추상적인:본 연구는 멜라닌 합성에 대한 시클로헤테로필린의 억제 효과를 규명하기 위해 수행되었다. B16F10 세포주에 대한 시클로헤테로필린의 억제 효과를 규명하기 위해 세포 생존율, 메신저 리보핵산(mRNA) 발현, 티로시나제 활성 분석 및 멜라닌 생성 분석을 측정하였다. tyrosinase-related protein 1(TYRP1)/TYRP2/tyrosinase(TYR)/Microphthalmia-associated transcription factor(MITF) mRNA 발현과 멜라닌 함량에 대한 cycloheterophyllin의 효과를 측정하였다. 정량적 실시간 RT-PCR 결과 cycloheterophyllin은 -MSH 처리된 B16F10 세포보다 TYRP1/TYRP2/TYR/MITF 유전자의 mRNA 발현 수준과 멜라닌 생성량을 감소시키는 것으로 나타났다. 티로시나제 활성 분석 결과 시클로헤테로필린이 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이 데이터는 시클로헤테로필린이 B16F10 세포에서 미백 효과를 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 따라서 시클로헤테로필린은 피부 미백에 강력한 성분입니다. 따라서 기능성 소재 개발을 위한 시클로헤테로필린의 작용기전에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

관련 연구에 따르면, Cistanche는 "생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주성분은 시스타노사이드(cistanoside)로 항산화, 항염증, 면역기능 촉진 등 다양한 효능이 있다. cistanche와 피부 미백 사이의 메커니즘은 citanche glycosides의 항산화 효과에 있습니다. 인간 피부의 멜라닌은 티로시나제에 의해 촉매되는 티로신의 산화에 의해 생성되며, 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 라디칼이 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche는 산화 방지제인 cistanoside를 함유하고 있으며 신체의 자유 라디칼 생성을 감소시켜 멜라닌 ​​생성을 억제할 수 있습니다.

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1. 소개

피부색은 혈액의 헤모글로빈, 표피층의 멜라닌 색소, 피하 조직의 카로틴에 의해 결정됩니다. 그 중 피부색은 주로 멜라닌 색소의 양과 분포에 의해 결정된다[1]. 멜라닌은 기저층에 존재하는 멜라닌 세포의 멜라노솜에서 합성된 색소입니다. 자외선(UV) 광선을 흡수하거나 산란시키며 피부 세포나 피부 조직의 손상을 억제하는 유익한 기능을 합니다. 그러나 멜라닌이 과도하게 축적되면 기미, 주근깨, 색소침착 등을 유발할 수 있습니다. 과색소침착을 일으키는 것으로 알려져 있다[2,3].

멜라닌 색소는 외인성 노화를 일으키는 대표적인 자극제이다. 자외선에 노출된 멜라닌 세포의 멜라닌 생성에 의해 생성되며 피부색을 어둡게 하여 자외선으로부터 피부를 보호하는 유익한 기능을 합니다. 멜라닌 색소는 유멜라닌(흑색)과 페오멜라닌(적갈색)으로 구성됩니다[4,5]. 멜라닌은 아미노산의 일종인 L-tyrosine을 기질로 하여 L-DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)를 거쳐 생성되며, 다시 주효소인 tyrosinase(TYR)에 의해 DOPA-quinone으로 산화된다. 티로시나제 관련 단백질-1(TYRP1) 및 TYRP2. DOPA-퀴논은 설프하이드릴 그룹의 존재 하에서 적황색 페오멜라닌으로 추가로 산화됩니다. DOPA-퀴논은 또한 설프하이드릴 그룹이 고갈될 때 탈카복실화, 산화 및 유멜라닌으로 촉매 작용을 합니다[4,5]. 티로시나아제 효소는 멜라닌 생성을 담당하는 핵심 효소로 대표적인 미백물질인 감초추출물, 참나무추출물, 알부틴, 코직산 등이 티로시나아제 효소의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다[6,7]. 특히, 알부틴은 멜라닌의 원료인 L-티로신과 티로시나제의 활성 부위에 Cu2 플러스로 결합된 코직산과 경쟁적으로 반응하여 티로시나제의 활성을 억제하는 역할을 한다. 코지산과 알부틴은 미백효과가 강한 것으로 알려져 있으나 피부자극 등 안전성 문제의 부작용이 보고된 바 있다[8,9]. 천연 유래 기능성 소재 개발 등 새로운 유효성분 발굴을 위한 많은 연구가 진행되고 있다[8,9].

