In Silico 기반 한약의 시너지 약물 조합: Cistanche Tubulosa-II를 사용한 사례
Apr 09, 2024
신경보호 모듈
신경보호는 급성 장애(예: 뇌졸중 또는 신경계 손상/외상) 또는 만성 신경퇴행성 질환(예: 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증)의 결과로 인한 CNS의 신경 손상 또는 변성을 방지하기 위해 사용되는 메커니즘 및 전략입니다. 신경보호의 목표는 중추신경계 손상 후 신경 기능 장애/사망을 제한하고 최고 수준을 유지하려고 시도하는 것입니다.
방해받지 않는 신경 기능을 초래하는 뇌의 세포 상호 작용의 무결성 가능성. 그림 4에서 볼 수 있듯이 세로토닌성 시냅스 경로의 일부 표적은 신경 보호 기능에 관여합니다. 예를 들어, PTGS1 및 PTGS2(COX-1 및 COX-2라고도 함)를 통한 프로스타글란딘 생산은 항염증 및 새로운 프로-해결 메커니즘을 유발하는 데 필수적인 중재자입니다56. 최근 연구에 따르면 cAMP57 생성을 촉매하는 효소인 ADCY5의 유전자 발현은 COX{10}}유발 인간 HCC 세포주에서 프로모터 메틸화에 의해 감소되는 것으로 나타났습니다58. 위의 분석을 바탕으로 우리는 COX{12}} 축적이 sAPP의 분비, cAMP에 의해 조절되는 -secretase에 의해 절단된 APP의 절단에 영향을 미칠 수 있고 추가로 신경 보호 효과를 발휘할 수 있다고 추측합니다. 우리의 결과는 신경보호가 신경염증 치료에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.
파킨슨병 예방을 위한 천연 시스탄체 투불로사 기능 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
실험적 검증
화합물에 의해 처리된 BV2 소교세포의 생존력
BV2 미세아교세포(8×104 세포/ml)에 4가지 화합물의 혈청이 없는 배양 배지 밀리리터당 37.5~300μM의 농도를 24시간 동안 공급했습니다. 우리는 0.1% 미만의 DMSO를 포함하는 혈청 없이 배양된 대조군의 세포 생존율을 100%로 간주합니다(그림 5(a-d)). 각 그룹의 처방된 용량에서는 유의미한 세포독성이 관찰되지 않았습니다.
시험관 내에서 약물 시너지 효과 및 잠재적인 항염증 효과 검증
실리코에서 얻은 결과를 추가로 평가하기 위해 3개의 시너지 쌍, 즉 이소액티오사이드, 2'-아세틸액티오사이드, 에키나코사이드 및 베르바스코사이드를 포함하는 4개의 화합물을 선택하여 LPS로 처리된 BV2 세포를 사용하여 약물 시너지 효과 및 잠재적인 항염증 효과를 조사합니다. 특히, 예측된 약물 조합의 시너지 효과와 항염증 효과를 확인하기 위해 iNOS 및 COX{4}} 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.
