천연 폴리페놀 항산화제의 광반응성 및 광독성 시험관 내 평가
Feb 21, 2022
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추상적인:폴리페놀은 항산화 및 항염증에 유익한 특성과 자외선으로 인한 산화 스트레스를 방지하는 능력으로 인해 화장품에 널리 사용되는 천연 화합물의 대가족입니다. 이러한 화합물은 발색단을 제공하고 피부에 직접 적용되기 때문에 햇빛과 반응하여 광독성 효과를 나타낼 수 있습니다. 이러한 천연 화합물의 광독성 가능성에 대한 과학적 정보가 부족하므로 이 연구의 목적은 5가지 페놀계 화합물의 광반응성과 광독성을 평가하는 것이었습니다.항산화제화장품에 문서화된 사용. 천연 페놀계 항산화제인 카페산, 페룰산, p-쿠마르산,3,{2}}디하이드록시페닐아세트산(DOPAC) 및 루틴의 광반응성을 스크리닝하기 위해 표준 ROS 분석이 검증 및 적용되었습니다. 광독성 가능성은 3T3 Neutral Red Uptake 광독성 테스트를 기반으로 하는 인간 각질 세포주(HaCaT)를 사용하여 결정되었습니다. 비록 모든페놀계 항산화제 연구290~700 nm 범위에서 UV/Vis 방사선을 흡수했지만 DOPAC만이 일중항 산소를 생성할 수 있었습니다. 활성 산소 종의 생성은 광독성 메커니즘의 일부로서 초기 단계의 화학 반응입니다. 그러나 연구된 화합물 중 어느 것도 방사선 조사 후 각질 세포의 생존력을 감소시키지 않아 광독성 가능성이 없다는 결론을 이끌어 냈습니다. 이 작업으로 얻은 데이터는 이러한 화합물이 화장품에 포함될 때 안전하다는 것을 시사합니다.
키워드:사진 안전; 광반응성; 광독성; 폴리페놀;천연 페놀 항산화제; 활성산소종; 각질세포; 피부 관리; 화장품
소개
폴리페놀(PP)은 식물계에서 가장 많고 널리 분포된 천연물 그룹 중 하나입니다. PP의 화학 구조는 하나 이상의 벤젠 고리 시스템에 결합된 하나 이상의 페놀성 수산기의 존재를 특징으로 합니다[1]. 폴리페놀은 항바이러스, 항균, 항암, 간보호, 항염 및 항산화 작용을 포함하여 인간에서 다양한 유익한 생물학적 활성을 나타냅니다[2-5].항산화제로, 폴리페놀은 일중항 산소, 과산화물 및 하이드록실 라디칼과 같은 활성 산소 종(ROS)의 산화 손상 효과로부터 세포 구성 요소를 보호하여 산화 스트레스와 관련된 여러 질병의 위험을 제한할 수 있습니다[6,7]. 화학적 특성으로 인해 PP는 ROS를 제거하고 철 및 구리와 같은 전이 금속 이온을 킬레이트할 수 있어 스킨케어 제형에 사용하기 위해 화장품 산업의 관심을 끌고 있습니다[8-10]. 자외선(UV) 노출은 피부암을 유발하는 주요 요인 중 하나이며, 피부 세포는 자외선에 의해 직접 손상되거나 UV 매개 ROS 과잉 생산에 의해 간접적으로 손상될 수 있다[11]. 실험 및 역학 연구에 따르면 폴리페놀은 여러 경로를 통해 자외선의 역효과로부터 피부를 보호합니다[12]. 따라서 이 계열에 속하는 여러 화합물이 이미 시중에서 판매되는 많은 상업용 화장품의 성분으로 사용되고 있습니다[13]. 천연 화장품에 대한 소비자 요구가 증가함에 따라 업계는 폴리페놀과 같은 활성 성분이 함유된 천연 추출물을 피부 관리를 위한 유망하고 효과적인 솔루션으로 사용하는 제형을 개발할 것을 촉구했습니다[13]. 그러나 폴리페놀 구조에 존재하는 발색단은 UV/Vis 방사선을 흡수하고 화학 반응을 일으켜 광독성 반응을 일으킬 수 있는 일련의 사건을 일으키는 능력이 있습니다[14]. 광독성은 신체가 환경광에 노출된 후 국소 또는 전신 투여된 광반응성 화학물질에 의해 유발되는 독성 반응으로 정의됩니다[15]. 전신 투여를 위한 활성 제약 성분 및 부형제, 국소 적용을 위한 임상 제제, 피부 패치 등은 광독성 가능성이 있으며 주목할만한 광독성 반응을 일으킬 수 있습니다. 따라서 규제 기관인 US FDA, EU EMA 및 ICH에서는 사진 안전 지침을 제공하여 테스트 방법 및 평가 전략을 소개합니다[15-17]. 유럽연합 법률에 따라 화장품의 안전성 평가는 의무화되어 있습니다[18]. 