일시적 수용체 잠재적인 바닐로이드 4 의존성 동맥경화 과정의 새로운 억제제로서의 비파본의 식별 및 기능 분석

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Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. 레이 & 샤이크 O. 라하만

큰 동맥의 진행성 염증성 질환인 죽상동맥경화증은 전 세계적으로 심혈관 질환 관련 사망률 및 이환율 증가에 가장 큰 기여를 하고 있습니다1. 죽상동맥경화증을 유발하는 중추적인 개시 사건은 주로 동맥 분기점에서 내피하 대동맥 내막 공간에 변형된 저밀도 지단백질(oxLDL) 입자의 보유를 포함합니다2. 초기 죽상 형성 동안 내피 기능 장애에 이어 순환하는 혈액 단핵구가 내막 영역으로 이동하고 조직 대식세포로 분화됩니다. 대동맥 내막 공간에서 SRA 및 CD36과 같은 스캐빈저 수용체의 도움을 받는 대식세포에 의한 oxLDL의 결합 및 흡수는 피드포워드 죽상 염증 루프를 생성하여 죽상 경화증의 중요한 과정인 지질 함유 거품 세포의 발달을 초래합니다. 거품 세포에 의해 유발된 일련의 염증 반응은 초기 지방 줄무늬를 형성하고 결국 섬유질 캡, 석회화된 조직, 면역 세포, 기질 단백질 및 지질의 존재를 특징으로 하는 진행성 죽상동맥경화증 병변의 출현으로 이어집니다2-10. TRPV 서브패밀리의 일과성 수용체 전위 Vanilloid 4(TRPV4)는 Ca2+에 투과성인 비선택적 다봉 양이온 채널이며 대식세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 편재적으로 발현됩니다. 이전에 삼투 센서로 알려진 TRPV4는 이제 열, 매트릭스 강성, 삼투압 농도, 성장 인자, pH 및 4 포르볼 에스테르11-24를 포함한 다양한 생화학적 및 생역학적 자극에 반응하는 것으로 알려져 있습니다. TRPV4는 염증 및 신경병증18,22,23, 근섬유아세포 분화 및 이동17,25,26, 뼈의 파골세포 분화27와 같은 여러 생리학적 기능을 매개하는 것으로 보고되었습니다. TRPV4 돌연변이는 여러 채널 병증과 관련이 있습니다28-31. 우리 그룹과 다른 사람들의 최근 연구는 폐 손상22,32, 거품 세포 형성14,16, 조직 섬유증17,33, 이물질 반응13 및 암34,35과 같은 무수한 병리학적 상태에서 이 채널의 가능한 역할을 암시했습니다. 이전에 TRPV4의 죽상 보호 역할은 내피 세포에서 화학적 작용제에 의해 유도된 TRPV4 기능이 eNOS의 활성화 및 내피 세포에 대한 단핵구 부착 억제와 관련된 것으로 나타났습니다. 대조적으로, TRPV4 기능의 결핍은 내피 기능 장애, 감소된 대식세포 거품 세포 생성 및 혈관 질환을 포함한 수많은 죽상 염증 반응과 관련이 있습니다. 우리 연구실은 최근에 oxLDL 유도 대식세포 거품 세포 형성을 조절하는 TRPV4의 죽상경화성 역할을 확인했습니다. 기계적으로, 우리는 TRPV4가 CD 독립적인 방식으로 대식세포의 oxLDL 결합이 아니라 흡수에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다.{55}} 또 다른 연구에서 우리는 지질다당류가 있는 상태에서 oxLDL 유도 거품 세포 형성의 TRPV{57}}의존적 악화와 기질 강성의 증가를 보고하여 기계 감지와 죽상경화증의 위험 사이의 연관성을 제공했습니다16. 종합하면, 이러한 발견은 TRPV4가 죽상동맥경화증 및 기타 질병에서 매력적인 표적임을 시사하며, 따라서 임상적으로 효과적인 치료제로 번역될 수 있는 TRPV4의 소분자 억제제의 발견을 장려합니다. 치료제에서 천연 화합물의 사용은 현재 존재하는 합성 약물과 비교하여 비용 효율적이고 생체 적합성 화합물에 대한 필요성에 의해 주로 추진되어 주목을 받았습니다. 다음과 같은 천연 화합물플라보노이드, 알칼로이드,폴리페놀, 및 curcuminoids는 억제와 같은 다양한 메커니즘을 통해 심혈관 질환에 영향을 미칩니다.염증 유발신호, 인슐린 감작 및 AMPK, COX1/2, eNOS 및 Nrf2 경로를 표적으로 하여 혈액 지질 프로필을 개선합니다. 여러 그룹에 의한 최근 연구에서 TRPV4 활성의 잠재적인 조절제로 두 가지 플라보노이드인 베르베린과 아피게닌이 확인되었습니다46,47. 우리는 FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader) 기반 Ca2 플러스 유입 분석을 사용하여 천연 화합물 라이브러리에서 TRPV4의 잠재적 길항제를 식별하기 위해 반고처리량 스크리닝 방법을 개발하고 사용했습니다. 여기에서 우리는 플라본인 Linkedin이 대식세포에서 TRPV{12}}의존성 죽상형성 과정의 새로운 억제제임을 보고하고 이에 따라 이 천연 화합물에 대한 추가 연구의 토대를 마련했습니다. 분자 화합물. Linkedin은 신경보호를 나타내는 것으로 보고되었으며,항암제, 그리고항염증역할48,49. 우리는 수많은 생화학 및 세포 분석을 사용하여 대식세포 거품 세포 형성 설정에서 TRPV4에 대한 Linkedin의 작용 메커니즘을 보고합니다.