그림 5(e-g)에 표시된 대로 테스트된 BV2 세포주 패널의 iNOS 및 COX-2 단백질 수준이 보고되었습니다. 우리는 isoacteoside 또는 2'-아세틸acteoside 처리에서 BV2 세포의 iNOS와 COX{5}}의 단백질 발현이 서로 다른 용량 수준에서 크게 감소하는 것을 관찰했습니다. 그러나 isoacteoside와 2'-아세틸acteoside의 조합 치료는 염증 인자인 iNOS와 COX-2의 상당한 증가를 유도합니다(그림 5(e)). 그림 5(f)는 다음을 보여줍니다.에키나코사이드 또는 베르바스코사이드 치료, 단일 에이전트로서 iNOS 및 COX-2 표현식이 감소합니다. 또한 예상대로 150 μM 농도의 베르바스코사이드와 함께 에키나코사이드를 처리하면
단백질 발현 수준(iNOS 및 COX-2)은 이 약물 조합의 시너지 항염증 효과를 나타냅니다. 유사하게, 도 5(g)에 나타난 바와 같이, 에키나코사이드와 2'-아세틸액티오사이드의 조합은 75 μM 또는 300 μM의 농도에서 COX-2의 억제에 상당한 시너지 효과를 나타냅니다. 그러나 iNOS의 경우 300μM의 용량에서 조합은 단백질의 현저한 억제를 나타냅니다. 대조적으로, 우리는 75μM 농도의 isoacteoside와 2'-아세틸 액티오사이드 또는 echinacoside와 verbascoside의 조합에 대해 iNOS와 COX-2 모두에 대한 명백한 억제 효과가 없음을 발견했습니다 (보충 그림 2). 다른 쌍을 사용하면 그림 5(e-g)에서 볼 수 있는 150 또는 300μM 용량의 단일 제제에 비해 훨씬 약한 효과를 나타냅니다.
요약하자면, 시험관 내 연구는 잠재적으로 항염증 효과가 있는 약물 조합을 스크리닝하기 위한 추가 정보를 제공하고 인실리코 스크린 전략의 신뢰성을 입증합니다.
신경염증 치료용 천연 CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
논의
신경염증은 대부분의 신경학적, 정신적, 신경발달 질환과 관련되어 있으며, 이는 결과일 뿐만 아니라 병리학의 유발 요인이 될 수 있습니다. 그러나 현재의 신경염증 치료는 대부분 단독요법으로 잘 알려진 부작용으로 인해 제한되고, COX{1}} 억제제는 장기 치료에 반응하여 심혈관 결함을 유발할 수 있으며, TNF 표적 치료는 다음을 통해 감염을 일으킬 수 있습니다. 면역억제. 병용 치료 접근법은 다음과 같은 이점을 통해 복잡한 질병의 치료를 개선하는 데 필수적일 수 있습니다: 대응된 네트워크 견고성 및 우회 보상, 최소한의 인간 독성을 유지하면서 임상 효능 증가, 각 화합물의 복용량 감소. 그러나 시스템 약리학을 기반으로 한 한약에서 유래된 화합물 간의 시너지 약물 조합에 대한 탐색은 화합물의 양이 많을 수 있는 주요 원인으로 인해 제한됩니다.
연구에서 우리는 먼저 63개의 잠재적인 생리 활성 화합물을 얻었습니다.허브 시스탄체 튜불로사, 바람직한 특성을 가진 더 유망한 분자를 선별하는 데 필수적인 예측의 도움으로 추가 분석을 위한 기준(DL이 0.18 이상)을 충족합니다. 63개의 잠재적 생리활성 화합물 중 133개 표적을 데이터베이스에 매핑한 후 신경염증과 관련된 43개 표적을 얻은 다음 예측 표적에 대한 GOBP 클러스터링 분석이 아마도 신경염증 치료에 기여할 수 있습니다. CT 네트워크의 분석 결과, 화합물당 평균 학위는 각각 11.209와 목표당 7.651로 나타났으며, 그 중 38개는 7개 이상의 목표(평균 학위보다 큰)를 조정했습니다. 예를 들어, 7개 표적으로 예측된 에키나코시드(mol41), 9개 표적으로 예측된 베르바스코시드(mol33) 또는 8개 표적으로 예측된 테이블사이드 B(mol57)는 문헌이 증가함에 따라 신경 보호에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
우리는 APP, MAPT(Tau라고도 함), PPARG70, MMP9, MMP2 및 HTR2A(5-HT2A라고도 함), GRIN2B(글루타메이트 이온성 수용체 NMDA 유형 하위 단위 2B) 및 GRIA1과 같은 직접적인 치료 표적을 달성합니다. (글루타메이트 이온성 수용체 AMPA 유형 서브유닛 1) 또는 신경염증 또는 신경계의 다양한 질병과 관련된 PTGS274 또는 NOS275와 같은 하류 잠재적 표적.