필수 안전성 평가에는 광유도 독성 평가를 포함하여 화장품 성분에 대한 관련 독성학적 연구가 포함됩니다[18]. 화장품에 대한 동물 실험이 금지된 이후 UV 스펙트럼 분석, 3T3 Neutral Red Uptake 광독성 테스트(3T3 NRU PT), 활성 산소종( ROS) 분석 [18-20]. ROS 분석은 약물의 광 반응성 평가를 위해 설계되었으며, 그 원리는 모의 햇빛에 노출된 시험 화학물질의 광화학 반응을 모니터링하는 것입니다[19,20]. 이러한 광화학 반응을 통해 슈퍼옥사이드 음이온 및 일중항 산소와 같은 ROS가 생성될 수 있으며 이러한 광화학 과정은 약물 유발 광독성의 방아쇠가 될 수 있습니다[19,20]. 높은 수준의 ROS는 산화 스트레스에 의한 DNA, 지질 및 단백질의 손상을 통해 세포 독성을 유발할 수 있습니다.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.html시험관 내 방법론 3T3 NRU-PT는 세포독성의 종점으로 마우스 섬유아세포 세포주 Balb/c 3T3 및 중성 적색 흡수를 사용합니다. 그런 다음 광독성은 햇빛을 모사하는 빛의 존재 및 부재하에서 시험 화학물질에 노출된 세포의 생존력의 상대적 감소에 의해 결정됩니다. 문헌에 보고된 연구에 따르면 이 테스트는 과도하게 민감하여 동물 및 인간의 사진 안전 위험을 잘못 예측하여 생체 내 결과와 비교할 때 많은 수의 위양성을 초래한다고 결론지었습니다[21-23]. 이러한 한계를 고려하여 우리 그룹은 인간 케라티노사이트 세포주(HaCaT)의 사용을 기반으로 하는 3T3 NRU-PT 방법론의 수정을 제안했습니다[24]. 이 방법론은 인간 각질 세포를 사용하기 때문에 국소 화합물이 적용되고 햇빛에 노출되는 피부의 외부 층에 존재하는 가장 풍부한 유형의 세포라는 점을 감안할 때 보다 현실적인 모델을 나타냅니다[24]. 본 연구의 목적은 천연 폴리페놀인 p-쿠마르산, 카페인산, 3,{16}}디하이드록시페닐아세트산(DOPAC), 페룰산 및 루틴의 광유도 독성 가능성을 추정하는 것이었습니다(그림 1). 이미 화장품 성분으로 사용되거나 흥미로운 화학적 및 항산화 특성으로 인해 고려되고 있습니다 [25-27]. 화합물의 탐색적 광 안전성 평가를 위해 ROS 분석이 검증 및 구현되었으며, 인간 케라티노사이트 세포주(HaCaT)를 사용하여 이들의 세포독성 및 광독성을 추가로 평가했습니다.
2. 결과 및 논의
광반응 전위 평가를 위한 초기 고려 사항은 화합물이 290~700nm 사이의 파장에서 광자를 흡수하는지 여부입니다. 290 nm에서 700 nm 사이의 임의의 파장에서 1000 L mol-1 cm-1보다 큰 몰 흡광 계수(MEC)를 갖는 화합물은 직접적인 광독성을 야기하기에 충분히 광반응성인 것으로 간주됩니다[15]. UV-가시광선에서 카페인, p-쿠마르산, 페룰산, DOPAC 및 루틴의 DMSO 흡수 스펙트럼은 그림 2에 나와 있습니다. 모든 화합물은 200~700 nm의 스펙트럼 범위에서 흡수하고 최대 파장은 290 nm 이상이고 MEC는 일반적으로 4000 L mol-1 cm-1보다 큽니다(표 1). 폴리페놀은 페놀성 수산기가 있는 π 공액계를 포함하는 생물학적 화합물입니다. π형 분자 궤도의 전자 전이는 이 화합물 그룹의 UV-가시광 스펙트럼을 담당합니다. [28]
테스트된 모든 화합물은 1000L mol-1cm-1보다 높은 MEC를 나타내었으며, 이는 모두 연구할 가치가 있는 가능한 광독성 화합물임을 의미합니다[15]. ROS 분석을 수행하기 전에 솔라 시뮬레이터를 평가하고 일중항 산소(SO) 및 초과산화물 음이온(SA)의 측정값이 문헌에 언급된 값에 근접하도록 실험 조건을 최적화했습니다[29]. ROS 생성 분석의 최적화는 양성 및 음성 대조군을 사용하여 수행되었으며 타당성 연구는 참조 화학 물질을 사용하여 수행되었습니다. 사용된 실험 조건에서 타당성 연구에서 테스트된 모든 물질은 허용 가능한 값 범위 내에서 SO 및 SA 값을 제공하는 허용 기준을 충족했습니다[29].
