RPTEC/TERT1 인간 신장 세포 모델을 사용한 P‑gp 매개 약물-약물 상호작용의 시험관 내 평가
Mar 01, 2022
소개 P-당단백질(P-gp) 억제 가능성의 시험관 내 평가는 임상적으로 관련된 약물-약물 상호작용(DDI)을 예측할 수 있기 때문에 약물 개발 과정에서 중요한 문제입니다[1-3]. P-gp는 ATP 결합 카세트(ABC) 수송체 슈퍼패밀리에 속하며 다제 내성 유전자 MDR1(ABCB1이라고도 함)에 의해 암호화됩니다. 이 막 수송체는 종양 세포에서 과발현되어 많은 항암제에 대한 내성을 유발하는 것으로 알려져 있다[4]. 장, 간, 장을 포함한 모든 생리적 장벽 내에 위치신장, P-gp는 소화관에서 이러한 기질의 흡수를 제한하고 담즙과 소변으로의 유출을 촉진하여 생체이물로부터 보호합니다. 따라서 P-gp는 다양한 치료 클래스의 약동학에서 주목할만한 역할을 합니다[5-7]. 항암제, 항진균제, 심혈관계 약물과 같은 과다한 약물은 P-gp 기질 및/또는 억제제로 알려져 있으며, 이들 중 다수는 임상적으로 관련된 상호작용에 관여합니다[8-10]. 따라서 미국 식품의약국(FDA)은 약물 개발 초기 단계에서 P-gp 억제 가능성을 평가해야 한다고 규정하고 있습니다. 이 목적을 위해 수행된 시험관내 분석은 일반적으로 P-gp-발현 세포주를 사용한 약물 수송 연구를 기반으로 합니다. 보다 정확하게는 FDA 가이드라인은 P-gp 억제로 인한 임상 DDI의 위험을 평가하기 위해 시험관 내 최대 억제 농도(IC50) 값의 결정을 권장합니다. 이를 위해 많은 실험 분석이 수행되었으며 대부분 Caco{12}} 또는 MDCK-MDR1 모델을 사용하여 장 흡수와 관련된 약물 상호 작용에 중점을 두었습니다[11-13].
CISTANCHE는 신장/신장 질환을 개선할 것입니다
부터신장제거는 또한 다양한 종류의 약물에 대한 일반적인 제거 경로이며 ABC 수송체를 통한 활성 세뇨관 분비도 이러한 상호 작용에서 중요한 역할을 할 수 있습니다[14]. 그러나 체외 데이터에 대한신장P-gp에 의해 매개되는 DDI는 제한적입니다. 이는 부분적으로 예측을 위한 시험관 내 모델의 개발 및 특성화가 부족하기 때문입니다.신장마약 수송. 다양한 인간 세포주 중에서 RPTEC/TERT1 모델은신장약물 상호 작용. 이 세포주는 건강한 인간 기증자로부터 유래되었으며 불멸화된 근위 세뇨관 세포에서 생성되었습니다. 또한, 이 모델을 사용하여 P-gp의 표현과 기능이 입증되어 예측 능력이 확인되었습니다.신장약물 유출 [15, 16]. 이러한 맥락에서, 본 연구는 RPTEC/TERT1 모델을 사용하여 P-gp 억제 가능성을 조사하기 위해 설계되었습니다. 먼저, 로다민 123(R123) 축적 스크리닝 분석을 수행하여 각 시험 약물에 대한 억제 프로파일을 얻었다. 이 스크리닝을 기반으로 2개의 P-gp 기질 약물인 apixaban 및 rivaroxaban의 세포 내 축적에 대한 농도 의존적 영향을 평가하기 위해 4가지 약물이 선택되었습니다.
키워드:신장 세포, 신장 모델, 신장 약물, 신장 제거, 신장.
재료 및 방법
시약Apixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri var oxa ban ,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin 및 dabigatran etexilate에서 구입했습니다. 프랑스). Verapamil, ketoconazole, simvastatin, amiodarone, rhodamine 123, Hank's 균형 염 용액(HBSS) 및 HEPES 용액은 Sigma-Aldrich(Saint-Quentin-Fallavier, France)에서 구입했습니다.