화합물-표적-경로 네트워크의 분석은 PEA 알고리즘을 통해 상위 10개 약물 쌍 중 12개 화합물을 표시하며, 이는 43개의 잠재적 표적 및 신경염증과 연결된 경로(예: 칼슘 신호 전달 경로, 신경 활성 리간드-수용체 상호 작용 또는 TNF 신호전달 경로 등. 시스템에서 이러한 예측된 화합물은 특히 신경염증 및 염증성 바이오마커와 관련된 업스트림 단백질뿐만 아니라 다운스트림 경로에도 작용할 수 있습니다. 또한 잠재적으로 항염증 효과가 있는 약물 조합을 스크리닝하기 위한 추가 정보가 제공되며 인실리코 스크린 전략의 신뢰성은 실험적 검증을 통해 검증됩니다. 신경염증 경로는 알츠하이머병 경로, 칼슘 신호전달 경로, GnRH 신호전달 경로, VEGF 신호전달 경로 및 세로토닌성 시냅스로 구성됩니다. 분석 결과는 세포 사멸, 염증 및 신경 보호 모듈이 예시되어 메커니즘을 해독한다는 것을 명확하게 설명했습니다.신경염증 치료를 위한 Cistanche tubeulosa.
신경염증은 결과일 뿐만 아니라 병리를 유발할 수 있는 다양한 신경변성 질환을 수반하므로, 항염증 요법이 유망한 치료 접근법으로 제안됩니다. 실망스럽게도 단일요법의 한계를 깨달았음에도 불구하고 병용요법의 평가와 기본 메커니즘은 여전히 새로운 대체 전략 개발에 있어 주요 과제입니다. 따라서 이 연구는 신경염증에 대한 새로운 치료 기회를 제공할 수 있으며 천연물에서 약물 조합을 발견하는 새로운 길을 열 수 있습니다.
재료 및 방법
화합물 컬렉션
Cistanche tubeulosa의 총 66개 화학 성분은 TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/)76에서 수동으로 수집됩니다. 여기에는 26개의 페닐에타노이드 배당체, 22개의 이리도이드, 4개의 리그난, 7개의 모노테르펜 배당체, 2개의 질소 함유 물질, 벤젠아크릴로일당, 1 스테롤, 1 케톨. 을 고려하면Cistanche tubeulosa의 배당체일반적으로 가수분해되어 아글리콘을 유리시키고 장 점막에 흡수됩니다. 따라서 우리는 글리콜산이 없는 분자를 고려하며 _qt로 태그가 지정됩니다. 이로 인해 103개의 화합물이 생성되었습니다. 이 분자는 보충 표 S1에 제공됩니다.
약물 유사성 평가
Cistanche tubeulosa에서 잠재적인 생리 활성 화합물을 얻기 위해 우리는 Drugbank 데이터베이스에 있는 모든 화학 물질의 평균 분자 특성과 허브 화합물 간의 Tanimoto 유사성을 계산하여 이러한 성분의 약물 유사성을 평가합니다. 그리고 DL 예측 모델은 생리 활성 화합물을 선택하기 위한 많은 연구에서 성공적으로 적용되었습니다. 본 연구에서는 후속 분석에 더 적합하도록 후보의 DL 지수 Greater or equal to 0.18을 임계값으로 정의했습니다.
