뚜렷한 루푸스 신염 클래스의 면역 유전자 발현과 기능 네트워크 Ⅰ

추상적인

목표 NanoString 플랫폼의 유용성을 탐색하는 것입니다.신장 해명후향적 코호트를 사용하여 클래스 III, IV 및 V 루푸스 신염(LN)에 대한 면역 전사체포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 신장 생검 조직.

방법: 면역 유전자 전사체 분석은 LN(n=55), 얇은 기저막(TBM) 질환(n=14) 및 막성 신장병(MN)(n{)의 RNA에 대해 NanoString nCounter 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. {2}}) FFPE신장 생검조직. LN 샘플은 혼합 병변이 없는 단일 클래스 III(n=11), IV(n=23) 및 V(n{2}}) 생검으로 구성되었습니다. 차등 유전자 발현은 R에서 생성된 화산 플롯 및 히트맵의 시각화를 통해 NanoString nSolver를 사용하여 수행되었습니다. STRING 및 유전자 개체 발생 용어를 사용하여 기능적 네트워크를 식별하기 위해 중요한 전사물을 조사했습니다.

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결과 TBM과 비교하여 우리는 세 가지 LN 클래스 모두에 공통적으로 유의미하게 차별적으로 발현되는 유전자 52개를 확인했습니다. 경로 분석에서는 유형 I 인터페론(IFN) 신호 전달, 보체 및 MHC II 경로에 대한 농축이 나타났으며 대부분 클래스 IV LN에서 가장 높은 발현을 나타냈습니다. 우리의 클래스 IV LN 생검은 또한 클래스 V LN 생검과 비교하여 NF-κB 신호 전달 및 면역학적 농축의 상당한 상향 조절을 보여주었습니다. 유형 I IFN 경로의 성적표는 클래스 V LN을 MN과 구별합니다.

결론 우리의 전체 신장 부분 전사체 분석은 클래스 III, IV 및 V LN의 분자 프로필에 대한 통찰력을 제공했습니다. 데이터는 세 클래스 모두에 공통적인 중요한 경로와 클래스 IV LN 생검에서 강화된 경로를 강조했습니다. FFPE 전체 생검 절편을 사용하여 LN의 분자 경로를 밝혀내는 능력은 LN에 대한 치료 선택에 임상적 유용성을 가질 수 있습니다.

소개

루푸스 신염(LN)은 전신의 중요한 표현입니다.홍반루푸스(SLE) 환자의 약 40%에서 발생합니다.1 유병률은 연령(소아기 발병 SLE가 높음) 및 인종(비백인 환자가 높음)에 의해 영향을 받으며 사회 경제적 지위와 반비례합니다.2신장 생검이는 LN3 4 관리의 중요한 부분이며 생검에서 관찰된 변화를 병인, 치료 선택 및 예후와 연관시키려는 상당한 노력이 이루어져 왔습니다.1 여기에 중요한 것은 다음을 통합한 LN 분류 시스템의 개발이었습니다. 보고 간 변동성을 줄이기 위해 생검 병변의 표준화된 정의.

국제신장학회/신장병리학회(ISN/RPS) 2003 합의 분류에서는 LN5에 대해 6가지 분류를 기술했습니다: 최소 혈관간 LN(클래스 I); 혈관간 증식성 LN(클래스 II); 초점 LN(클래스 III); 미만성 분절(클래스 IV-S) 및 미만성(클래스 IV-G) 증식성 LN으로 더 분류될 수 있는 미만성 LN; 막성 LN(클래스 V) 및 진행성 경화성 LN(클래스 VI). 활동성(A, 예를 들어 모세혈관과다세포증, 섬유소성 괴사, 세포 및 미세세포 초승달 모양) 및 만성(C, 예를 들어 사구체 경화증, 섬유성 초승달 모양) 사구체 병변도 정의되어 클래스 III 및 IV를 설명할 때 표시되었습니다. 예를 들어, 클래스 IV-G(A)는 활동성 병변이 있는 확산성 전역 증식성 림프절을 기술했습니다. 이 분류에 대한 업데이트가 제안되었습니다.6 클래스 IV-S 및 IV-G 세분류는 결과에 영향을 미치지 않으므로 제거하는 것이 권장사항에 포함되었습니다. 메타 분석에서 다음 중 하나가 발생합니다.말기 신장 질환또는혈청 크레아티닌의 두 배IV-S와 IV-G 클래스 사이에는 차이가 없었습니다.7 또한 활성 및 만성 설명자를 NIH 루푸스 활동 및 채점 시스템에서 파생된 활동 및 만성도 지수로 대체하여 활동의 정량적 평가를 가능하게 하는 것이 제안되었습니다(a 점수는 0 ~ 24) 및 만성도(점수는 0 ~ 12)입니다.