폴리페놀계 화합물에 대해 ROS assay를 수행하였으며, 200μM 농도에서 시험물질의 ROS 생성능을 Table 2에 나타내었다. Table 2. 시험 화합물에 대한 ROS assay 결과를 얻었다.
얻은 결과는 DOPAC을 제외하고 모든 화합물이 비광반응성으로 분류될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 물질은 1{9}}00L mol-1cm-1보다 높은 UV-가시광 흡수 및 MEC를 나타내었지만 SO 또는 SA 종과 같은 테스트 조건에서 ROS를 생성하지 않았습니다. 놀랍게도 DOPAC은 SO 종의 생성을 유도할 수 있었고 따라서 이 화합물이 연구된 모든 화합물 중에서 UV-가시선 범위에서 가장 낮은 MEC 값을 가짐에도 불구하고 광반응성으로 분류되었습니다. 가까운 장래에 화합물의 화학 구조와 광반응 능력 사이의 상관 관계를 확립하는 데 중요할 수 있는 DOPAC에 대해 얻은 결과를 이해하려면 더 많은 연구가 필요합니다. 광독성 평가에 사용된 DMSO의 세포독성을 조사 유무에 따라 1시간 노출 후 평가하였다. 조사되지 않은 플레이트의 경우, DMSO는 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았습니다. 그러나 조사된 플레이트의 경우 음성 대조군에 비해 1% DMSO와 용매 대조군 사이에 상당한 차이가 있었으며(p < 0.0001),="" 이는="" 세포="" 생존율의="" 차이를="" 보장하기="" 위해="" 모든="" 실험에서="" 용매="" 대조군의="" 사용을="" 정당화했습니다.="" 연구="" 중인="" 화합물에만="" 귀속되었습니다.="" 인간="" 각질="" 세포주(hacat)를="" 사용한="" 광독성="" 분석의="" 가능성을="" 확인하기="" 위해="" 5-메톡시="" 소랄렌,="" 클로르프로마진="" 염산염,="" 퀴닌을="" 양성="" 대조군으로,="" 아세틸살리실산,="" 헥사클로로펜,="" 소듐="" 라우릴="" 설페이트를="" 음성="" 대조군으로="" 테스트했습니다.="" [24].="" 시험된="" (폴리)페놀="" 화합물이="" 있는="" 상태에서="" 조사된="" hacat="" 세포와="" 조사되지="" 않은="" hacat="" 세포의="" 세포="" 생존율을="" 비교한="" 광독성="" 분석에서="" 얻은="" 결과는="" 그림="" 3에="" 나와="" 있습니다.="" (irr="" plus="" )와="" 빛의="" 부재(irr-)는="" 1000="" µm의="" 최대="" 농도를="" 고려하여="" 선량="" 범위="" 찾기="" 실험에서="" 결정되었습니다.="" 기하학적="" 희석="" 계열을="" 사용하고="" 조사의="" 유무에="" 따른="" 농도-반응의="" 함수로="" 필요에="" 따라="" 조정했습니다.="" 시험된="" 농도="" 범위(12.5,="" 31.25,="" 62.5,="" 125,="" 250,="" 500,="" 1000μm)="" 내에서="" 세포="" 생존율의="" 50%="" 감소를="" 유도한="" 시험="" 물질은="" 없었으므로="" 해당="" ic50="" 및="" pif="" 값을="" 계산할="" 수="" 없었습니다.="" .="" 대조적으로,="" 시험="" 물질의="" 존재="" 하에서="" 조사된="" 세포에="" 대한="" 생존력의="" 용량="" 의존적="" 증가를="" 인지하는="" 것이="" 가능했는데,="" 이는="" 아마도="" 더="" 높은="" 백분율로="" 이어지는="" 방사선에="" 의해="" 유도된="" 산화적="" 손상에="" 대한="" 이러한="" 항산화제의="" 광보호="" 효과="" 때문일="" 것이다.="" 대조군(미처리="" 방사선="" 조사된="" 세포)과="" 비교할="" 때="" 생존="" 세포의.="" uv="" 방사선은="" ros의="" 생성,="" 산화질소의="" 과잉="" 생산="" 및="" 각질="" 세포의="" 항산화="" 방어의="" 고갈을="" 초래한다고="" 문헌에="" 설명되어="" 있습니다[30].