약물 표적 예측
주요 화합물의 효능 목표를 식별하는 것은 화합물을 약물 개발로 진행시키는 핵심 단계로 남아 있습니다. 여기서는 두 가지 내부 도구인 SysDT와 WES를 사용하여 약물 유출을 위한 분자 표적 정보를 도출합니다. SysDT는 표적 식별 문제를 효과적으로 해결하기 위해 RF(Random Forest)와 SVM(Support Vector Machine)이라는 두 가지 강력한 수학적 도구를 기반으로 화학적, 게놈 및 약리학적 정보를 조합하여 수행되는 단독 모델입니다. 획득된 모델은 전체 정확도 97.3%, 활성화 예측 정확도 87.7%, 억제 예측 정확도 99.8%로 약물-표적 상호 작용 예측을 위한 귀중한 플랫폼 역할을 했습니다. 보다 유망한 구성요소를 포착하기 위해 본 연구에서는 필터링 기준을 0.7 이상의 RF 값 또는 0.8 이상의 SVM으로 정의합니다.
WES(가중 앙상블 유사성)는 실제 생리 활성 성분에 대한 약물의 직접적인 목표를 정확히 찾아내는 새롭고 강력한 계산 모델입니다. 새로운 도구로서, 획득된 모델은 수신기 작동 곡선(ROC, AUC) 아래 평균 영역을 사용하여 평균 민감도 85%(SEN)의 결합과 71%(SPE)의 비결합 패턴을 예측하는 데 효과적입니다. 85.2%, 평균 일치도는 77.5%입니다. 획득된 표적은 이후에 이름과 유기체를 정규화하기 위해 Uniprot에 추가로 매핑됩니다. 여기서는 추가 분석을 위해 호모 사피엔스의 표적만 선택합니다. 선택된 화합물의 후보 표적은 CTD 데이터베이스에 매핑되어 관련 질병을 얻고 최종적으로 신경염증과 관련된 잠재적 표적을 선별합니다.
GO 대상 강화 및 분석
획득된 표적의 관련된 생물학적 과정을 조사하기 위해 표적을 DAVID에 매핑하고 이 섹션에서는 P-값이 0.05보다 작은 용어를 선택합니다.
약물 조합 분석
이전 연구에서는 약물 조합의 임상 효능과 부작용을 분석하기 위해 PEA(Probability Ensemble Approach)라는 새로 설계된 모델에서 약물 조합을 예측하기 위해 시스템 약리학 프레임워크를 활용했습니다. 구체적으로, 유사성 알고리즘과 통합된 베이지안 네트워크를 개발하여 화합물 분자 및 약리학적 효과의 조합을 모델링했습니다. 예측된 쌍에 대한 임상적 효능과 부작용을 다루는 통합 평가가 제시되었습니다. 간단히 말하면 PEA가 우리 연구에서 높은 특이성과 민감도(AUC=0.90)로 쌍의 효능을 예측할 수 있음을 보여줍니다. 본 연구에서는 두 화합물 간의 시너지 유도 가능성을 나타내는 시너지 확률을 기준으로 상위 10개 약물 조합을 선택합니다.
네트워크/경로 구축 및 분석
활성 성분과 염증성 질환 사이의 관계를 조사하기 위해 생물학적 네트워크 시각화 및 데이터 통합을 위한 인기 있는 생물정보학 패키지인 Cytoscape 2.8.1을 사용하여 화합물-표적(CT) 네트워크와 화합물-표적-경로 네트워크(CTP)를 생성했습니다. 네트워크의 정량적 속성은 다음 두 플러그인 Network Analyser 및 CentiScaPe 1.2에 의해 분석됩니다. 그래픽 네트워크에서 노드는 화합물, 표적 또는 경로를 나타내고 가장자리는 약물-표적 상호 작용을 인코딩합니다. 다중 대사 경로 조절을 통해 세포 표적이 작동하는 방식의 생물학적 효과를 더 자세히 조사하기 위해 통합된 "경로"가 신경염증 병리학에 대한 최신 정보로 구성됩니다. 첫째, 이를 KEGG 데이터베이스에 매핑하여 달성된 목표 프로필을 여러 경로로 집계합니다. 간접 섹션을 버리고 병리학적 및 임상적 데이터를 고려하여 상대적으로 합성된 경로를 수동으로 통합합니다.