세포 배양 RPTEC/TERT1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Molsheim, France)에서 얻었고 성장 인자 키트(ATCC) 및 1% 항생제/항진균제 혼합물(페니실린-스트렙토마이신, 암포테리신 B), 37도 및 5% CO 2. 모든 실험에서 세포는 96-웰 플레이트에 밀도 50000으로 파종되었습니다. 웰당 세포를 사용하였고 14일 배양 후 성장에 사용하였다. 배지는 2일마다 갱신되었고 세포는 계대 27부터 계대 34까지 사용되었습니다. Caco{14}} 세포도 ATCC에서 구입했습니다. 세포는 10% FBS, 1% 비필수 아미노산 및 1% 항생제/항진균 혼합물(페니실린-스트렙토마이신, 암포테리신 B)이 보충된 Eagle's Minimal Essential Medium(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)으로 구성된 배양 배지에서 유지되었습니다. ) 37도 및 5% CO2에서. Caco-2 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5 × 10 3 세포의 밀도로 파종하고 14일 배양 후 성장에 사용했습니다. 인간 근위 세뇨관 상피 세포(HPTECs)는 BIOPREDIC(Rennes, France)에서 입수하고 하이드로코르티손, EGF, 인슐린, 트랜스페린 및 나트륨 셀레나이트가 보충된 DMEM/F12에서 배양하였다. 세포를 웰당 6600개 세포의 밀도로 {{27}웰 콜라겐 코팅된 배양 플레이트에 파종하고 배양 11일 후에 성장하는 데 사용했습니다.
로다민 123 축적 스크리닝 분석 P-gp 억제 가능성은 다양한 종류의 약물의 존재 및 부재 하에 RPTEC/TERT1 세포에서 로다민 123의 세포내 축적을 측정하여 결정되었습니다. 14개의 시험된 약물 중 사이클로스포린 A(10μM), 케토코나졸(50μM), 베라파밀(100μM) 및 아미오다론(50μM)이 P-gp 억제제로 사용되었습니다. Apixaban, rivaroxaban 및 dabigatran etexilate(3가지 직접 경구 항응고제(DOAC))가 P-gp 기질(10μM)로 사용되었습니다. 비억제제로 와파린(50μM)을 사용하였고, 10μM 농도에서 nilotinib, crizotinib, erlotinib, idelalisib 등 5가지 항암제를 그들의 억제 특성을 모른 채 사용하였다. FDA의 약물 수송 연구 승인을 받은 Caco{14}} 세포로 여러 조건이 재현되었습니다. 이러한 방식으로 로다민 123의 세포 내 체류는 베라파밀(100μM), 사이클로스포린 A(10μM), 닐로티닙(10μM) 및 DOAC(10μM)의 존재 및 부재하에 Caco{16}} 세포에서 결정되었습니다. ). 간단히 말해서, 96-웰플레이트에서 14일 동안 배양한 후, 세포를 10mM HEPES(v/v)가 포함된 HBSS에 용해된 각 약물과 함께 37도에서 10분 동안 사전 인큐베이션했습니다. 그런 다음 세포를 37도에서 45분 동안 10μM 로다민 123과 함께 배양했습니다. 마지막으로, 차가운 HBSS/HEPES 용액으로 3회 세척한 후, 세포를 1% 붕산나트륨을 함유하는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 용액에서 45분 동안 실온에서 용해시켰다. Infnite M nanospectrofuorometer(Life Sciences, TECAN, Switzerland)를 사용하여 세포내로다민 123의 양을 정량화하여 파장을 485/535 nm로 설정했습니다. 데이터는 잠재적인 P-gp 억제제에 노출되지 않고 임의로 100% 축적으로 설정된 대조군 세포에서 로다민 123 축적의 백분율로 표시되었습니다.
