Cistanche 살사 세포 배양에서 페닐에타노이드 글리코시드 생합성에 관여하는 과산화수소 반응성 EST의 식별
Mar 17, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
J. CHEN 외
추상적인
과산화수소는 식물에서 2차 대사산물 생합성을 유도할 수 있는 효과적인 비생물적 유발제입니다. 우리는 내염성 약용 식물의 세포 현탁액 배양에서시스탄체살사, 생리 활성 성분의 생산페닐에타노이드배당체(PeGs)는 H2O2 처리 후 증가했습니다. PeG와 관련된 유전자를 식별하기 위해(페닐에타노이드배당체)H2O2의 영향을 받는 생합성, 우리는시스탄체살사105개의 발현된 서열 태그(EST)와 85개의 유전자를 확인했습니다. EST 라이브러리 기능 주석 및 유전자 온톨로지 분석은 다양한 스트레스 반응, 이차 대사 산물의 생합성 및 전사 조절과 관련된 유전자를 보여주었습니다. 그 중 PeGs와 관련된 두 개의 유전자를 확인했습니다.(페닐에타노이드배당체)생합성 경로({0}}쿠마레이트 조효소 A 리가제 및 신나메이트 4-히드록실라제) 및 2개의 WRKY 유형 전사 인자. H2O2 처리 후 선택된 유전자의 발현을 RT-qPCR로 분석하였다. PeG의 초기 증가된 전사(페닐에타노이드배당체)처리 후 생합성 경로 유전자는 H2O2가 PeG를 유도한다는 것을 보여주었습니다.(페닐에타노이드배당체)핵심 유전자의 상향 조절을 통한 생합성.
추가 키워드: 신나메이트-4-하이드록실라제, 4-쿠마레이트 조효소 A 리가제, 억제 감산 혼성화.시스탄체살사. 페닐에타노이드배당체.
소개
시스탄체살사Haloxylos ammodendrun의 뿌리에 기생하는 다년생 식물 기생으로 중국 서부의 사막 지역에서 자랍니다. 수 세기 동안,시스탄체종은 전통 약초로 사용되었습니다(Wang et al. 2012). 생리활성 성분은페닐에타노이드배당체(PeGs) 활성 산소종(ROS) 제거, 방사선 보호, 면역 강화 및 노화 방지에 현저한 효과가 있습니다(Nan et al. 2013). 페그(페닐에타노이드배당체)생합성시스탄체페닐알라닌에서 시작되고(그림 1 Suppl.) 합성된 카페인산은 추가로 글리코실화되어 다양한 PeG를 형성합니다.(페닐에타노이드배당체)(Wang et al. 2012). 세 가지 주요 PeG(페닐에타노이드배당체), echinacoside, acteoside 및 2'-acetylacteoside는 가장 활성 성분으로 간주됩니다.시스탄체(Kobayashi et al. 1984). 그들의 콘텐츠를 향상시키기 위해시스탄체세포 배양, 키토산, 퓨트레신, Ag 플러스 및 삼투압 스트레스를 포함한 다양한 유발제가 테스트되었습니다(Ouyang et al. 2005a,b, Cheng et al. 2005, 2006, Liu et al. 2007, Liu and Cheng 2008). 그러나 PeG에 관여하는 유전자(페닐에타노이드배당체)생합성시스탄체, 주로 페닐알라닌 대사 경로 유전자는 거의 확인되지 않았습니다. Cistanche Deserticola에서 페닐알라닌 암모니아 분해효소(PAL)를 암호화하는 유전자만이 최근에 확인되었습니다(Hu et al. 2011). 예를 들어, 신나메이트를 쿠마르산으로 전환하는 것을 촉매할 수 있는 신나메이트-4-하이드록실라제(C4H) 및 리그닌 및 플라바노이드의 필수 유전자인 4-쿠마레이트 조효소 A 리가제(4CL)를 인코딩하는 기타 유전자 생합성, 에서 발견되지 않은시스탄체.