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재료 및 방법 동물 및 세포 배양

우리는 Charles River Laboratories(Wilmington, Massachusetts, USA)에서 유전형 C57BL/6 야생형(WT) 마우스를 구입했습니다. 모든 동물 실험에 대해 메릴랜드 대학교 동물 관리 및 사용 위원회 지침을 따랐으며 저자는 ARRIVE 지침을 준수했습니다. 티오글리콜레이트로 유도된 쥐 상주 대식세포(MRM)의 분리를 위해, 티오글리콜산을 복강 내 주사한 후 4일 후에 복막 세척액을 수집하고 DMEM7,14,16을 함유하는 10% 소 태아 혈청(FBS)에서 세포를 유지했습니다. 쥐 대식세포 세포주(RAW264.7) 및 인간 진피 섬유아세포(HDF)를 ATCC(Manassas, VA)에서 구입하고 각각 DMEM 또는 MEM(Gibco, Waltham, MA)과 함께 배양하였다. 뮤린 골수 유래 대식세포(BMDM)는 이전에 설명된 대로 6-에서 7-주 된 마우스까지 수확되었습니다14,50,51. 간단히 말해서, WT 및 TRPV4 KO 마우스로부터 대퇴골을 수집하고, 대퇴골의 골수를 10% FBS가 포함된 완전한 DMEM 배지로 씻어내었다. 현탁된 골수 세포를 70μm 스트레이너(BD bioscience)를 통해 여과하고, 원심분리하고, M-CSF(25ng/mL)가 보충된 DMEM 배지에서 37도에서 7-8일 동안 유지하여 대식세포로 분화할 수 있도록 하였다.

시약

Linkedin 및 GSK1016790A(GSK101)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했으며 FLIPR Calcium 6 분석 키트는 Molecular Device(Sunnyvale, CA)에서 구입했습니다. 인간 고유 LDL(VLDL)은 Stemcell Technologies(캐나다 밴쿠버)에서 구입했습니다. 우리는 구리 산화 LDL(oxLDL)7,14,16을 준비하기 위해 37도에서 12시간 동안 5 μM CuSO4와 함께 LDL을 배양했습니다. 형광 염료 라벨이 붙은 DiI-oxLDL은 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서, MCSF는 R&D(Minneapolis, MN)에서 구입했습니다. FACS 분석을 위한 항체는 TRPV4(Millipore, Burlington, MA), CD36(R&D, Minneapolis, MN), TLR4 및 TLR6(Novus Biologicals, Centennial, CO)이었습니다. PE-결합 이차 항체는 R&D(미네소타주 미니애폴리스)에서, PE-결합 이소타입 대조군은 BD(Franklin Lake, NJ)에서 가져왔습니다. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 위해 QIAGEN(Redwood City, CA)의 RNeasy 키트를 사용했습니다. 모든 프라이머는 Bio-Rad(Hercules, CA)에서 구입했습니다. 세포 배양 배지, 세포 배양 관련 제품 및 웨스턴 블롯 시약은 Thermo Fischer Scientific(Waltham, MA)에서 구입했습니다.