DOAC 세포내 축적 분석 및 IC50 측정 이전 로다민 123 스크리닝 분석에서 RPTEC/TERT1 세포에서 apixaban 및 rivaroxaban(1{16}} µM)의 세포 내 축적에 대한 농도 의존적 영향을 조사하기 위해 4가지 약물이 선택되었습니다. 케토코나졸, 크리조티닙 및 닐로티닙은 P-gp 억제제로 선택되었고 와파린은 비억제제로 선택되었습니다. Cyclosporin A(1{19}} µM)는 광범위한 수송체 억제제로 사용되었습니다. IC5{31}} 값을 결정하기 위한 DOAC와 nilotinib 간의 상호작용에 대한 연구는 두 세포 모델을 비교하기 위해 Caco{9}} 세포에서 재현되었습니다. 모든 화합물은 단독으로 또는 1% HEPES(v/v) 및 1% DMSO(v/v)가 보충된 HBSS 수송 완충제에서 관련 억제제와 함께 희석되었습니다. 인큐베이션 전에 모든 용액을 37도로 예열하고 pH를 7.4로 조정했습니다. 항암제인 크리조티닙과 닐로티닙의 경우 용해도가 낮고 세포독성 가능성이 있기 때문에 농도 범위는 0.1~25μM입니다. 케토코나졸과 와파린의 농도 범위는 0.1~100μM입니다. 간단히 말해서, 배양 14일 후, 1% HEPES(v/v)가 포함된 HBSS에 용해된 모든 약물을 37도에서 10분 동안 사전 인큐베이션했습니다. 그 다음, 세포를 37도에서 60분 동안 10 μM의 아픽사반 또는 리바록사반과 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로 차가운 HBSS/HEPES 용액으로 세 번 세척한 후 세포를 실온에서 45분 동안 Triton X-100의 0.2% 용액에서 용해했습니다. 그런 다음 세포 내 DOAC의 양을 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)으로 정량화했습니다. 데이터는 DOAC 축적의 백분율 증가로 표현되었으며 DOAC 세포내 축적은 대조군 세포에서 임의로 100%로 설정되었습니다. DOAC 축적 증가에 대한 EC50 값의 절반에 해당하는 P-gp 활성 억제에 대한 IC50 값은 R의 'nls()' 함수를 사용하여 증가된 축적의 가중되지 않은 비선형 최소 자승 회귀 모델링에서 결정되었습니다. 다음 방정식(Eq. 1)에 따라 소프트웨어:
액체 크로마토그래피-질량 분석법 분석apixaban(m/z 460.19793) 및 rivaroxaban(m/z 436.{13}}7285)의 정량은 Ultimate U300{{18 }} Q-Exactive Plus 질량 분석기(ThermoFisher, Bremen, Germany)와 결합된 액체 크로마토그래피 시스템(Dionex, Sunnyvale, CA, USA). LC 분리는 Hypersil Gold C18(3 µm, 5{21}} × 2.1 mm) 분석 컬럼(ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA)과 0.6 mL/min의 유속을 사용하여 이루어졌습니다. . 이동상 A는 0.1% 포름산(FA)을 포함하는 물이고 이동상 B는 0.1% FA를 포함하는 아세토니트릴입니다. 리바록사반의 경우 기울기는 0-0.3분, 10% B; 0.3–1분, 10%에서 70% B까지 선형; 1-1.5분, 70% B; 1.51분, 3분까지 시작 조건으로 돌아갑니다. 아픽사반의 경우 기울기는 0–0.3분, 10% B; 0.3~0.7분, 10~90% B에서 선형; 0.7–1.5, 90% B; 1.51분, 3분까지 시작 조건으로 돌아갑니다. 검출은 분해능 35,{53}}(m/z 200에서)에서 전자분무 양성 병렬 반응 모니터링(PRM) 모드에서 수행되었습니다. 내부 표준(IS)은 아픽사반의 경우 [13C,2H7]-아픽사반(m/z 468.2452)이고 리바록사반의 경우 [ 13C6]-리바록사반(m/z 442.09297)이었습니다. 각 약물 및 해당 IS에 대해 표적 이온(정량화용) 및 확인 이온을 모니터링했습니다. 리바록사반과 그 IS의 경우 목표 이온은 m/z 144.95125이고 확인 이온은 각각 m/z 231.11280 및 m/z 237.13298입니다. apixaban 및 해당 IS의 경우 표적 이온은 m/z 199.08656이었고 확인 이온은 각각 m/z 282.12387 및 m/z 241.06062였습니다.