Prenyflavone의 일종인 Cycloheterophyllin(C30H30O7)은 Artocarpus heterophyllus에 풍부하게 함유되어 있으며 항염증, 항혈소판 작용, 항산화 효능 등 약리학적, 생물학적 기능이 보고된 바 있다[10-13]. 또한 UV-A에 의해 유도된 인체 진피 섬유아세포에 항산화 및 항노화 효과가 있는 것으로 보고되었다[14,15].

이와 같이 시클로헤테로필린이 각종 질병에 효과가 있다는 보고는 있으나 시클로헤테로필린이 멜라닌 생성에 미치는 영향에 대한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구에서는 cycloheterophyllin이 멜라닌 생성 기전과 관련하여 생쥐 유래 흑색종 세포주인 B16F10 세포에서 표지자 TYRP1, TYRP2, TYR, MITF의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.

2. 결과 및 논의

CCK{0}} 분석은 B16F10 세포주에서 cycloheterophyllin의 세포 독성을 결정하기 위해 수행되었습니다. 세포 생존력을 측정하기 위해 다양한 농도의 시클로헤테로필린을 첨가했습니다(그림 1). 20 µg/mL 이상의 농도로 처리한 경우 대조군에 비해 B16F10 세포의 생존율이 현저히 감소함을 확인하였다. 10 µg/mL의 농도로 cycloheterophyllin을 첨가한 경우 B16F10 세포의 생존율은 대조군과 유사하였다. 따라서 추가 실험에서 10, 1 및 0.1 μg/mL의 농도로 시클로헤테로필린을 첨가했습니다.

Tyrosinase 효소는 L-tyrosine과 반응하여 L-DOPA를 생성하고, L-DOPA는 멜라닌 생성을 조절하는 핵심 효소로 알려진 tyrosinase에 의해 DOPAquinone을 통해 최종적으로 멜라닌 색소를 생성한다[4,5]. 본 실험에서는 코직산을 양성 대조군으로 사용하여 티로시나제 효소 활성의 억제 정도를 평가하였다. 10, 1, 0.1 µg/mL 농도의 cycloheterophyllin 처리에 의해 tyrosinase 효소 활성 억제 정도를 확인하였다. tyrosinase 효소 활성이 cycloheterophyllin에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(Figure 2). 10, 1, 0.1 µg/mL 농도의 cycloheterophyllin 처리군에서는 tyrosinase 효소 억제 효과가 각각 58.0, 27.4, 16.9%임을 확인하였다.

자외선은 표피의 각질형성세포를 자극하여 멜라닌세포를 자극하는 호르몬인 -MSH(melanocyte-stimulating hormone)의 발현을 유도하여 세포 밖으로 분비되고 분비된 -MSH는 멜라닌세포를 자극한다. 멜라노코르틴 1수용체(MC1R)와 결합하여 세포 내 멜라닌 합성과 관련된 신호전달을 유도하여 멜라닌 색소 생성을 일으킨다[5]. 본 실험에서는 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 유도하기 위해 200 nM -MSH를 사용하여 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 유도하였다[16]. -MSH 처리된 B16F10 세포에서 시클로헤테로필린 처리에 의해 -MSH 처리에 의해 증가되는 마커인 TYRP1, TYRP2, TYR 및 MITF 유전자의 발현 수준에 대한 실시간 RT-PCR을 수행하였다. B16F10 세포에 시클로헤테로필린을 처리하고 마커의 발현을 실시간 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, -MSH 처리군에 비해 시클로헤테로필린 처리군에서 TYRP1, TYRP2, TYR, MITF의 발현이 유의하게 감소함을 확인하였다. 구체적으로, 10 μg/mL의 시클로헤테로필린을 처리한 실험군에서 TYRP1, TYRP2, TYR 및 MITF 유전자의 발현이 각각 53.3, 26.6, 58 및 34% 감소했습니다(그림 3). 1 µg/mL 시클로헤테로필린을 처리한 실험군에서 표지자의 발현이 현저히 감소한 것을 확인하였으며, 0.1 µg/mL 시클로헤테로필린 처리군에서도 TYRP1 및 TYRP2 유전자의 발현이 유사하게 감소하였음을 확인하였다.