피로 방지용 Cistanche

준고처리량 스크리닝

우리는 형광 이미징 플레이트 리더(FLIPR) 기반 칼슘 유입 분석14,17을 사용하여 2000가지 천연 화합물 라이브러리(MSSP{3}}, Johns Hopkins Chemcore)에서 Trpv4의 길항제에 대한 반고처리량 스크리닝을 수행했습니다. 우리는 TRPV4에 대한 새로운 길항제로서 ginkgetin(GGT)을 확인했습니다. RAW264.7, HDF, BMDM으로 1차 및 2차 스크리닝을 수행하여 Linkedin 및 기타 후보가 TRPV 유도 Ca2와 infux14,17을 억제하는 능력을 평가했습니다. 대조군으로 칼슘 이온 전달 물질인 A23187, TRPV4 null BMDM 및 선택적 TRPV4 길항제인 GSK219를 사용했습니다. 2차 스크리닝 후, 우리는 비히클 대조군과 비교하여 TRPV 매개 Ca2와 유입을 3배 이상 억제하는 6가지 화합물을 확인했습니다. Linkedin은 TRPV4 활성의 가장 강력한 억제제로 확인되었습니다. BMDM(5×104개 세포/웰)을 콜라겐 코팅(10μg/ml) 96-웰 투명 바닥 블랙 플레이트에 접종하고 37도, 5% CO2에서 배양했습니다. 실험 당일 세포에 칼슘 6 염료 HBSS, 20mM HEPES, 2.5mM 프로베네시드를 로딩하고 37도에서 45분간 배양하였다. 인큐베이션 후 라이브러리 화합물을 최종 농도가 2μM이 되도록 각 웰에 첨가했습니다. 플레이트를 37도에서 추가로 45분 동안 인큐베이션했습니다. Ca2 플러스 유입은 비히클 또는 화합물 전처리된 세포에 10nM의 TRPV4 작용제 GSK1016790A를 첨가하여 유도되었고 이전에 설명한 대로 ΔF/F(최대-최소)를 측정하여 기록되었습니다. 데이터는 상대 형광 단위(RFU)로 표시됩니다.

면역블롯

티오글리콜레이트-유도된 복막 대식세포를 DMEM을 함유하는 10% FBS에 접종하고 밤새 배양하였다. 부착되지 않은 세포를 세척하고 DMEM을 함유하는 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 플레이트에 첨가하고 Linkedin 처리 전에 3시간 동안 인큐베이션하였다. CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 및 GAPDH 단백질의 발현을 결정하기 위해 Linkedin(1 및 5μM) 또는 oxLDL(25μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 비히클을 밤새 처리한 세포로부터 전체 세포 용해물을 제조했습니다. ). LPS로 유발된 p-JNK 및 JNK의 발현 수준을 결정하기 위해 세포를 Linkedin(5 및 10μM)으로 3시간 동안 전처리한 다음 E. coli LPS로 30분 동안 자극했습니다. 전체 세포 용해물은 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, MA)이 첨가된 RIPA 완충액을 사용하여 2회 세척된 세포(얼음 PBS)로부터 제조되었습니다. 블롯은 토끼 항-TRPV4(Alomone Lab, 예루살렘, 이스라엘), 항-마우스 CD36(R&D, 미네소타주 미니애폴리스), 토끼 항-TLR4, 토끼 항-TLR6, 토끼 항-JNK 및 토끼 항-p- JNK 1차 항체(Cell Signaling, Danvers, MA)에 이어 항-토끼 및 항-마우스 HRP-접합 2차 항체(R&D, Minneapolis, MN). 블롯을 제거하고 로딩 제어를 위해 항-GAPDH IgG(1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX)로 다시 조사했습니다.