결과
로다민 123 축적 스크리닝 분석로다민 123 축적 스크리닝 분석은 RPTEC/TERT1 세포에서 다양한 억제 프로필을 가진 14개의 약물로 수행되었습니다(그림 1). 예상대로, 광범위한 스펙트럼 억제제인 사이클로스포린 A의 존재 하에서 로다민 123의 세포내 축적이 가장 높았으며 대조군에 비해 축적이 75% 증가했습니다. 특정 P-gp 억제제인 베라파밀의 존재는 로다민 123의 축적을 57% 증가시켰으며, 이는 P-gp의 관련성을 입증합니다. 같은 방식으로 강력한 P-gp 억제제로 설명되는 케토코나졸은 베라파밀에 비해 로다민 123의 세포 내 축적이 더 크게(66%) 증가하여 억제 프로필을 확인했습니다. 반대로 중등도의 P-gp 억제제인 amiodarone을 추가하면 축적량이 59% 증가했는데 이는 verapamil과 유사한 수준입니다. 항암제 nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib 및 idelalisib에 대해 다양한 억제 프로필이 관찰되었습니다. nilotinib의 추가는 로다민 123(71%)의 축적을 크게 증가시켜 상당한 억제 가능성을 시사했으며, 그 다음으로 axitinib이 57%의 체류 증가를 야기했습니다. 반면 crizotinib과 erlotinib은 로다민 123 축적이 각각 23%와 16% 증가하여 중등도에서 낮은 억제 잠재력을 보였다. Idelalisib은 로다민 123의 축적에 영향을 미치지 않았습니다. 와파린도 마찬가지였다.
비억제제로 선정되었습니다. 세 가지 DOAC 중에서 apixaban과 rivaroxaban은 각각 로다민 123의 유지율을 33%와 12%로 약간 증가시켰습니다. 흥미롭게도, 다비가트란의 전구약물이자 P-gp의 알려진 기질인 다비가트란 에텍실레이트는 잠재적인 P-gp 억제제로 기술되지는 않았지만 약 50%의 로다민 123의 보유를 증가시켰습니다. 마지막으로 심바스타틴의 첨가는 형광 기질의 축적을 약간만 증가시켰습니다(32%). 이 스크리닝을 기반으로 RPTEC/TERT1 모델 내에서 아픽사반 및 리바록사반의 세포내 축적에 대한 농도 의존적 효과를 평가하기 위해 4가지 약물이 선택되었습니다. 케토코나졸은 P-gp 억제에 대한 양성 대조군 조건으로 선택되었고 와파린은 음성 대조군 조건에 대해 P-gp의 비억제제로 선택되었습니다. Nilotinib과 crizotinib은 각각 강력한 P-gp 억제제와 중간 정도의 P-gp 억제제로 선택되었습니다. 참조 모델인 Caco{15}}로 여러 조건이 재현되었습니다. 세포 내 R123의 세포내 축적은 억제를 위한 대조군 조건에서 아픽사반 및 리바록사반(10μM), 닐로티닙(10μM), 사이클로스포린 A(10μM) 및 베라파밀(100μM)과의 조합 후(또는 그렇지 않은 경우) 결정되었습니다. (그림 2A). 예상대로 베라파밀과 사이클로스포린 A는 각각 297%와 275%의 높은 R123 체류 증가를 일으켰습니다. 같은 방식으로 nilotinib은 R123의 세포 내 축적을 크게 증가(229%)하여 억제 가능성을 확인했습니다. R123을 DOAC와 결합하면 다른 약물에 비해 R123 축적이 약간 증가했습니다(40-44%). 더욱이, 사이클로스포린 A의 부재 및 존재하에 로다민 123의 세포내 축적신장RPTEC/TERT1 세포로 얻은 결과의 신뢰성을 확인하기 위해 이 연구에서 1차 인간 세포도 조사했습니다(그림 2B). 이러한 분석은 사이클로스포린 A의 존재가 R123 체류를 71%까지 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 값은 RPTEC/TERT1 세포와 동일한 조건에서 얻은 값에 가깝습니다(사이클로스포린 A의 경우 75% 증가). 따라서, P-당단백질 활성은 RPTEC/TERT1 모델 및 1차 인간 세포에서 유사하였다.