사이클로헤테로필린 처리가 멜라닌 생성과 관련된 마커의 mRNA 발현 수준을 감소시킨 것을 확인한 후 멜라닌 색소 생성 속도를 확인하여 B16F10 세포에서 멜라닌 색소 생성이 실질적으로 감소되었는지 여부를 확인하였다(Figure 4). . 사이클로헤테로필린을 각각 10, 1, 0.1 μg/mL 농도로 처리한 B16F10 세포주를 채취하여 멜라닌 생성 정도를 확인하였다. 그 결과, 10 및 1 μg/mL 농도에서 시클로헤테로필린에 의해 멜라닌 색소 생성이 현저히 감소함을 확인하였다(도 4A). 또한 대조군에 비해 시클로헤테로필린을 처리한 조건에서 멜라닌 색소 생성이 감소함을 확인하였다(도 4B). 10 및 1 μg/mL 시클로헤테로필린을 첨가한 경우 멜라닌 색소 생성률이 각각 44.6% 및 37.8% 감소하여 대조군에 비해 현저히 감소하였다(도 4B). 이러한 결과는 멜라닌 생성 관련 마커의 mRNA 발현 수준에 대한 실시간 RT-PCR의 실험 결과와 일치하는 경향이 있다.

아스코르브산과 같은 항산화제는 유멜라닌 생성 과정에서 중간 물질인 DOPAquinone을 L-DOPA로 환원시켜 멜라닌 ​​색소의 합성을 억제하는 중요한 미백 물질로 알려져 있다[16,17]. Cycloheterophyllin은 또한 항산화 효과가 있는 것으로 보고되었습니다[11,12]. 이러한 항산화 효과에 시클로헤테로필린이 미백에 효과적일 수 있음을 보여주고 있습니다. 이번 DPPH 라디칼 소거 분석을 통해 in vitro에서 항산화 효과를 확인한 결과, 고농도의 시클로헤테로필린 하에서 양성 대조군인 아스코르빈산과 대등한 항산화 효과를 가짐을 확인하였다(도 5). 향후 melanocytes에서 cycloheterophyllin의 항산화 효과와 catalase, SOD1, SOD2, SOD3와 같은 항산화 효소의 발현에 대한 추가 연구가 수행되어야 한다.

3. 재료 및 방법

3.1. 실험 재료 및 세포 배양

B16F10 세포주는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank)에서 구입하였고, 세포 배양 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM , LM 001–05, Welgene, Gyeongsan-si, Korea) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, 15140–122, Waltham, MA, USA)을 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 배양되었다[16]. 본 실험에 사용된 시클로헤테로필린은 DMSO를 이용하여 Artocarpus heterophyllus에서 추출하여 ChemFaces Co.(CFN97748, 중국 우한, 순도 98% 이상)에서 구입하였다.

3.2. 세포 생존능 분석 세포

생존력은 CCK-8 솔루션(Cell counting kit; EZ-3000, EZ-Cytox, Seoul, DoGen)으로 평가했습니다. B16F10 세포주를 배양 배지에 2 x 104개 세포/96웰 플레이트의 밀도로 시딩하였다. 24시간 후 시클로헤테로필린(CFN97748, Chemfaces)을 첨가하였다. cycloheterophyllin을 처리한 B16F10 세포주를 24시간 동안 배양한 후 CCK-8 용액을 37℃ 배양기에서 30분 동안 첨가하였다. 마이크로플레이트 리더(Epoch, Winooski, VT, USA, BioTek)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포가 없는 대조군의 흡광도를 기준으로 세포생존율을 계산하였다[16].