파킨슨병 치료를 위한 천연 CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
실험적 검증
샘플 준비
에키나코사이드, 베르바스코사이드, 이소액티오사이드 및 2'-아세틸액티오사이드Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd.(중국 장쑤성 난징)에서 구입합니다. 시험 시료를 DMSO(DMSO)(Sigma, USA)에 용해하여 원액으로 100mM을 얻은 후 4도에서 보관합니다. 배양 배지에 첨가된 DMSO의 최종 희석은 0.1%를 초과하지 않았으며 이는 세포 생존력에 영향을 미치지 않음을 보장합니다.
세포 배양
BV2 마우스 미세아교세포는 원래 중국과학원 상하이 세포 은행에서 개발되었으며 10% 소태아혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM/25mM HEPES)(Gibco BRL, USA)를 사용하여 25 또는 75cm2 작업으로 배양되었습니다. (Gibco BRL, USA), 페니실린 G(100 단위/mL) 및 스트렙토마이신(100mg/mL)을 37도에서 5% CO2/95% O2가 있는 가습 인큐베이터에 넣습니다.
세포 생존력 분석
BV2 미세아교세포를 1×105개 세포/ml의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고, 18시간 동안 배양한 후, 세포를 다양한 지시 농도의 테스트 샘플이 포함되거나 포함되지 않은 100ul의 신선한 배지로 처리합니다. 24시간 추가. CCK-8 분석(BestBio, Shanghai, China)은 세포의 생존 가능성을 결정하는 편리하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 테스트 샘플의 배경을 제거하기 위해 전체 배양 배지를 폐기한 후 10% CCK-8 용액을 포함하는 100ul/well의 신선한 배지를 추가합니다. 450nm에서의 OD 값은 37도 및 5% CO2에서 3시간 배양한 후 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, California, USA)에서 읽습니다.
웨스턴 블롯 분석
제조사의 프로토콜에 따라 지시된 절차 후에 Qproteome™ Mammalian Protein Prep Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 세포주로부터 세포 단백질을 추출합니다. 단백질 정량에는 Quick Stari Bradford Protein Assay Kit(Bio-Rad, USA)를 사용합니다. 동일한 양의 단백질(50ug)을 2*laemmli 샘플 로딩 완충액(Bio-Rad, USA)과 5% -머캅토에탄올(1:1 비율)을 사용하여 100도에서 10분 동안 끓여서 변성시켰습니다. 레인당 12% SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 미니겔)에 로드하고 200mA에서 150분 동안 0.45μm 폴리비닐리덴 푸오라이드 막(PDVF)(Millipore, Bedford, MA, USA)에 전기 전달했습니다. 이어서, 막을 실온에서 3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하고 1차 항체 iNOS 및 COX-2(Abcam)과 함께 밤새 4도에서 배양합니다. TBST(Tris-buffered Saline-Tween)에서 각각 5분간 3회 철저하게 세척한 후, HRP(양고추냉이 퍼옥시다제) 결합 2차 항체(1:10000 희석, Abcam)로 실온에서 1.5시간 동안 막을 탐침합니다. 그런 다음, 면역반응 밴드를 TBST에서 2회, TBS에서 1회(매회 5분 동안) 세척한 후 ECL 화학발광 검출 키트(Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA)를 사용하여 시각화합니다. 농도계 값은 내부 통제를 로드하는 데 -actin을 사용하여 정규화됩니다.
통계 분석
데이터는 평균±표준오차로 제시되었으며, 웨스턴 블롯 분석은 세 번의 독립적인 실험에서 반복되어 동일한 결과를 얻었습니다. 일원 분산 분석은 세 개 이상의 그룹에 대한 평균 차이를 비교하는 데 사용되며 통계적 유의성은 두 그룹 간의 스튜던트 t-테스트를 통해 분석됩니다.
파킨슨병 및 알츠하이머병 치료용 천연 CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
