistanche는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌가 충분한 영양과 에너지를 얻을 수 있도록 하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
본 연구를 위해 실험 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회로부터 승인되었습니다(승인 번호 KW-200113-1; 승인 날짜, 2020년 2월 18일).
연구 프로토콜은 The National Academies Press(8th Ed., 2011)에서 발행한 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침의 "현행 국제법 및 정책"에 제안된 지침을 준수했습니다.
4.2. 실험 그룹, tFI 유도, HyT 및 OXC 처리
저빌의 tFI에 따른 허혈성 손상에 대한 OXC의 보호 효과를 입증하기 위해 저빌을 6개 그룹으로 나누었습니다: (1) sham+vehicle 그룹(n=24);(2) tFI+vehicle 그룹(n {{5 }}); (3) sham+HyT 그룹(n= 24); (4) tFI+HyT 그룹(n=60);(5) sham+OXC(200 mg/kg) 그룹(n=24); 및 (6) tFI+OXC 그룹(n= 60).
tFI 수술 후 30분, 12시간, 1일, 2일, 4일에 각각 3개의 tFI 그룹에서 7마리와 5마리의 저빌을 웨스턴 블롯 분석과 조직학적 검사에 사용하였고, 3개의 sham 그룹에서는 7마리와 5마리를 사용했습니다. 저빌은 숫자를 최소화하기 위해 가짜 수술 후 30분과 4일에 사용되었습니다. 이 실험에서 tFI는 이전에 설명한 대로 개발되었습니다[34].
즉, 테게르빌은 2.5% 이소플루란(산소 32% 및 아산화질소 68%)으로 마취되었습니다. 마취 상태에서 두 개의 총경동맥을 경동맥 외피에서 분리하고 동맥류 클립(Yasargil FE 723K)으로 막았습니다(Aesculap, Tuttlingen, Germany). ) 5분 동안.
Heine Optotechnik(독일 Herrsching)의 검안경(HEINE K180®)을 이용하여 양쪽 망막동맥(내경동맥의 가지)의 동맥혈류를 관찰함으로써 뇌로의 혈액공급이 완벽하게 중단되었음을 확인하였다.
수술 전과 수술 중 체온은 체온 측정 담요를 이용하여 정상체온(37 ± 0.2 оC)으로 조절하였다. 5분 동안 폐쇄한 후 클립을 제거했습니다.
본 연구에서는 총경동맥을 폐색하지 않고 동일한 tFI 수술을 시행하여 가짜 수술을 실시했습니다. 두 sham+HyT 그룹과 tFI+HyT 그룹의 HyT는 조절되었습니다(tFI+ 그룹의 체온 변화와 유사). OXC 그룹) 얼음팩으로 6시간 동안 전신 냉각을 실시합니다.
tFI 수술 후 200mg/kg OXC(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 즉시 복강내 주사한 후 6시간 동안 sham+OXC 및 tFI+OXC 그룹의 체온을 기록했습니다.
OXC의 복용량은 200 mg/kg OXC가 뇌의 세포 사멸을 효과적으로 예방했다고 보고한 이전 연구를 기반으로 선택되었습니다. 체온 변화를 기록하기 위해 tFI 후 1시간마다 직장에서 체온을 측정했습니다. 주변 실온(약 22°C)에서 6시간 동안.
저빌은 tFI 후 4일의 회복 시간을 받았는데, 이는 해마 CA1 영역에 위치한 피라미드 세포가 tFI 후 4일부터 죽기 시작하기 때문입니다[30,34,62].
4.3. SMA 테스트
SMA 테스트는 모든 그룹의 과잉 행동 변화를 조사하기 위해 수행되었습니다. 간단히 말해서, 이전에 설명한 대로 [63], 운동 활성은 tFI 이후 허혈성 손상 후 1일차에 가장 높은 지점에 도달하므로 tFI 이후 1일차에 SMA 테스트를 수행했습니다.
모든 그룹의 저빌소는 2시간 동안 환경적응을 받았고, Ugo Basile SRL(Gemonio, Italy)에서 구입한 개방형 케이지(너비, 44cm, 길이, 44cm, 높이, 30)에 두 개의 평행한 수평으로 배치되었습니다. 바닥에 4×8 적외선 빔을 1시간 동안 설치했습니다. SMA는 San Diego Instruments(San Diego, CA, USA)의 Photobeam Activity System-Home Cage를 사용하여 기록되었습니다.
이동(궤적 및 총 이동 거리)은 광전지에서 생성된 적외선 광선 배열의 중단을 통해 감지되었습니다.