="" 이러한="" 이유로="" 항산화="" 능력이="" 있는="" 폴리페놀이="" 광보호제로="" 연구되어="" 왔다.="" 대부분의="" 연구는="" 폴리페놀의="" 광보호="" 능력에="" 초점을="" 맞추었지만="" 광독성="" 가능성에="" 대해서는="" 연구하지="" 않았습니다.="" 이전="" 연구에서는="" ros="" 및="" 반응성="" 질소="" 종(rns)을="" 제거하는="" 카페인산,="" 페룰산="" 및="" p-쿠마르산의="" 능력을="" 확인했습니다.="" 더욱이,="" uv="" 방사선의="" 유해한="" 영향에="" 대한="" 보호는="" 이="" 세="" 가지="" 페놀="" 화합물에="" 대한="" 생체="" 내="" 또는="" 피부="" 세포에서도="" 확립되었습니다[31-34].="" 이러한="" 데이터는="" 연구="" 중인="" 화합물이="" 있는="" 상태에서="" 방사선에="" 노출되었을="" 때="" 생존="" 세포의="" 백분율="" 증가를="" 설명할="" 수="" 있습니다.="" 카페인,="" 페룰산="" 및="" p-쿠마르산과="" 같은="" 루틴은="" ros="" 생성="" 분석에서="" 음성으로="" 테스트되었으며="" hacat="" 세포주에서="" 광독성을="" 유도하지="" 않았습니다.="" 루틴의="" 광독성="" 가능성과="" 관련하여="" 문헌에="" 일부="" 모순된="" 정보가="" 있으므로="" 얻은="" 결과에="" 대한="" 관심이="" 있습니다.="" 케라티노사이트="" 세포="" 시스템(hacat)을="" 사용하여="" 광독성="" 가능성을="" 평가한="" 결과="" 루틴이="" 광독성을="" 나타내는="" 것으로="" 나타났습니다[35].="" 반대로,="" 가시광선="" 조사="" 시="" 산소="" 소비="" 및="" 활성="" 산소="" 종의="" 생성="" 측면에서="" 식물="" 추출물="" 및="" 구성="" 요소의="" 광독성을="" 테스트하기="" 위해="" 전기화학적="" 및="" uv="" 검출이="" 있는="" 모세관="" 전기영동을="" 사용하는="" 실험="" 설정을="" 사용하여="" 루틴이="" 다음과="" 같은="" 결론을="" 내릴="" 수="" 있었습니다.="" 이것은="" ros="" 생성="" 분석에서="" so="" 또는="" sa를="" 생성하지="" 않기="" 때문에="" 루틴이="" 광반응성을="" 나타내지="" 않는="" 이="" 연구에서="" 얻은="" 결과와="" 일치하는="" 광독성이="" 아닙니다.="" 한편,="" 이="" 연구에서는="" 루틴="" 자체가="" hacat="" 세포주에서="" 광독성="" 가능성을="" 나타내지="" 않는다는="" 것도="" 밝혀졌습니다.="" 이러한="" 모순된="" 결과는="" 잘못된="" 결과를="" 피하기="" 위해="" 표준화된="" 테스트="" 조건을="" 사용하고="" 적절한="" 광원을="" 사용하는="" 것의="" 중요성을="" 강조합니다.="" 흥미롭게도="" dopac과="" 연구된="" 다른="" pp="" 간의="" 구조적="" 유사성에도="" 불구하고="" dopac은="" ros="" 생성="" 분석에서="" so를="" 생성하고="" 광반응성으로="" 분류되었습니다.="" 그러나="" hacat="" 세포주에서="" 테스트했을="" 때="" dopac은="" 광독성이="" 없는="" 것으로="" 나타났습니다.="" 얻은="" 결과에서="" dopac은="" 광반응성이지만="" 광독성이="" 아닌="" 것으로="" 나타나므로="" 이="" 화합물의="" 국소="" 적용="" 후에="" 광독성="" 반응이="" 발생할="" 것으로="" 예상되지="">
3. 재료 및 방법
3.1. 시약