거품 세포 형성.티오글리콜레이트로 유발된 MRM을 DMEM, 10% FBS가 포함된 12웰 플레이트의 유리 커버슬립에 접종하고 37도, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 세포에 GGT(1 또는 10μM)를 첨가하고 3시간 배양 후 oxLDL(50μg/ml)을 첨가하고 37도에서 밤새 배양하였다. 천연 LDL(50 ug/ml)을 대조군 웰에 첨가하고 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정한 후 Oil Red O 염색으로 거품 세포 생성을 정량화했습니다.

아데노바이러스 벡터 형질도입.Ad(RGD)-마우스 TRPV4(Ade-TRPV4; ~1010pfu/ml) 및 아데노바이러스 블랭크 벡터인 Ad(RGD)-CMV-null(Ade-Vec; 1011pfu/ml)을 발현하는 아데노바이러스 구조를 수집했습니다. 벡터 Biolabs, Malvern, PA. 모든 실험에 1×108 pfu/ml를 사용했습니다. 거품 세포 생성 연구를 위해 마우스 복막 대식세포를 DMEM 배지에서 Ade-TRPV4 또는 Ade-Vec과 함께 72시간 동안 배양한 후 대식세포 거품 세포를 생성했습니다.

ox-LDL의 결합 및 흡수.결합을 평가하기 위해 복막 대식세포를 Linkedin 또는 비히클 2회 용량(1 또는 10μM)으로 3시간 동안 처리하고 DiI-oxLDL과 함께 4도에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. Linkedin 또는 비히클로 전처리한 후 세포를 DiI-oxLDL과 함께 37도에서 30분 동안 배양하여 흡수를 평가했습니다. 이미지는 형광 현미경(63x)으로 캡처되었으며 이미지 J는 결과를 정량화하는 데 사용되었습니다.

유세포 분석.티오글리콜레이트로 유도된 복막 대식세포를 DMEM, 10% FBS에서 24시간 동안 배양했습니다. 부착되지 않은 세포를 씻어내고, 무혈청 배지를 첨가하고, 세포를 2시간 동안 배양한 후 5μM GGT 또는 비히클을 첨가하고, 배양을 3시간 동안 계속하였다. 처리된 세포를 플레이트에서 긁어내고 PBS, 2% BSA에 재현탁시켰다. 세포를 45분 동안 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후 PE-접합된 2차 항체와 30분 동안 인큐베이션했습니다. FACSCantoII 유세포 분석기(BD Bioscience, Ontario, Canada)를 사용하여 데이터를 수집했습니다. 모든 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 처리되었습니다.

qRT-PCR.티오글리콜레이트로 유도된 대식세포를 3시간 동안 5μM Linkedin 또는 비히클로 처리했습니다. 비히클 또는 Linkedin 처리된 세포에 25 μg/ml의 oxLDL을 첨가하고 밤새 배양을 계속하였다. QIAGEN의 RNeasy Micro Kit(#74,004)를 사용하여 total RNA를 추출하고 Bio-Rad의 Universal SYBR Green One-Step Kit를 사용하여 RNA를 역전사했습니다. C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad)를 사용하여 데이터를 수집했습니다. 유전자 발현은 Bio-Rad qRT-PCR 시스템 사용자 게시판에 설명된 비교 CT 방법을 사용하여 GAPDH mRNA에 대한 유전자 특이적 mRNA의 양으로 결정되었습니다.

통계 분석.데이터는 생물학적 삼중의 평균 ± SEM으로 표시됩니다. GraphPad Prism 7.{1}} 소프트웨어를 사용하고 두 그룹에 대해 Student's t-test를 사용하거나 여러 그룹에 대해 일원 분산 분석을 사용하여 계산을 수행했습니다.

윤리적 승인.마우스에 대한 모든 실험은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침에 따라 수행되었으며 University of Maryland-College Park Review Committee의 승인을 받았습니다.