DOAC 세포내 축적 분석: IC50 및 I1/IC50 비율 측정 세포 내 축적 연구를 수행하여 시험관 내 RPTEC/TERT1 세포에서 1{8}} µM의 일정한 농도에서 아픽사반과 리바록사반의 P-gp 매개 수송을 평가하고 증가하는 농도의 nilotinib, crizotinib, ketoconazole이 존재합니다. , 및 와파린(그림 2, 3). 증가된 아픽사반 및 리바록사반 유지의 모델링을 평가하여 IC50 값을 결정했습니다. DOAC와 nilotinib을 결합하면 가장 낮은 IC50 값이 나타났습니다(리바록사반 및 아픽사반의 경우 각각 0.85μM 및 1.37μM)(그림 4, 5). crizotinib과의 조합은 rivaroxaban과 apixaban에 대해 각각 10.1μM 및 12.2μM의 IC50 값을 산출했습니다. 놀랍게도 DOAC와 케토 코나졸을 결합하면 가장 낮은 IC50 값이 생성되지 않았습니다(리바록사반 및 아픽사반의 경우 각각 16.5μM 및 16.9μM). 마지막으로 예상대로 와파린과의 조합으로
비억제제로 선택된 두 DOAC의 세포내 체류에 영향을 미치지 않았습니다. 따라서 증가하는 농도의 nilotinib이 있는 경우 Caco{1}} 세포 내 아픽사반과 리바록사반의 세포 내 축적을 세포 모델과의 비교를 위해 조사했습니다. 흥미롭게도 RPTEC/TERT1 모델에서 관찰된 바와 같이 rivaroxaban(4.16μM)의 IC5{16}} 값은 apixaban(9.35μM)에 대해 얻은 값보다 낮았습니다. Caco-2 세포에서 관찰된 IC5{24}} 값이 동일한 억제제에 대해 RPTEC/TERT1 세포에서 얻은 값보다 높다는 점도 흥미롭습니다. DDI의 임상적 관련성은 시험관 내 데이터에서 예측할 수 있습니다. FDA 가이드라인에 따라 각 약물 조합에 대해 [I1]/IC5{30}} 비율이 계산되었습니다. 이 비율은 생체 내 농도가 시험관 내 관련 효과를 생성하는 것으로 알려진 농도와 비교할 수 있도록 합니다. RPTEC/TERT1 세포에서 아픽사반의 경우 비율은 닐로티닙, 크리조티닙 및 케토코나졸에서 각각 3.1, 0.06 및 17.4였습니다(표 1). Caco{21}} 세포에서 아픽사반과 닐로티닙 간의 상호작용에 대한 [I1]/IC50 비율은 0.46이었습니다(표 1). rivaroxaban의 경우 RPTEC/TERT1 세포에서 apixaban에 대해 얻은 비율보다 약간 더 높았습니다(nilotinib, crizotinib 및 ketoconazole의 경우 각각 5.1, 0.08 및 17.7)(표 2). 같은 방식으로 Caco{37}} 세포에서 rivaroxaban과 nilotinib 사이의 상호작용에서 관찰된 [I1]/IC50 비율은 apixaban에서 얻은 것보다 높은 1.03이었습니다(표 2).