우리는 의 세포 배양을 사용했습니다.시스탄체살사PeG를 공부하기 위해(페닐에타노이드배당체)생합성 및 관련 유전자 발현. 우리는 또한 PeG에 대한 효과적인 Elicitor H2O2의 효과를 조사했습니다.(페닐에타노이드배당체)생합성. 또한 PeG에 관여하는 초기 반응성 유전자를 찾기 위해(페닐에타노이드배당체)생합성에서 우리는 억제 감산 혼성화(SSH)를 수행하여 H2O{1}}반응성 유전자의 cDNA 라이브러리를 구축했습니다.
그림 1. H2O2 처리 후 RT-qPCR에 의해 결정된 상대적 유전자 발현. CsWRKY1 - WRKY 전사 인자(Contig07), CsC4H1 - 신나메이트 4-수산화효소(Contig09), Cs4CL1 - 4-쿠마레이트: 리가제(Contig03), CsHSP{13}} 열 충격 단백질 70kDa(Contig 01) 및 CsSOD{16}} 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Contig16). 세포를 액체 배지에서 80ug dm{19}} H2O2로 2시간 동안 처리하고 발현을 물로 처리한 대조군과 비교했습니다. 평균 플러스 - 세 번의 생물학적 반복의 SD; * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>
재료 및 방법
CS2001 세포주는 의 꽃잎에서 확립되었습니다.시스탄체살사(CA Mey.) Beck은 Neimenggu 지방에서 채집하여 계대배양하였다. 배양 방법은 이전에 발표된 프로토콜과 유사했습니다(Liu et al. 2007). 일반적으로 계대배양은 고체 Murashige and Skoog(1962; MS) 배지를 사용하고 PeGs는 액체 배지를 사용하였다.(페닐에타노이드배당체)생합성(30 g dm-3 포도당 및 2.0 mg dm-3 인돌-3-아세트산으로 보충된 변형 MS 배지). H2O2 처리의 경우, 5.{10}} 고속 성장기의 세포 5.{10}} 일반적으로 고체 배지에서 계대 배양한 후 20~30일 후에 ± 0.2g의 세포를 250cm3 삼각 플라스크의 50cm3 액체 배지에 접종합니다. 다른 H2O2 농도의 유무에 관계없이 어둠 속에서 배양됩니다. 페그(페닐에타노이드배당체)H2O2에 의한 10일 유도 후 함량은 메탄올 구배 용출을 사용한 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 기반으로 이전에 발표된 방법(Liu et al. 2007)에 따라 분석되었습니다.
H2O2 처리 2시간 후 세포를 Büchner 깔때기를 사용하여 여과지로 배지에서 수집한 다음 액체 질소에서 동결하고 분말로 분쇄하였다. 세포 분말 2g마다 2-메르캅토에탄올 1cm3, 200g dm{{1{32}}}} 사르코실 1cm3, 및 8 cm3의 GTC 완충액(5 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 62.5 mM Tris-HCl, pH 8.0, 6.25 mM EDTA, pH 8.0, 5 mM 티오우레아, 및 10 mM 디티오트레이톨). 그런 다음 세포를 얼음 위에서 15분 동안 배양한 다음 1/3 부피의 8.5M CH3COOK, pH 6.0을 첨가하고 세포를 얼음 위에서 15분 동안 배양한 다음 15 000g에서 15분 동안 원심분리했습니다. . 상등액을 동일한 부피의 이소프로판올에 첨가하여 총 RNA를 침전시켰다. 총 RNA는 제조업체의 지침에 따라 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Hilden, USA)에 의해 추가로 정제되었습니다. 메신저 RNA는 Oligotex mRNA midi 키트(Qiagen)를 사용하여 전체 RNA에서 분리되었습니다.
페닐에타노이드배당체안에시스탄체살사
SSH 라이브러리는 PCR-select cDNA 제거 키트(Clontech, Mountain View, USA)를 사용하여 추출 2시간 후에 대조군과 30% H2O{2}}에서 세포 샘플을 생성했습니다. 라이브러리 구축을 위해 겔 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 제품을 별도로 정제하고 TA 클로닝 키트(Tiangen, Beijing, China)를 사용하여 pGEM 벡터에 클로닝했습니다. 독립적인 클론으로부터 플라스미드를 분리하고 T7 프라이머를 사용하여 시퀀싱했습니다. 라이브러리의 모든 발현된 서열 태그(EST) 서열(벡터 서열이 제거됨)은 CAP3(http://doua.prabi.fr/software/cap3)을 사용한 contig 어셈블리에 사용되었습니다. EST는 contig와 singleton으로 그룹화되었습니다. NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLASTx 프로그램을 사용하여 상동성 검색에 사용되었습니다. 그런 다음 Blast2GO(http://www.blast2go.com)를 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 용어에 따라 서열에 주석을 달고, 분석하고, 분류했습니다.