3,{1}}디히드록시페닐아세트산(DOPAC), 카페산, 트랜스페룰산, p-쿠마르산, 루틴, 클로르프로마진 염산염, 인산수소이나트륨 12수화물, 인산나트륨 일염기성 일수화물, 중성 적색(NR) 및 디메틸 설폭사이드 (DMSO)는 Sigma-Aldrich(스페인 마드리드)에서 구입했습니다. Quinine hydrochloride, benzocaine, diclofenac 및 erythromycin은 Acofarma (Madrid, Spain)에서 구입했습니다. 불멸화 인간 각질세포(HaCaT) 세포주는 Cell Lines Service(CLS)(Eppelheim, Germany)로부터 입수하였다. 4.5g/L D-글루코스, L-글루타민, 25mM HEPES 및 4.5g/L D-글루코스, L 글루타민, 25mM HEPES(페놀 레드 없음)가 포함된 DMEM, Dulbecco 인산염 완충 식염수가 포함된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM) (DPBS), 태아 소 혈청 (FBS) 및 트립신 EDTA는 Gibco Life Technologies (Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. 에탄올은 Aga(Lisbon, Portugal)에서 공급했습니다. N, N-디메틸{14}}니트로구아니딘(RNO), 이미다졸 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)은 Alfa Aesar(Kandel, Germany)에서 구입했습니다.
3.2. 스펙트럼 흡수
각 연구 화합물의 흡수 스펙트럼은 Jasco V650 UV/VIS 분광 광도계를 사용하여 OECD 시험 가이드라인 101에 따라 290 ~ 700 nm 범위에서 측정되었습니다[37]. 최종 농도가 10μg/mL가 되도록 물질을 DMSO에 용해시키고 UV 투명 석영 큐벳(경로 길이=10 mm)을 사용하여 흡수 스펙트럼을 측정했습니다. 각 스펙트럼은 용매별 기준선 흡수에 대해 수정되었습니다. 몰 흡광 계수(MEC)는 290~700 nm에서 가장 높은 흡수 피크를 사용하여 계산되었습니다[15].
3.3. 반응성 산소 종(ROS) 분석
ROS 분석 프로토콜이 수립되었고 문헌[19,29]에 설명된 절차에 따라 검증 연구가 수행되었습니다. 모든 시험물질의 원액은 DMSO에 10mM 농도로 준비하여 빛을 차단하여 당일 사용하였다. 간략하게, 일중항 산소(SO) 생성은 일중항 산소의 선택적 수용체로서 이미다졸을 사용하여 440 nm에서 p-니트로소디메틸아닐린(RNO) 표백의 분광광도계 측정에 의해 검출되었습니다. 20mM 인산나트륨 완충액(PB, pH 7.4)에 시험된 화학물질(200μM), RNO(50μM), 이미다졸(50μM)을 포함하는 샘플을 튜브에 넣고 볼텍스 믹서로 혼합하고 초음파 처리했습니다. 10분 동안 빛으로부터 보호됩니다. 혼합물을 Hellma 석영 유리 고성능 셀로 옮기고 빛에 노출되기 전에 현미경으로 침전을 확인했습니다. 그런 다음 8개의 Repti Glo(20W) UV-Vis 램프가 장착된 Fitoclima S600PL 온도 조절식 태양열 시뮬레이터(Aralab, Portugal)를 사용하여 샘플에 25℃에서 90분 동안 조사했습니다. 조사 후, 440 nm에서 흡광도를 다시 판독하였다. 슈퍼옥사이드 음이온(SA) 생성은 니트로블루 테트라졸륨(NBT)이 모노포르마잔(NBT 플러스)으로 환원되는 것을 관찰함으로써 검출되었으며, 그 형성은 560 nm에서 분광광도계로 모니터링할 수 있습니다. 시험 화합물(200μM) 및 NBT(50μM)를 20mM NaPB에 포함하는 시료에 조사하고, NBT의 감소를 SO 측정과 동일한 방식으로 560nm에서의 흡광도 증가로 측정하였다. 실험은 삼중으로 수행되었습니다. 사용된 솔라 시뮬레이터는 권장 모델과 다르기 때문에 조사 조건을 검증할 필요가 있었습니다. 양성(퀴닌) 및 음성 대조군(술리소벤존) 및 참조 화합물을 사용하여 조사 조건이 권장 기준을 충족하는지 확인하기 위해 ROS 분석을 수행했습니다[29]. ROS 분석 결과(3회 측정의 평균)에 따르면, 시험된 폴리페놀 화합물은 SO 값 25 이상 및/또는 SA 값 20 이상 측정 시 광반응성 물질로 분류되었습니다. 차례로 SO의 경우 25 미만, SA의 경우 20 미만의 값이 기록될 때 비광반응성 물질로 결정되었습니다[29].