논의
최근 수십 년 동안 수행된 수많은 연구에서 약물 약동학에서 P-gp의 주목할만한 역할이 보고되었습니다[17-19]. P-gp에 의해 매개되는 약물 상호작용에 대한 규제적 관심 증가의 관점에서, 약물의 억제 가능성을 조사하기 위한 시험관내 분석은 약물 개발 및 임상 실습의 중요한 측면입니다. 이를 위해 많은 시험관 내 분석이 수행되었으며 예측된 장 흡수에 대한 관련 데이터의 대부분은 Caco{4}} 및 MDCK-MDR1 세포주에서 생성되었습니다[20-22]. 그러나 약물의 활성 세뇨관 분비에 대한 데이터는 거의 없으며 약물 처리에 중요한 역할을 하고 ABC 수송체의 존재에 의존합니다. 이 관찰은 특성화의 부족과 분명히 관련이 있습니다.신장약물 예측을 위한 세포주신장유출. 이 목표는 시험관 내신장생리학적 장벽을 밀접하게 모방한 모델. 여러 ABC 수송체(특히 P-gp)를 발현하는 인간 세포주 RPTEC/TERT1은 이전 연구에서 입증된 바와 같이 좋은 대안으로 보입니다[16]. 이러한 맥락에서, 현재 작업은 P-gp 억제 가능성을 평가하기 위해 RPTEC/TERT1 모델의 적용을 조사했습니다. 우리가 아는 한, 이 작업은 인간을 사용한 P-gp 억제 연구의 데이터를 제공하는 최초의 작업입니다.신장세포.
P-gp 억제 가능성을 결정하기 위한 시험관 내 분석은 일반적으로 digoxin 또는 rhodamine과 같은 특정 참조 P-gp 기질의 사용을 기반으로 합니다[23-25]. 사용하기 쉽기 때문에 형광 프로브는 고처리량 분석에 유리합니다. 또한, 로다민 123은 광범위한 연구에서 P-gp 활성 검출에 널리 적용되었습니다[26-28]. 이러한 방식으로, RPTEC/TERT1 세포에서 로다민 123 축적의 분석은 14개 약물의 억제 프로파일을 확인하기 위해 이 연구에서 수행되었습니다. 이 중 cyclosporin A, ketoconazole, verapamil이 강력한 P-gp 억제제로 선택되었습니다. 이러한 억제제는 digoxin과 rhodamine 123 수송을 모두 조절하는 상당한 P-gp 억제 가능성으로 광범위하게 특성화되었습니다[27, 29, 30]. 예상대로 이 약물은 RPTEC/TERT1 세포에서 가장 높은 로다민 123 보유를 유발했습니다. 대조적으로, 음성 대조군으로 사용된 와파린에서는 R123의 머무름의 증가가 관찰되지 않아 RPTEC/TERT1 모델의 신뢰성을 확인시켜줍니다. 흥미롭게도, 시험된 모든 약물 중에서 dabigatran etexilate, apixaban 및 rivaroxaban을 포함한 DOAC는 이전에 억제제로 특성화되지 않았음에도 불구하고 P-gp 기질 [31, 32]에만 R123의 체류를 뚜렷하게 증가시켰습니다. 이러한 관찰은 약물이 P-gp의 동일한 결합 부위와 상호작용할 수 있는 소위 "경쟁적" 억제의 존재로 인한 것일 수 있습니다. P-gp에 대한 가장 잘 특성화된 부위는 H 부위(Hoechst 33342 결합용) 및 R 부위(로다민 123 결합용)입니다. 그러나 여러 다른 알려지지 않은 약물 결합 부위가 이러한 상호작용에서 역할을 할 수 있으며, 이는 R123의 축적에 대한 DOAC의 다양한 효과를 설명할 수 있습니다[33, 34]. 따라서 주어진 약물에 대해 관찰된 P-gp 억제는 시험관 내 연구 동안 사용된 기질에 따라 다릅니다[28, 35]. 따라서 다른 약물 결합 부위와 상호작용하는 다른 P-gp 기질의 사용은 약물의 추정 P-gp 억제 효능을 정확하게 설명하기 위해 고려되어야 합니다. 약물 수송 연구에서 RPTEC/TERT1 세포를 참조 모델과 비교하기 위해 로다민 123 스크리닝의 여러 조건이 Caco{44}} 세포에서도 수행되었다는 사실에 주목하는 것도 흥미롭습니다. 예상대로 사이클로스포린 A, 베라파밀 및 닐로티닙은 로다민 보유량을 가장 많이 증가시켰습니다. Caco{46}} 및 RPTEC/TERT1 세포 모두에서 동일한 억제 프로필이 관찰되었습니다. 그러나 Caco{49}} 모델에서 상호작용에 의해 생성된 로다민 123 보유의 증가가 RPTEC/TERT1 세포에서 관찰된 것보다 더 커서 모델 간에 P-당단백질의 발현에 잠재적인 차이가 있음을 시사합니다. 따라서 현재 연구에서 두 번째 방법은 약물에 의한 P-gp의 잠재적 억제를 평가하고 확인하는 데 사용되었습니다.