결과 in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>요소이 있는; 피<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

그림 1. 천연 화합물 라이브러리에서 새로운 TRPV4 억제제로서의 Linkedin의 반고처리량 스크리닝 기반 식별. (A) 2000개의 천연 화합물 라이브러리에서 잠재적인 TRPV4 억제제로서 징케틴을 식별하는 워크플로를 보여주는 흐름도. (B) TRPV4 작용제(GSK1016790A)에 의한 6가지 천연 화합물의 억제 효과를 보여주는 대표적인 FlexStation 3 기록은 이차 스크리닝 동안 칼슘 6 염료가 로드된 BMDM에서 Ca2 플러스 유입을 유도했습니다. 6가지 화합물 모두를 사용한 전처리는 비히클(음성 대조군, 비히클 + GSK1016790A(10nM)) 또는 칼슘 이온 전달 물질(A23187, 2μM)로 전처리된 세포와 비교하여 TRPV 의존성 Ca2와 유입에 대한 억제 효과를 나타냈습니다. 우리는 음성 대조군으로 선택적 TRPV4 길항제인 GSK2193874(10nM)를 사용했습니다. 모든 실험은 4번씩 세 번 반복되었습니다. RFU: 상대 형광 단위.

GGT에 의한 TRPV4 억제는 oxLDL 유도 대식세포 거품 세포 형성을 중단합니다.우리의 이전 연구에서는 TRPV{0}}유도 Ca2와 유입이 oxLDL 매개 거품 세포 형성에 관여한다는 것을 보여주었습니다14,16. 따라서 우리는 TRPV4 활성의 GGT 매개 길항 작용에 의해 거품 세포 형성이 억제될 가능성을 평가했습니다. 야생형 뮤린 복막 대식세포를 oxLDL과 함께 배양하여 GGT의 존재 또는 부재 하에 거품 세포 형성을 유도하고 오일 레드 O 염색으로 분석하였다. 예상대로, 우리는 거품 세포의 생성이 천연 LDL과 비교하여 oxLDL 처리된 대식세포에서 5배 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 2A, B). 그러나 oxLDL로 자극하기 전에 대식세포를 GGT(1 또는 10μM)로 처리하면 거품 세포의 비율이 크게 감소했습니다(그림 2A, B). 종합적으로, 이러한 발견은 TRPV 유도 Ca2 플러스 유입을 표적으로 할 가능성이 있는 대식세포 거품 세포 형성에 대한 GGT의 억제 효과를 시사합니다. 또한, 우리는 아데노바이러스 구조를 사용하여 TRPV4 null 대식세포에서 TRPV4를 과발현한 다음 GGT가 있는 상태에서 oxLDL을 사용하여 거품 세포 형성을 유도했습니다. 우리는 TRPV4의 과발현이 세포를 GGT로 전처리할 때 차단된 거품 세포 형성을 증가시켰음을 발견했으며, 이는 GGT에 의한 죽상경화성 거품 세포 형성의 억제가 TRPV4 의존적임을 시사합니다(그림 2C, D).

GGT는 TRPV4 및 염증 수용체의 기본 발현 수준을 차단하지 않습니다.스캐빈저 수용체 CD36은 oxLDL의 흡수 및 결합, 그리고 동맥경화증의 중요한 과정인 거품 세포 형성에 중요한 역할을 합니다. 최근에 동맥경화증에 톨 유사 수용체가 관여한다는 증거가 늘어나고 있습니다2,4,56. GGT가 CD36, TLR4, TLR6 및 TRPV4의 발현에 영향을 주어 거품 세포 형성을 차단하는지 여부를 조사하기 위해 두 가지 농도의 GGT(1 또는 5 μM)에서 면역블롯 분석을 수행했습니다. 우리는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 CD36, TRPV4, TLR6 및 TLR4의 유사한 발현 수준을 발견했습니다(그림 3A-D). 유세포 분석은 또한 GGT 처리 유무에 관계없이 단백질의 세포 표면 발현에 큰 차이가 없음을 보여주었습니다(그림 3E–H, I–L). 종합하면, 이러한 결과는 GGT가 TRPV4, CD36, TLR4 및 TLR6의 표면 발현의 기초 수준을 억제하지 않고 대식세포 거품 세포 형성을 차단함을 시사합니다.