3.4. 세포 배양
HaCaT 세포는 10% FBS 및 1% 항생제가 포함된 DMEM의 인큐베이터에서 95% 공기 및 5% CO2의 습한 분위기에서 37℃로 유지되었습니다. 도립현미경을 이용하여 세포의 합류를 관찰하고 세포가 7{85}}-80% 합류에 도달하면 세포사멸을 방지하기 위해 계대배양을 하였다. 이를 위해 배양 배지를 흡인하고 세포를 DPBS로 세척하고 트립신 0.25% 2mL를 첨가하고 5% CO2 분위기에서 37℃에서 7~8분 동안 배양하였다. 세포가 분리된 후, 트립신 작용을 차단하기 위해 새로운 배지를 첨가하였다. 세포 계수를 위해 10 μL의 세포 현탁액을 세포 계수가 있는 Neubauer 챔버에 넣었습니다. 얻어진 세포 현탁액을 새로운 세포 배양 배지가 있는 새로운 플라스크로 세분하였다. 세포 동결을 위해 DMSO(5% v/v)를 동결 보존제로 사용하여 저장 단계에서 결정이 형성되는 것을 방지했습니다. 세포 복제에 필요한 시간을 결정하기 위해 1 × 106 세포를 5개의 75cm2 플라스크에 파종하고 5% CO2 분위기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하여 완전한 부착에 도달했습니다. 그런 다음, 각 플라스크의 세포를 다른 시간에 세었습니다. 결과는 선형 회귀 분석을 사용하여 배가 시간을 계산한 시간 대 세포 수를 나타내는 그래픽으로 표시되었습니다. 계산된 배가 시간은 20.43시간으로 문헌에 보고된 값과 일치하므로 사용된 세포가 정상적인 성장 조건에 있음을 확인했습니다[38]. 3.5. 광독성 분석 광독성 연구를 위해 우리 실험실에서 구현된 이전 프로토콜을 따랐습니다[24]. UVA/UVB Osram 램프(240V E27)의 높이는 OECD 가이드라인[23]에 따라 1.7 mW/cm2(Cosmedico radiometer, UVM{38}})의 UVA 조사량으로 세포를 조사하기 위해 조정되었습니다. . 조사(10분) 동안 플레이트를 수냉식 시스템이 포함된 스티로폼 수용기 내부에 보관하고 절차 전반에 걸쳐 온도를 모니터링했습니다. 간단히 말해서, NR 흡수 분석을 수행하기 위해 HaCaT 세포를 파종하고(2 x 104 cells/well) 24시간 동안 5% CO2 대기에서 37℃에서 배양했습니다. 그 후, 배지를 제거하고, 다른 농도의 시험 물질을 첨가하고, 세포를 동일한 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 한 판은 어두운 곳에 보관하고 다른 판은 29~32℃의 온도를 유지하면서 10분 동안 조사하였다. 그 후, 세포 배지를 페놀 레드가 없는 신선한 DMEM으로 교체하고 18-22시간 동안 배양했습니다. 이 인큐베이션 기간 후, 두 플레이트의 세포를 DPBS로 세척하고 50㎍/mL NR을 함유하는 완전한 DMEM을 각 웰에 첨가하고 3시간 동안 인큐베이션하였다. NR과 함께 배양한 후, NR 용액을 제거하고 NR 탈착 용액(50% 에탄올:1% 아세트산:49% 증류수)을 첨가하여 세포로부터 NR 염료를 추출하였다. 판독 절차를 위해 흡광도는 540 nm에서 측정되었습니다. 각 플레이트 내에서 DMSO 대조군을 테스트했습니다. 각 플레이트에서 얻은 세포 생존율 데이터는 처리된 세포 대 용매 대조군 세포의 흡광도 비율로 표현되었으며 선형 회귀 분석을 사용하여 IC50 값을 추정하는 데 추가로 사용되었습니다. 각 시험 물질에 대한 광자극 인자(PIF) 값은 조사된(Irr plus ) 세포의 IC50 값 대 조사되지 않은(Irr-) 세포의 IC50 값 사이의 비율로 계산되었습니다. OECD 가이드라인에 따르면 PIF 지수가 2보다 낮으면 광독성 효과가 없는 것으로, PIF 지수가 2~5이면 광독성 효과가 있을 것으로 예측하고 PIF가 5보다 높으면 광독성 효과를 예측한다[23]. 