CISTANCHE는 신장/신장 투석을 개선할 것입니다
로다민 123 축적 분석에 기초하여, 아픽사반과 리바록사반의 세포내 축적에 대한 농도 의존적 효과를 결정하기 위해 4가지 약물이 선택되었습니다. P-gp는 apixaban과 rivaroxaban의 방출에 주요 역할을 하는 것으로 나타났습니다[32, 36]. 따라서 nilotinib, crizotinib 및 ketoconazole의 IC50 값을 평가했으며 DOAC를 "피해자" 약물로 선택했습니다. 우리가 아는 한, 이 연구는 인간에서 DOAC를 사용한 세포 내 축적 연구를 수행한 최초의 연구입니다.신장세포. nilotinib 및 crizotinib에 대해 얻은 IC50 값은 로다민 123 축적 분석에서 얻은 억제 프로필에 따랐습니다. R123의 머무름을 크게 증가시킨 Nilotinib은 두 DOAC에 대해 가장 낮은 IC50 값을 나타내어 높은 억제 가능성을 확인했습니다. 이 결과는 MDR{7}} 형질감염된 세포에서 [3H]-파클리탁셀의 세포내 축적이 농도 의존적으로 증가한다는 이전 연구와도 일치하며, 이는 억제제 프로파일이 있음을 시사합니다[37]. crizotinib의 경우, R123 분석은 nilotinib에 의한 것보다 R123 체류의 증가가 적은 중간 정도의 억제 가능성을 보여주었습니다. 이 관찰은 crizotinib이 MDR 형질감염된 세포에서 R123과 독소루비신의 세포내 축적을 증가시킨 이전 연구에 의해 뒷받침됩니다[38]. 이 결과는 또한 DOAC로 결정된 IC50 값과 일치하며, 이는 닐로티닙에 대한 해당 값보다 높았으며, 이는 중등도 억제 프로파일을 확인합니다. 그러나 nilotinib 또는 crizotinib의 10μM 농도가 로다민 123 및 DOAC의 보유에서 동일한 증가를 일으키지 않았다는 점은 흥미롭습니다. 로다민 스크리닝에서 nilotinib은 기질의 보유를 약 71% 증가시켰지만 DOAC의 경우 약 40% 증가했습니다. 대조적으로, crizotinib은 동일한 농도에서 로다민의 보유(23%)에서 약간의 증가를 일으켰지만 DOAC의 보유(약 50%)에서 더 큰 증가를 일으켰습니다. 이전에 논의된 바와 같이, 이 관찰은 P-gp의 결합 부위의 차이로 설명될 수 있습니다. 많은 약물이 R 결합 부위(로다민 123이 결합하는 위치)보다는 H 결합 부위와 상호작용하고 경쟁하며, 그 반대도 마찬가지인 것으로 알려져 있습니다[39]. 흥미롭게도 강력한 P-gp 억제제로 알려진 케토코나졸은 닐로티닙보다 로다민 123의 유지 증가를 약간 더 작게 만들었습니다(각각 66% 대 71%). 그럼에도 불구하고 ketoconazole의 존재로 인해 R123 축적이 60% 증가하는 Caco{28}} 세포에서 유사한 값이 관찰되었습니다[40]. IC50 값을 결정하기 위한 DOAC의 세포내 축적은 또한 nilotinib 및 crizotinib에 비해 더 높은 값을 보여주었습니다. 흥미롭게도 디곡신을 P-gp 기질로 사용하는 LLC-PK1 또는 Caco{36}} 모델에서 발견된 대부분의 IC50 값은 케토코나졸의 경우 3~4μM 사이였습니다[41, 42]. 이 값은 현재 연구에서 발견된 값과 상당히 다릅니다(각각 apixaban 및 rivaroxaban의 경우 16.5μM 및 16.9μM). 이 관찰은 사용된 기질과 모델의 선택이 P-gp 억제 가능성을 결정할 때 결정적인 영향을 미친다는 것을 확인시켜줍니다. 