SMA는 1시간 동안 지속적으로 모니터링되었으며 데이터는 IPC Electronics(Cumbria, UK)의 AMB 분석기를 사용하여 수집되었습니다.
데이터 수집은 오픈 필드 케이지에서의 습관화 후 15분 후에 시작되었습니다. 마지막으로 얻은 결과를 테스트 기간(1시간) 동안의 이동 거리(미터)로 평가하였다.
4.4. 인지 기능 테스트
4.4.1. RAMT
모든 그룹의 공간 기억을 비교하기 위해 선행 연구에 따라 RAMT를 수행했습니다 [38,44]. 이 테스트에는 Stoelting Co(미국 일리노이주 우드 데일)의 방사형 8-암 미로가 사용되었습니다.
미로 장비는 중앙 플랫폼과 8개의 팔(각 팔 너비 5cm, 높이 9cm, 길이 35cm)로 구성되었습니다. 저빌은 하루에 한 번씩 3일 동안 훈련을 받았습니다.
즉, DBL사(한국 충북)에서 구입한 펠렛 사료를 각 암의 끝 부분에 놓고, 각 저빌을 중앙 플랫폼에 올려놓은 후, 저빌이 사료를 찾아다녔다.
가짜 또는 tFI 수술 후 실제 테스트는 수술 다음날부터 4일 동안 하루에 한 번씩 실시되었습니다.
분석을 위해 이전에 이미 방문했던 팔에 저빌이 들어갈 때마다 1개의 오류가 발생하는 오류 수를 평가했습니다. 저빌이 사료를 섭취했을 때 테스트가 종료되었습니다.
4.4.2. 가볍게 두드리기
그룹 간 단기 기억을 비교하기 위해 이전에 보고된 방법[64,65]에 약간의 수정을 가하여 PAT를 수행했습니다. 간단히 말해서, 수직 슬라이딩 게이트를 통해 서로 통신하는 두 개의(어두운 부분과 밝은 부분) 구획으로 구성된 San Diego Instruments(미국 캘리포니아주 샌디에고)의 Gemini 회피 시스템(GEM 392)을 사용하여 저빌을 테스트했습니다.
실험 세션은 훈련 세션과 tFI 또는 가짜 수술 하루 전과 4일 후에 수행된 실제 테스트 세션의 두 단계로 수행되었습니다.
실제 테스트는 훈련 20분 후 암실에 머무는 동안의 지연 시간(초)을 측정하여 수행하였다. 즉, 훈련 세션에서 게르빌은 게이트가 열려 있는 동안 1분간 두 개의 구획을 자유롭게 탐색할 수 있었다. .
이후 저빌이 어두운 칸으로 들어갈 때 문을 닫고 바닥에 있는 철망에서 저빌에게 5초 동안 전기 발 충격(0.5 mA)을 가했습니다.
실제 테스트 세션에서는 tFI 이후 4일차에 저빌을 밝은 구역에 배치하고 어두운 구역에 들어가기 전 밝은 구역의 대기 시간을 기록했습니다.
4.5. TRPV1 및 TRPV4에 대한 웨스턴 블롯 분석
gerbil hippocampal CA1에서 TRPV1과 TRPV4의 발현 수준을 조사하기 위해 이전에 설명한 방법에 따라 Western blot 기술을 수행했습니다 [66,67].
간략히 설명하면, 지정된 일정(sham 또는 tFI 수술 후 30분, 12시간, 1일, 2일, 4일)에 따라 저빌(각 그룹당 n= 5)에게 펜토바르비탈나트륨 200 mg/kg (JW Pharm.Co., Ltd., 서울, 한국).
그 후, 이들의 뇌를 수확하고 0.1 mM 에틸렌 글리콜-비스(아미노에틸 에테르)-N, N, N{{을 함유하는 50 mM 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 균질화했습니다. 11}}, N0-테트라아세트산(EGTA)(pH 8.0), 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(pH 8.0), 0.2% Nonidet P{{17 }}, 15mM 피로인산나트륨, 100mM -글리세로포스페이트, 2mM 오르토바나데이트나트륨, 50mM NaF, 150mM NaCl, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 및 1mM 디티오트레이톨(DTT).
다음으로, 샘플을 원심분리하고, Thermo Fisher Scientific Inc(Waltham, MA, USA)의 Micro BCA 분석 키트와 Pierce Chemical Co(Rockford, IL, USA)의 소 알부민을 사용하여 상청액을 채취하여 단백질 수준을 측정했습니다.