실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)은 Bustin et al. (2009). cDNA 샘플은 0.5ug의 총 RNA에서 PrimeScript RT 시약 키트(Takara, Dalian, China)를 사용하여 합성되었습니다. RT-qPCR은 ABI 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, USA)에서 SYBR Premix Ex Taq II 및 ROX plus 키트(Takara)를 사용하여 3개의 기술 복제품을 사용하여 수행했습니다. 프라이머는 Takara에서 제공한 지침에 따라 온라인 Primer3 소프트웨어를 사용하여 설계되었습니다. 이 연구에 사용된 프라이머는 표 1 Suppl에 나열되어 있습니다. 유전자 발현은 18S RNA로 정규화되었으며, 발현은 모든 샘플에서 안정적이었다.
결과는 R 버전 3.1.1을 사용하여 분석되었으며 차이의 유의성은 Student's t-test로 확인되었습니다.
결과
세 가지 주요 PeG 모두의 과산화수소 유도 생합성(페닐에타노이드배당체)안에시스탄체살사현탁 세포(표 1)이지만 세포 성장에 대한 명백한 영향은 없습니다(그림 S2). echinacoside의 함량은 10 ug dm-3 H2O2 처리 후 이미 증가했으며(P < 0.05),="" 20="" ug="" dm="" 후에="" 더="" 높은="" 증가가="" 기록되었습니다.="" -3="" h2o2="" 처리(p="">< 0.01),="" 가장="" 높은="" 증가는="" 40,="" 80="" 및="" 160ug="" dm{17}}="" h2o2="" 처리="" 후였습니다.="" 유사한="" 결과가="" 악테오사이드에="" 대해="" 표시되지만="" 그="" 함량은="" 80ug="" dm{21}}="" h2o2="" 처리="" 후에="" 최고조에="" 달했습니다.="" 2'-acetylacteoside의="" 생합성은="" h2o2="" 처리에="" 덜="" 민감했다.="" 함량의="" 상당한="" 증가(p="">< 0.05)는="" 40ug="" dm-3="" 이상의="" h2o2="" 농도에서="" 발생했습니다.="" 80ug="" dm{35}}="" h2o2="" 처리="" 후="" 세="" 가지="" 주요="" peg의="">(페닐에타노이드배당체)대조군에 비해 크게 증가했습니다(P < 0.01).="" 따라서="" 이="" 농도는="" 추가="" 실험에="">
H2O2에 의해 상향 조절되는 초기 반응성 유전자가 풍부한 라이브러리를 생성하기 위해 다음의 cDNA를 사용했습니다.시스탄체살사2시간 동안 80ug dm{1}} H2O2로 처리된 현탁 세포. SSH 라이브러리에서 단일 패스 시퀀싱 129개의 재조합 클론은 벡터 서열 배제 후 105개의 깨끗한 EST를 산출했습니다. 이러한 clear EST는 CAP3에 의한 어셈블리에 사용되었으며 18개의 contig와 67개의 singleton이 생성되었습니다(표 2). 따라서 이 라이브러리에서 85개의 유전자가 분리되었습니다. 깨끗한 105개 EST의 평균 길이는 527bp로 서열 유사성 기반 기능 분류에 적합합니다.
페닐에타노이드배당체안에시스탄체살사
라이브러리에서 얻은 모든 85개 유전자는 서열 유사성을 위해 GenBank 비중복 단백질 데이터베이스에 대해 BLASTx에 의해 검색되었습니다(E-값 0.001 이하). 21개의 유전자가 데이터베이스에서 히트를 나타내지 않았습니다.시스탄체살사. BLASThits를 사용한 결과는 추가 GO 및 KEGG 경로 농축 분석을 위해 Blast2GO 소프트웨어로 가져왔습니다. BLAST 히트가 있는 64개 유전자 중 50개는 다른 종의 상동 유전자에 대한 설명에 따라 주석이 달렸습니다. 주석이 달린 유전자는 BLAST 히트의 설명에 따라 명명되었습니다. GO 분석(Fig. 3 Suppl.)은 이 50개의 유전자 중 자극에 대한 반응과 관련된 14개의 유전자와 대사 과정과 관련된 30개 이상의 유전자가 있음을 보여줍니다(표 1 및 2). 이들 유전자 중에서 두 개의 PeG 생합성 경로 유전자 상동체가 예상대로 분리되었습니다. 4-쿠마레이트 조효소 A 리가제(Cs4CL1: Contig03로 명명) 및 신나메이트 4-하이드록실라제(CsC4H1: Contig14로 명명). 또한, H2O2 처리 후 라이브러리로부터 유도된 유전자 발현을 확인하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다.