그림 2. Linkedin에 의한 TRPV4 억제는 oxLDL 유도 대식세포 거품 세포 형성을 중단합니다. (A) 티오글리콜레이트로 유도된 쥐 복막 대식세포를 50 μg/ml oxLDL로 밤새 처리한 다음 비히클 또는 1 또는 10 μM Linkedin과 함께 3시간 사전 인큐베이션했습니다. 세포를 대조군으로 50㎍/mL 천연 LDL(VLDL)로 처리하였다. 원래 배율: 40x. (B) 결과의 정량화는 (A)에 표시됩니다. n{10}} 셀/조건. 학생의 t-검정; ***피<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

oxLDL의 흡수그러나 대식세포에 의한 결합은 GGT에 의해 억제됩니다. TRPV4는 이전에 oxLDL의 흡수와 거품 세포 형성에 역할을 하는 것으로 나타났기 때문에 GGT 치료가 대식세포 표면에서 oxLDL의 결합 손상을 유발하는지 여부를 평가했습니다. WT 복막 대식세포를 4도에서 DiI-oxLDL과 함께 인큐베이션하기 전에 GGT로 처리하고 결합을 평가했습니다. 결과는 대식세포 표면에 대한 oxLDL의 결합이 비히클 대조군과 비교하여 GGT(1 또는 10 μM) 처리에 의해 크게 방해받지 않았음을 나타냅니다(그림 5A-C). GGT가 oxLDL의 결합을 억제하지 않는다는 것을 확인한 후, 우리는 다음으로 대식세포에서 oxLDL의 흡수가 GGT 처리에 의해 손상되었는지 확인하는 것을 목표로 삼았습니다. 흥미롭게도, 우리의 결과는 비히클 처리군과 비교하여 GGT 전처리된 세포의 대식세포에서 oxLDL의 흡수가 유의하게 억제되었음을 나타내었다(그림 6A, B). 종합하면, 이러한 결과는 GGT가 대식세포에서 oxLDL의 흡수를 차단하지만 결합은 차단하지 않는다는 것을 시사합니다.

GGT는 대식세포에서 TRPV4의 oxLDL 유도 발현을 차단합니다.

이전에 발표된 연구에서 TRPV{0}}가 Ca2 플러스가 oxLDL 매개 대식세포 거품 세포 형성14,16에서 역할을 한다는 것을 보여주었듯이, 우리는 GGT가 oxLDL 유도 CD36 발현의 억제를 통해 거품 세포 형성을 차단하는지 확인하고자 했습니다. TLR2, TLR4, TLR6 또는 TRPV4. 우리는 oxLDL로 대식세포를 밤새 자극하면 LDL에 비해 TRPV4 단백질의 발현이 크게 상향 조절되는 반면 다른 수용체(CD36, TLR2, TLR4 및 TLR6)의 발현은 변하지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 4A-F). oxLDL로 자극하기 전에 GGT로 세포를 전처리하면 비히클 처리와 비교하여 TRPV4 단백질의 발현 수준이 선택적으로 감소했습니다(그림 4A-F). 종합적으로, 이러한 발견은 TRPV4 단백질 발현에 대한 GGT의 억제 효과를 시사하며, 이는 GGT에 의한 거품 세포 형성 억제에 부분적으로 관여할 수 있습니다.

그림 3. Linkedin 처리는 대식세포에서 TRPV4, CD36 및 TLR의 총 단백질 또는 표면 발현을 변경하지 않습니다. (A-D) 1 또는 5 μM Linkedin 또는 차량으로 밤새 처리한 후 대식세포 전체 세포 용해물의 면역블롯. 대표적인 면역블롯은 Linkedin 처리 및 처리되지 않은 세포에서 CD36(A), TRPV4(B), TLR6(C) 및 TLR4(D)의 총 단백질 발현을 보여줍니다. 각 실험 세트에 대해 3회의 독립적인 생물학적 복제 및 3회의 실험 반복을 수행했습니다. (E–H) 5 μM Linkedin으로 밤새 처리되거나 처리되지 않은 대식세포의 유세포 분석은 처리되지 않은 및 Linkedin 처리된 세포에서 TRPV4(E), CD36(F), TLR4(G) 및 TLR6(G)의 표면 발현을 보여줍니다. 3개의 독립적인 생물학적 복제물과 조건당 30개의{18}} 세포가 분석되었습니다. (I–L) (E–H) 결과의 정량적 분석. 99% 신뢰 구간의 양측 t-검정으로 분석했습니다. 실험당 셀 수, 30,{23}}; 두 번의 실험 반복.