총 단백질 20μg을 포함하는 분취량을 6% 나트륨도데실황산염(SDS), 3 mM DTT, 0.3% 브로모페놀 블루 및 30% 글리세롤을 함유한 로딩 완충액, 150 mM Tris(pH 6.8)에 끓였습니다.
샘플은 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 통해 분리되었습니다. 다음으로, 겔을 Pall Co(East Hills, NY, USA)의 니트로셀룰로오스 막으로 350mA 및 4℃에서 90분 동안 옮겼습니다.
비특이적 염색을 차단하기 위해 막을 실온에서 60분 동안 5% 탈지 우유에서 배양했습니다. 그 후, 토끼 항-TRPV1(1:1000 희석)(Abcam, Cambridge,UK), 토끼 항-TRPV4(1:1000 희석)(Abcam) 및 토끼 항{11}} 액틴(1:2000 희석)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 4°C에서 7시간 동안.
그 후, HRP(horseradish peroxidase) 결합 당나귀 항토끼 IgG(1:4500 희석)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
마지막으로 시각화를 향상시키기 위해 Thermo Fisher Scientific Inc(Waltham, MA, USA)의 알루미놀 기반 화학발광 키트를 사용했습니다.
이전에 설명한 대로[68], TRPV1 및 TRPV4의 면역블롯은 Scion Crop(Frederick, MD, USA)의 Scion Image 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 밴드를 스캔하고 농도계 분석을 수행했습니다. 단백질 수준은 해당 수준의 α-액틴에 대해 표준화되었습니다.
4.6. 조직학적 섹션의 준비
면역조직화학 및 조직병리학적 검사를 위해 지정된 일정(tFI 또는 가짜 수술 후 30분, 12시간, 1일, 2일, 4일)에 따라 저빌(각 그룹에 대해 n{0}})을 희생시켰습니다.
앞서 기술한 바와 같이[34], 저빌을 펜토바르비탈 나트륨(200 mg/kg)(JW 제약, 서울, 한국)으로 심도있게 마취시켰다. 마취 하에 저빌을 0.1M 인산염 완충 식염수(pH 7.4)로 경심으로 헹구고 4% 파라포름알데히드(0.1M 인산염 완충액, pH 7.4)로 고정했습니다.
그 후, 이들의 뇌를 확보하고 동일한 고정액을 사용하여 6시간 동안 후고정하였다. 그 후, 뇌 조직을 acryostat(Leica, Wetzlar, Germany)에서 절단했습니다(관상면 두께 25μm).
4.7. CV를 이용한 조직화학적 염색
각 그룹의 해마의 형태학적 및 신경 손상을 조사하기 위해 이전에 설명한 대로 크레실 바이올렛(CV) 염색을 수행했습니다[69]. 요약하면, 크레실 바이올렛 아세테이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 증류수에 1.0%(w/v)로 용해시키고 빙초산(0.28 %)를 이 용액에 첨가했습니다. 섹션을 캐나다 발삼(일본 도쿄 간토 소재)으로 염색하고 장착했습니다.
4.8. FJ B 염색
FJ B 염색을 수행하여 신경 변성(사망 또는 손실)을 검사했습니다. 공개된 절차[34]에 따르면 준비된 뇌 절편을 1% 수산화나트륨에 담그고 즉시 0.06% 과망간산칼륨으로 옮겼으며 0.0004% Fluoro-Jade B(Histochem)와 즉시 반응했습니다. , 제퍼슨, 아칸소, 미국).
절편을 간단히 세척한 후 FJ B와의 반응을 위해 슬라이드 워머(약 50°C) 위에 올려 놓았습니다. tFI에 대한 OXC의 치료 효과를 평가하기 위해 문헌에 발표된 방법에 따라 CA1 영역에서 FJ B+ 세포의 수를 계산했습니다. 70].
간략하게, FJ B+ 세포의 디지털 이미지는 450-490 nm 파장에서 표면형광 현미경(Carl Zeiss)(독일 Oberkochen)을 사용하여 게르빌당 5개의 섹션에서 캡처되었습니다. 세포는 이미지 분석 시스템(Optimas 6.5)(CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA)을 사용하여 CA1 영역의 중심에서 SP를 포함하는 250 μm2로 계수되었습니다.