SSH 라이브러리에서 확인된 필수 유전자가 H2O2 처리에 반응하는지 확인하기 위해 두 개의 PeG의 발현(페닐에타노이드배당체)생합성 경로 관련 유전자(Cs4CL1, CsC4H1), 2개의 ROS 유도 유전자(CsSOD1: Contig 16, CsHSP1: CISTH099) 및 1개의 WRKY family 전사 인자 유사 유전자(CsWRKY1: Contig 07)를 처리 후 RT-qPCR로 측정하였다. H2O2(그림 1). CsC4H1, Cs4CL1, CsSOD1 및 CsWRKY1 발현은 H2O2 2시간 후에 각각 15-배, 3-배, 45-배 및 4-배 이상 상향 조절되었습니다. 치료. CsHSP1의 발현은 H2O2 처리 후 단 1.8배만 변경되었다.
H2O2 처리 후 CsWRKY1, CsC4H1 및 Cs4CL1 발현의 시간 경과를 RT-qPCR로 추가 분석하였다(Fig. 2). CsC4H1 및 Cs4CL1 발현은 16-h 처리 후 크게 증가(각각 80-배 및 50-배 이상)한 다음 32시간 후에 하향 조절되었습니다. CsWRKY1의 발현은 4시간에 20-배 이상 상향 조절되었고 8시간 후에는 감소했습니다(그림 2).
그림 2. 8{12}} ug dm-3 H2O2 처리 후 CsWRKY1(A), CsC4H1(B), Cs4CL1(C)의 상대적 발현. 표현식은 컨트롤로 정규화되었습니다. (물로 처리). 평균 플러스 - 세 번의 생물학적 반복의 SD; * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>
논의
과산화수소는 식물에 다양한 효과를 나타내는 잘 알려진 식물 유도제입니다. ROS와 같이 superoxide dismutase, catalase, peroxidase 등으로 구성된 ROS scavenging system을 유도할 수 있으며 salt, osmotic, dehydration의 하류 신호 역할을 한다.
응력(Wi et al. 2006, Kar 2011, Furlan et al. 2013, Sathiyaraj et al. 2014). 식물에서 H2O2 생성은 식물에서 유도된 2차 대사산물 생합성을 동반한다고 제안되었다.시스탄체살사세포 배양. 예상대로 우리의 결과는 PeG가(페닐에타노이드배당체)생합성시탕슈 살사세포 배양은 H2O2 처리 후 유도되었다(표 1). 세 가지 주요 PeG의 내용(페닐에타노이드배당체)H2O2 처리 후 증가하여 PeG 생합성에서 중추적인 역할을 나타냅니다. SSH 라이브러리에 풍부한 유전자가 PeG에 미치는 영향을 추가로 제안했습니다.(페닐에타노이드배당체)생합성 유도시탕슈 살사.