LN 등급은 관리에 정보를 제공하는 데 중요합니다.3 활성 등급 III 및 IV LN에서는 면역억제가 권장되지만 II 등급 LN에서는 권장되지 않습니다. V형 림프절에서 면역억제를 시작하는 결정은 단백뇨의 정도와 레닌-안지오텐신-알도스테론 차단에 대한 반응에 따라 영향을 받습니다. 치료 후 12개월 동안 단백뇨를 조절하지 못하면 만성 신장 질환으로의 진행과 관련이 있으므로9-11 관리 목표는 완전한 임상 반응을 목표로 단백뇨를 줄이는 것입니다(<0.5–0.7 g per 24 hours).

LN 클래스만으로는 결과를 알리는 데 덜 강력합니다.만성 신장 질환 발병의 위험 요인포함하다임상적 특징LN 클래스 정의에 의해 포착되지 않은 조직학적 특징을 포함하기 때문입니다. 여기에는 간질성 섬유증 및 세뇨관 위축(IFTA)의 정도와 섬유소성 괴사 및 섬유성 초승달 모양과 같은 특정 사구체 병변이 포함됩니다.12 선택되고 잘 정의된 개별 신장 병변의 정량화는 예후를 알 수 있습니다. 이는 IgA 신장병증에서 명백히 나타나며, MEST-C 점수를 형성하기 위한 혈관간 세포성, 모세혈관내 과다세포성, 분절 경화증, 세뇨관 위축, 간질성 섬유증 및 초승달 점수가 위험 예측에 도움이 되는 것으로 나타났습니다.13-15 제안된 ISN 개정안 LN의 /RPS 2003 합의 분류는 이러한 부족점을 해결할 수 있지만6 여전히 형태학의 사용을 전제로 합니다. 결과적으로, LN 생검 내의 분자 경로를 연구하고 이것이 LN 클래스16 17 및 치료 결과와 어떻게 관련되는지 이해할 필요가 있습니다.18 19 임상적 유용성 측면에서 신장 생검의 전사체 분석은 가장 유용합니다. 생검 조직에서 유전자 전사체의 발현 증가가 검증된 형태학적 기준에 추가된 항체 매개 신장 거부반응의 진단이 향상되었습니다.20 신장의 임상적 유용성을 향상시키기 위해 전사체 데이터를 사용하는 유용성을 결정합니다. SLE의 생검에서는 NanoString 기술을 사용하여 55개의 LN 생검, 얇은 기저막(TBM) 질환이 있는 14개의 생검 및 막성 신장병증(MN).

행동 양식

샘플: FFPE 신장 생검 조직은 임상 사용을 위해 보관된 LN, TBM 및 MN 과잉 샘플로부터 얻었으며 적절한 조직이 분석에 이용 가능했습니다. 혼합 병변이나 심각한 흉터가 있는 루푸스 생검은 제외되었습니다. TBM은 정상적인 신장 생검이 불가능하기 때문에 질병 통제로 사용되었습니다. 임상 매개 변수는 건강 기록에서 후향적으로 수집되었습니다. 인터페론(IFN) 점수 매트릭스는 이전에 보고된 대로 얻었습니다.21 완전 반응은 소변 단백질/크레아티닌 비율(uPCR)로 정의되었습니다.<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >생검 후 1년까지 20%. 부분 반응은 uPCR로 정의되었습니다.<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

RNA 추출

2개의 4μm 섹션을 제거한 후 각 FFPE 블록에서 마이크로톰으로 6개의 10μm 두께 전체 조직 섹션을 얻었습니다. 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 RNase Away로 장비를 세척하였고, 각 샘플마다 새로운 블레이드를 사용했습니다. 전체 조직 RNA 분리는 같은 날 RNeasy FFPE 키트(Qiagen, #73504)를 사용하여 수행되었으며 RNA 농도는 NanoDrop ND1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA, 온라인 보충 데이터 S1)로 평가되었습니다.