GGT는 대식세포에서 동맥경화성 JNK2 활성화와 염증을 차단합니다. 우리 연구실과 다른 사람들의 발표된 보고서에 따르면 JNK2의 활성화가 거품 세포 형성과 죽상 동맥 경화증에 중요한 역할을 한다는 것이 나타났습니다7,57. GGT가 JNK1/2의 활성화를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 대식세포를 GGT로 처리한 후 LPS 또는 oxLDL로 자극했습니다. 면역 블롯 분석의 결과는 GGT 처리가 미처리 또는 천연 LDL 처리 대조군과 비교하여 JNK1/2의 oxLDL 또는 LPS 유도 인산화를 유의하게 억제한다는 것을 보여주었다(그림 7A-D). 대식세포에서 JNK 활성화는 죽상동맥경화증과 관련된 염증유발 매개체의 전사를 유도하는 것으로 나타났습니다58-60. GGT가 대식세포에서 이러한 전염증성 조절제의 발현을 잠재적으로 차단할 수 있는지 확인하기 위해 GGT 전처리된 세포를 oxLDL로 자극하고 TNF, IL 6, IL12, IL1 및 MCP1의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR 분석으로 정량화했습니다. 우리는 비히클 처리 대조군과 비교하여 GGT 처리 세포에서 oxLDL 유도 발현 수준의 TNF, IL12, IL1 및 MCP1 mRNA에서 상당한 하향 조절을 감지했습니다(그림 7E-I). 종합하면, 이러한 결과는 GGT가 대식세포에서 oxLDL 자극에 대한 반응으로 동맥경화성 JNK2 활성화 및 염증성 유전자 발현을 차단함을 시사합니다. 토론 플라보노이드 및 폴리페놀과 같은 천연 화합물은 염증 유발 신호 억제, 인슐린 감작, 산화 상태 및 혈중 지질 프로필 개선과 같은 다양한 메커니즘을 통해 심혈관 반응을 조절하는 것으로 알려져 있습니다40-45. 여기에서 우리는 대식세포에서 TRPV{32}}의존성 프로토제닉/염증 과정의 새로운 억제제인 ​​플라본인 Linkedin의 반고처리량 스크리닝 기반 식별 및 기능적 특성 규명을 보고합니다. 우리는 구체적으로 i) ginkgetin이 TRPV{33}}매개 Ca2와 대식세포로의 유입을 차단하고, ii) TRPV4 기능의 ginkgetin 차단이 대식세포에서 oxLDL의 흡수를 억제하여 oxLDL에 의한 거품 세포 형성을 현저하게 감소시키고, iii) ginkgetin 차단을 보여주었다. JNK1/2의 LPS 및 oxLDL 유도 인산화, TRPV4 단백질 발현 및 염증성 유전자 발현. 종합적으로, 우리 연구의 결과는 징케틴이 TRPV{42}}의존 방식으로 죽상경화성/염증성 대식세포 기능을 억제한다는 것을 보여주었습니다. 대동맥 질환인 죽상동맥경화증은 초기에 염증과 oxLDL을 사용한 대식세포의 충혈에 의해 촉진되어 대식세포 거품 세포의 형성을 유도하고 이후에 죽상종을 형성합니다2-10. 거품 세포 형성은 동맥 경화에서 중요한 과정이기 때문에 거품 세포 형성을 이해하고 조작하는 것은 치료 가능성을 가질 수 있습니다. 대식세포는 물리적 및 생화학적 자극에 의해 활성화되는 기계적 감수성 다봉 Ca2 플러스 투과성 이온 채널인 TRPV4를 포함하여 일련의 멤브레인 투과 이온 채널 및 펌프를 발현하는 것으로 알려져 있습니다. 우리 연구실과 다른 사람들이 발표한 연구에서는 대식세포 염증과 oxLDL 유도 거품 세포 형성에서 TRPV4의 역할을 확인했습니다. 따라서 TRPV4는 죽상경화 과정의 약화를 위한 실행 가능한 표적으로 작용할 수 있습니다.