4.9. 면역조직화학
CA1 영역의 NeuN, TRPV1 및 TRPV4 면역반응성의 변화를 조사하기 위해 일반 면역조직화학을 수행하였다. 간단히 말하면, 공개된 방법에 따라 준비된 뇌 절편을 1차 항체인 마우스 항-NeuN(희석, 1:100)(Chemicon, Temecula, CA, USA), 마우스 항-TRPV1(희석, 1:100)과 함께 배양했습니다. 1:500)(Abcam, Cambridge, UK) 및 토끼 항-TRPV4(희석, 1:500)(Abcam, Cambridge, UK).
그 후, 이러한 배양된 절편을 해당 2차 항체(희석, 1:250)(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)에서 배양하고 Vectastain ABC(희석, 1:250)(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)를 사용하여 개발했습니다. , 미국). 마지막으로, 이러한 면역반응 섹션은 3,3'-디아미노벤지딘으로 시각화한 후 색상을 나타냈습니다.
NeuN+ 세포의 수는 다음과 같이 계산되었습니다. NeuN+ 세포의 디지털 이미지는 광학 현미경(AxioM1)(Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 게르빌당 5개 섹션에서 캡처되었습니다.
세포수는 FJ B+세포수와 동일한 방법으로 계수하였다. TRPV1+ 및 TRPV4+ 구조의 밀도를 평가하기 위해 CA1 영역의 해당 영역을 동물당 5개 섹션으로 사용했습니다. TRPV1+ 및 TRPV4+ 구조의 이미지는 AxioM1 광학 현미경(Carl Zeiss)(독일)을 사용하여 캡처되었습니다.
TRPV{{0}} 및 TRPV4+ 구조의 밀도는 상대광학밀도(ROD)로 평가되었습니다. 이를 위해 이미지는 평균 회색 수준으로 변환되었습니다. ROD는 Adobe Photoshop(버전 8.0) 및 NIH Image J 소프트웨어(NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 백분율로 표시되었습니다.
4.10. 통계분석
우리는 데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 제시했습니다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism(버전 5.0)(GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 실험군 간 평균의 차이는 모든 군 간의 tFI 관련 차이를 밝히기 위해 사후 Bonferroni 다중 비교 검정을 통한 양방향 분산 분석(ANOVA)을 통해 통계적으로 분석되었습니다. 통계적 유의성은 p < 0에서 고려되었습니다. 05.
저자 기여: 개념화: M.-HW 및 T.-KL; 방법론, J.-CL 및 DWK; 소프트웨어, H.-IK 및 MCS; 검증, JHA, IJK 및 JHP; 조사, J.-CL, H.-IK 및 M.CS; 데이터 큐레이션, JHC, IJK 및 JHP; 글쓰기-원본 초안 준비, H.-IK 및 J.-CL; 집필-검토 및 편집, M.-HW; 감독, S.-SL; 프로젝트 관리, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL 및 T.-KL 모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 동의했습니다.
연구비: 이 연구는 한국연구재단(NRF)이 지원하는 뇌한국21(BK21) 연구우수대학(FOUR, 4220200913807)과 한국연구재단(NRF) 기초과학연구사업의 지원을 받아 수행되었습니다. 교육부(NRF-2020R1I1A1A01070897)의 자금 지원을 받습니다.
기관검토위원회 성명서: 저빌은 강원대학교 실험동물센터(한국 춘천)에서 사육되었습니다. 본 연구를 위해 실험 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회로부터 승인되었습니다(승인 번호, KW-200113-1; 승인 날짜, 2020년 2월 18일).
연구 프로토콜은 The National Academies Press(8th Ed., 2011)에서 발행한 실험실 동물의 관리 및 사용 지침의 "현재 국제 법률 및 정책"에 제시된 지침을 준수했습니다.
사전 동의서: 해당 사항 없음.
데이터 가용성 설명: 이 연구에 제시된 데이터는 해당 저자의 요청에 따라 제공됩니다.
감사의 말: 저자들은 본 연구에 기술적인 도움을 준 김현숙과 이승욱에게 감사드립니다.
이해 상충: 저자는 재정적 이해 상충이 없다고 선언했습니다.
약어
CA1: 하위필드 Cornu Ammonis 1; CNS, 중추신경계; CV, 크레실 바이올렛; DG, 치아이랑; FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, 저체온증; NeuN, 신경핵; OXC, 옥스카르바제핀; PAT, 수동회피 테스트; ROD, 상대 광학 밀도; SMA, 자발적인 운동 활동; SO, 지층 오리엔스; SP, 지층 피라미드; SR, 방사층; tFI, 일시적 전뇌 허혈; TRPV1, 일시적 수용체 전위 바닐로이드 유형 1.
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For more information:1950477648nn@gmail.com