Ascorbate peroxidase(CISTH069, Karyotou and Donaldson 2005), h-quinone oxidoreductase(CISTH125, Bello, et al. 2001), CsSOD1, CsHSP1(Baruah et al.)과 같은 많은 알려진 H2O{1}반응성 유전자 20 및 질병 저항 반응 유전자(Contig10, Nanda, et al. 2010)는 SSH 라이브러리(표 3, 표 2 Suppl.)에 풍부했습니다. H2O2 처리 후 유도된 발현을 갖는 이러한 전형적인 ROS 반응성 유전자 중 일부는 RT-qPCR(그림 1 및 2)에 의해 추가로 확인되어 여기에 적격한 SSH 라이브러리가 구축되었음을 나타냅니다. 두 개의 PeG 생합성 경로 유전자인 CsC4H1 및 Cs4CL1도 이 라이브러리에서 발견되었으며 이 두 유전자 발현은 H2O2 처리에 의해 시간 의존적 방식으로 유도되었습니다(그림 2). 그것은 H2O2 처리가 PeGs를 유도했음을 시사합니다.(페닐에타노이드배당체)PAL 경로 유전자의 조절을 통한 유전적 수준에서의 생합성. 그러나 PAL 및 기타 다운스트림 PeG 생합성 유전자(Wang et al. 2012)는 SSH 라이브러리에서 확인되지 않았습니다. 라이브러리가 충분히 시퀀싱되지 않았기 때문일 수 있습니다. CsC4H1과 Cs4CL1 유도 발현과 H2O2 처리 후 증가된 PeGs 생합성 사이의 관계는 추가 분석을 통해 밝혀져야 합니다.
H2O2 처리에 의해 유도된 PAL 경로 유전자 외에 SSH 라이브러리에서 두 개의 WRKY family 전사인자(CsWRKY1, CsWRKY2)가 발견되었으며(Table 3 and Table 2 Suppl.), RT-qPCR을 통해 CsWRKY1 유도 발현을 확인하였다. . 그것의 발현은 두 개의 PAL 경로 유전자인 Cs4CL1과 CsC4H1의 발현보다 더 일찍 H2O2 처리에 반응하였다(Fig. 2). 이전 연구에서 일부 WRKY 전사 인자와 PAL 경로 유전자의 동시 발현이 벼에서 관찰되었습니다(Gupta et al. 2012). 더욱이, PAL 유전자 발현은 OsWRKY03 과발현 돌연변이에서 상향조절된다(Liu et al. 2005). 위에서 언급한 두 가지 WRKY 계열 전사 인자는 PeG에도 관여할 수 있습니다.(페닐에타노이드배당체)생합성시스탄체살사. 흥미롭게도 SSH 라이브러리에서 탈수 관련 EST(CISTH067, CISTH064)가 발견되었는데, 이는 H2O2 처리가 탈수 반응 유전자 발현과 관련이 있음을 시사할 수 있습니다.시스탄체살사다른 식물에서 관찰된 바와 같이(Schmidt et al. 2013, Zhou et al. 2013). 지베렐린(GA) 신호전달 관련 유전자인 지베렐린 수용체 gid1b-like(CISTH092)가 SSH 라이브러리에서 확인되었으며, 이는 GA 신호전달과 H2O2 처리의 연결을 암시합니다.시스탄체살사, 보리에서도 보고되었습니다(Bahin et al. 2011). 그러나 이러한 유전자가 PeG와 관련이 있는지 확인하려면 더 많은 연구가 필요합니다.(페닐에타노이드배당체)생합성. 위에서 언급한 유전자 외에 여기에 구성된 SSH 라이브러리도 BLAST 히트가 있거나 없는 유전자를 제공합니다. 이것은 C. salsa에 대한 H2O2 효과에 대한 우리의 이해를 향상시키고 먼저 PeGs 생합성에 관련된 유전자 정보를 제공합니다.
결론적으로, 우리는 PeG에 대한 H2O2의 영향을 평가했습니다.(페닐에타노이드배당체)유도시스탄체살사세포 배양. SSH 라이브러리는 H2O2 처리 후 구축하였으며, 선택된 유전자의 발현은 RT-qPCR로 확인하였다. 두 개의 PeG 생합성 경로 관련 유전자와 기타 H2O{5}}반응성 유전자가 확인되었습니다. 이러한 발견은 H2O{7}}유도 PeG에 대한 이해를 확장할 것입니다.(페닐에타노이드배당체)생합성시스탄체살사분자 수준에서 유전자 조작을 위한 정보 제공시스탄체살사PeG를 개선하기 위한 세포 배양(페닐에타노이드배당체)생산.
From: 'Cistanche 살사 세포 배양에서 페닐에타노이드 배당체 생합성에 관여하는 과산화수소 반응성 EST의 확인'J. CHEN et al.
--- BIOLOGIA PLANTARUM 59(4): 695-700, 2015 J. CHEN et al. DOI: 10.1007/s10535-015-0541-y
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