또한 최근 연구에서는 체외 세포 모델에서 ABC 수송체의 발현 수준이 약물 수송 분석에 영향을 미치므로 P-gp와 관련된 DDI 평가에 영향을 미친다고 보고했습니다[43]. 실제로 rivaroxaban을 P-gp 기질로 사용하여 verapamil의 IC50 값을 측정한 결과 MDCKMDR1과 Caco{53}} 세포 모델 간의 이질성이 나타났으며 IC50 값은 각각 6.94μM 및 21.2μM이었습니다[43]. 또한 이 연구에서 Caco{61} 세포에서 apixaban과 rivaroxaban의 세포 내 축적에 대한 nilotinib의 농도 의존적 영향도 조사되었습니다. 흥미롭게도 nilotinib의 IC50 값은 RPTEC/TERT1 세포보다 Caco{63}} 세포에서 상당히 높았습니다. 이 관찰은 이러한 모델 간의 P-gp 표현의 차이로 설명할 수 있습니다. 또한, P-gp 분포는 고려되는 조직에 의존하는 것으로 알려져 있습니다. Fallon et al. P-gp의 수준이 더 높은 것으로 나타났습니다.신장인간의 간 조직보다 [45]. 한편, P-gp의 발현 수준은 장에서보다 장에서 더 높은 것으로 보인다.신장조직 [46]. 따라서 트랜스포터를 과발현하지 않는 RPTEC/TERT1 모델과 같은 인간 세포를 사용하면 추가 데이터를 제공할 수 있습니다. 이러한 데이터는 조직 또는 시험관 내 모델 또는 IC50 값에서 P-gp의 양과 같은 여러 매개변수를 통합하여 생리학적 기반 약동학 모델링(PBPK)에서 사용 및 귀속될 수 있습니다.
RPTEC/TERT1 모델에서 케토코나졸에 대해 발견된 IC5{4}} 값이 문헌에서 관찰된 값보다 높았지만, [I1]/IC50 비율(경구 투여 약물에 대한 잠재적인 임상적으로 관련된 DDI의 예측 변수로 검증됨)은 다음을 보여줍니다. FDA에서 정의한 임계값 0.1을 초과하는 높은 값. 이 결과는 ketoconazole의 병용 투여 시 apixaban 노출이 2배 증가한다는 임상 연구에 따른 것입니다[44]. 종합하면, 이러한 모든 결과는 RPTEC/TERT1 모델이 P-gp 억제 가능성을 평가하기 위한 유망한 도구임을 입증합니다.
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결론
우리의 연구는 RPTEC/TERT1 모델의 적용이 다양한 종류의 약물의 P-gp 억제 가능성을 평가하는 데 편리함을 보여주었습니다. 로다민 123 축적 분석을 통해 초기 약물 스크리닝을 수행할 수 있었습니다. 그러나 P-gp의 R 부위와 상호작용하지 않는 약물의 P-gp 억제 가능성도 예측을 확인하기 위해 추가 기질을 사용하여 조사해야 합니다. apixaban과 rivaroxaban의 세포내 축적에서 결정된 IC50 값은 로다민 123에서 관찰된 억제 프로파일에 따릅니다. 더욱이 케토코나졸과 와파린을 P-gp의 강력한 억제제와 비억제제로 각각 사용하면 P-gp에 대한 약물의 억제 가능성에 대한 시험관 내 데이터를 얻기 위해 RPTEC/TER1 모델을 사용할 때의 신뢰성. 마지막으로, RPTEC/TERT1 모델을 사용하여 얻은 결과와 Caco{12}} 세포를 사용하여 얻은 결과를 비교한 결과 특정 약물에 대한 억제 프로필을 확인하기 위해 다양한 세포 모델에서 시험관 내 연구를 수행하는 것이 중요하다는 사실이 강조되었습니다.