그림 5. Linkedin은 대식세포에 대한 DiI-oxLDL 결합을 억제하지 않습니다. 대식세포를 3시간 동안 비히클 또는 Linkedin(1 또는 10μM)으로 전처리한 다음 4도에서 1시간 동안 DiI 표지된 oxLDL(2.5μg/mL)과 함께 인큐베이션했습니다. (A) 대식세포 막 표면에 결합하는 DiI-oxLDL의 대표적인 형광 현미경 이미지(원래 배율, 63배)(n{12}} 세포/조건). (B) NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 플롯 프로필로 표시된 실험 A의 결과. (C) A. n{13}}개의 세포/조건에서 얻은 결과의 정량적 분석. MMP{14}} 및 MMP{15}}를 감소시키고 쥐의 흉부 대동맥에서 NO 및 NOS 수준을 증가시켜 죽상동맥경화증을 개선합니다52. 현재 연구에서 우리는 은행나무가 TRPV를 차단함을 보여{17}}대식세포에서 Ca2와 유입을 유도했습니다. 기계적으로, 우리는 ginkgetin이 대식세포에서 oxLDL의 흡수를 차단하지만 결합은 차단한다는 것을 보여주었습니다. 생체 내 및 시험관 내에서 수행된 연구는 oxLDL 및 대식세포 거품 세포 형성의 흡수에서 주요 스캐빈저 수용체로서 CD36의 중요한 역할을 제안했습니다. ApoE 또는 LDLR이 없는 CD36 null 마우스는 죽상경화성 병변이 발생하는 경향이 적은 것으로 나타났습니다5,6. 우리 그룹의 이전 연구에서는 대식세포 거품 세포 형성7에서 CD{25}}JNK 신호 전달 캐스케이드의 필수적인 역할을 확인했습니다. Toll-like 수용체 TLR2, TLR4 및 TLR6은 CD36과 상호작용하여 공수용체로 작용하며 동맥경화에 관여하는 것으로 나타났습니다2,56,63. Linkedin 처리된 대식세포에서 볼 수 있는 거품 세포 형성의 결여가 CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 또는 TLR6 단백질의 발현 감소로 인한 가능성을 조사했습니다. 흥미롭게도 Linkedin 치료는 기본 수준 또는 oxLDL 자극 조건에서 CD36, TLR2, TLR4 또는 TLR6 단백질의 발현을 유의하게 감소시키지 않았습니다. 그러나 Linkedin은 oxLDL에 의해 유도된 TRPV4 단백질의 발현 상향 조절을 구체적으로 차단했지만 기저 수준에서의 발현은 변하지 않았습니다. 종합하면, 이러한 결과는 Ginkgetin이 CD36 및 TLR 발현과는 무관하지만 TRPV4에 의존하는 메커니즘을 통해 oxLDL 유도 거품 세포 형성을 차단한다는 것을 시사합니다. 우리 그룹과 다른 사람들의 이전 연구는 JNK2 활성화가 거품 세포 형성 및 죽상 경화성 병변 발달에 관여한다는 것을 보여주었습니다. 또한 JNK는 동맥경화성 병변에서 과발현되는 MMP-9 및 MMP{54}}의 조절에 관여하는 것으로 보고되었습니다64-68. 죽종 형성 과정에서 JNK의 인식된 연결을 감안할 때, 우리는 Ginkgetin이 JNK의 활성화를 억제할 수 있는지 확인하고 싶었습니다. 이전 보고서에 따르면, 우리의 결과는 또한 ginkgetin이 대식세포에서 염증 자극 유발 JNK2 인산화를 차단한다는 것을 보여주었습니다. 이 결과는 Linkedin이 거품 세포 형성을 차단하는 가능한 메커니즘을 제안합니다. 또한, 우리는 비히클 대조군과 비교하여 징케틴 처리된 세포에서 TNF, IL12, IL1 및 MCP1 mRNA의 oxLDL 유도 발현에서 상당한 하향 조절을 발견하여 oxLDL에 대한 반응으로 징크게틴의 잠재적인 항염증 역할을 강조했습니다. 요약하면, 우리 결과는 징케틴이 TRPV 의존적 방식으로 죽상경화 및 염증성 대식세포 기능을 억제한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이러한 발견은 잠재적인 치료제 및/또는 화학 예방 시약의 개발에 천연 화합물을 사용하는 근거를 강화합니다.

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