시험된 화합물은 농도 범위에서 평가되었습니다: 12.5; 31.25; 62.5; 125; 250; 500 및 1000 μM. 3.6. 통계 분석 모든 데이터는 3중으로 실행되는 3개 이상의 독립적인 실험에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 분산의 정규성 및 균질성을 확인하기 위해 D'Agostino-Pearson 옴니버스 정규성 검정을 사용하였고, 이후 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett의 사후 검정(용매를 사용한 음성 대조군 세포와의 비교), 수행되었다. 그래프는 Windows용 소프트웨어 GraphPadPrism(버전 6.0, GraphPad Software, Inc.(San Diego, CA, USA))으로 생성되었습니다.
4. 결론
이 연구에서는 활성 산소종(ROS) 분석과 3T3 중성 적색 흡수광독성 분석(3T3 NRU-PT)을 사용하여 천연 페놀 항산화제의 광반응성 및 광독성을 조사하기 위해 햇빛을 모방한 방사선에 노출되었을 때의 행동을 조사했습니다. 잠재적인. 얻어진 결과는 루틴과 카페인, p쿠마르산, 페룰산이 UV-가시광선을 흡수하고 MEC가 1000L mol-1cm-1보다 높지만 광반응성이 없는 것으로 분류된다는 결론을 허용했습니다. 더욱이, 이들 화합물은 HaCaT 세포주를 사용하여 시험했을 때 광독성을 유도하지 않았다. 발견된 데이터는이러한 항산화제그 자체로는 광독성을 일으키지 않을 것으로 예상되므로 화장품 제형에 사용하기에 안전한 것으로 간주될 수 있습니다. 다른 한편으로, 이러한 항산화제가 존재하는 경우 방사선에 노출된 세포의 생존력이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 화장품 제형에서 가능한 광보호제로서의 사용을 뒷받침하기 위한 연구에 흥미로울 수 있는 가능한 광보호 효과를 나타낼 수 있습니다. DOPAC의 경우 이 화합물은 광반응성을 나타내었지만 3T3 Neutral Red Uptake 분석에서는 광독성이 관찰되지 않았습니다. 그러나 DOPAC 광반응성 이면의 메커니즘을 이해하고 광안전성을 보장하며 화학 구조와 광반응성 화합물의 잠재력 사이의 역할과 관계를 이해하기 위해서는 더 많은 연구가 수행되어야 합니다. 저자 기여: 형식 분석, 학사; 작문—원본 초안 준비, 학사; 개념화 IFA, HC 및 JG: 리소스, IFA, HC, JMSL 및 JG; 작문—검토 및 편집, IFA, HC, JMSL 및 JG; 감독, IFA, HC 및 JG; 자금 조달, IFA, HC, JMSL 및 JG 모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 동의했습니다. 자금 지원: 이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다. 기관 검토 위원회 성명: 해당 없음. 정보에 입각한 동의 성명: 해당 없음.데이터 가용성 진술: 이 연구에 제공된 모든 데이터는 기사에 포함되어 있습니다. 감사의 말: 이 작업은 UIDP/04378/2020, UIDB 프로젝트 범위에서 FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP의 국가 기금으로 자금을 지원받습니다. /04378/2020 응용 분자 생명과학 연구 단위-UCIBIO 및 AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB 및 UIDB/00081/2020 프로젝트 LA/P/0140/2020, FCT/MCTES(PIDDAC)의 자금 지원. 이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 샘플 가용성: 해당 없음.
참고문헌
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