전사체 분석

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >음성 대조 프로브의 두 배(평균+2 SD). 카운트는 모든 샘플 유형에 걸쳐 표현된 대로 선택된 10개의 하우스키핑 유전자(FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB 및 ZC3H14)의 기하 평균으로 정규화되었습니다. 모든 샘플의 정규화된 개수는 온라인 보충 데이터 S2에 나열되어 있습니다.

통계 분석

차등 유전자 발현(DGE)은 알고리즘이 수렴하지 않고 선형 회귀 방법이 사용되는 경우를 제외하고 모든 프로브에 대해 단순화된 음이항 모델을 사용하는 솔버 고급 분석(V.4) Fast/Approxi mate 알고리즘을 사용하여 수행되었습니다. LN, MN 또는 LN 클래스(III, IV 및 V)는 독립 변수로 사용되었고 TBM은 참조 그룹으로 사용되었습니다. 임계값 개수는 100로 설정되었고 샘플 내 관찰 빈도는 8%로 설정되었습니다. P 값은 0.05로 설정된 잘못된 발견 임계값을 사용하여 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 조정되었습니다. 화산 플롯은 R.22의 Enhanced Volcano 패키지(https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano)를 사용하여 생성되었습니다. 기능적 단백질 연관 네트워크 시각화는 STRING 데이터베이스(https://string-db.org/)를 사용하여 수행되었습니다. , 전체 STRING 네트워크를 사용합니다. 네트워크 에지는 신뢰도로 정의되었으며 상호작용은 가장 높은 신뢰도 상호작용 점수(0.9 이상)로 설정되었습니다. 네트워크 내에서 연결이 끊긴 노드는 표시되지 않았습니다. 유전자 온톨로지(GO) 용어(생물학적 과정, 분자 기능, 세포 구성요소), 반응 경로 및 STRING 로컬 네트워크 클러스터의 강화에 대해 중요하게 차등적으로 발현된 유전자를 평가했습니다. GO 용어(생물학적 과정) 및 STRING 분석의 기능 강화를 통해 시각적 상호 작용 네트워크가 생성되었습니다. BioVenn(www.biovenn.nl)을 사용하여 LN 하위 클래스 간에 차등적으로 발현된 유전자가 겹치는 면적 비례 Venn 다이어그램이 BioVenn(www.biovenn.nl)을 사용하여 생성되었습니다.23 고급 분석 솔버 소프트웨어의 데이터를 R 통계 환경으로 판독하고 데이터 시각화는 상자 그림, 주성분 분석, 화산 플롯과 히트맵. 히트맵은 정규화된 개수의 Z 점수와 R의 피트맵을 사용하여 생성되었습니다. 클러스터는 Fisher 정확한 테스트를 사용하여 분석되었습니다. 여러 그룹의 비교에는 Sidak의 다중 비교 테스트를 통한 분산 분석이 사용되었습니다. 데이터는 GraphPad Prism(V.8.0)을 사용하여 분석되었습니다.

환자 및 대중 참여(PPI) 선언문

이 연구는 MASTERPLANS 컨소시엄의 일부였으며 환자 협력자들은 이 연구를 포함한 모든 작업에 참여했습니다. PPI는 더 넓은 환자 커뮤니티에 대한 추가 참여를 허용하기 위해 용어집을 제작했으며 연구 결과는 일반 검토일에 포함되었습니다. 출판물에 대한 일반 리뷰는 MASTERPLANS 웹사이트(https://sites.manchester.ac.uk/masterplans)에서 공유됩니다.

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