3.3. DPPH 분석

3.4. 체외 버섯 티로시나제 활성

3.5. 정량 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(Q-RT-PCR)

전체 RNA는 Trizol(15596018, Carlsbad, CA, USA, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분리했습니다. RNA의 농도는 분광광도계로 결정되었습니다(BioTek). ReverTra Ace® 역전사 키트(Toyobo, FSQ101, 일본 오사카)를 사용하여 RNA 4마이크로그램을 cDNA로 역전사했습니다. 총 200μL의 cDNA 용액에 Tris-EDTA 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 역전사를 중지시켰다. TaqMan® Gene Expression Assay 세트는 Applied Biosystems에서 구입했습니다. Q-RT-PCR은 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 간략하게, Q-PCR 혼합물 20µL에는 10µL 2× TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1µL 20× Taqman 발현 분석(Applied Biosystems) 및 50ng cDNA가 포함되어 있습니다. Q-PCR 혼합물은 StepOnePlus System(Applied Biosystems)을 사용하여 95°C에서 20초 및 40회 순환 반응(95°C에서 1초 및 60°C에서 20초)으로 반응했습니다. Q-RT-PCR 분석에 사용된 TaqMan 발현 분석의 유전자 식별 번호는 표 1에 나와 있습니다. 인간 GAPDH(Applied Biosystems)는 다양한 샘플의 cDNA 양 변화를 정규화하는 데 사용되었습니다.

3.6. 멜라닌 콘테스트 분석

멜라닌 색소의 양을 측정하기 위해 Hosoi의 방법은 부분적으로 modi-field였다[17]. 총 1 × 105 B16F10 세포를 60mm 조직 배양 접시에 접종했습니다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 200 nM의 α-멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH; M4135, Sigma-Aldrich) 및 시클로헤테로필린(10, 1, 0.1 μg/mL)을 각 농도에서 72시간 동안 첨가하였다. 배양액을 제거한 후 NaOH(1N; S8045, Sigma-Aldrich) 용액 200μL를 첨가하고 60℃에서 2시간 동안 배양하여 멜라닌을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계(405 nm, Epoch)로 측정하였다. 양성 대조군으로는 100㎍/mL 알부틴(A4256, Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 멜라닌 색소 생성 억제는 -MSH 처리 조건에서 생성된 멜라닌 양의 백분율로 표시하였다. 3개의 독립적인 실험을 독립적으로 수행함으로써 수행되었다.

3.7. 통계 분석

4. 결론

일상생활에서 접하는 자외선은 비타민D 합성 및 살균 등의 유익한 기능을 가지고 있으나 다른 측면에서는 활성산소의 연쇄반응에 의해 피부 탄력저하, 주름, 색소침착, 홍반, 염증 등을 일으킨다[18, 19]. 또한 자외선 등 외부 요인에 의한 외인성 노화는 생체 내 구성 세포의 감소 및 열화로 조직이 손상되면 정상 조직의 기능 및 재생을 방해한다[20,21].

본 연구를 통해 B16F10 세포를 치료하기 위한 cycloheterophyllin의 적절한 농도를 확인할 수 있었다. 10 µg/mL의 농도에서는 Figure 1과 같이 세포의 생존력에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 티로시나제 효소의 활성 억제 효과를 측정한 결과 10, 1, 1, 0.1 µg/mL는 티로시나제 효소의 활성을 크게 감소시켰습니다(그림 2). 또한, 시클로헤테로필린은 -MSH 처리 조건에 비해 마커(TYRP1, TYRP2, TYR 및 MITF 유전자)의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 3). 또한 시클로헤테로필린이 B16F10 세포에서 멜라닌 합성량을 감소시키는 것을 확인하였다(Figure 4). 이러한 결과를 바탕으로 시클로헤테로필린은 새로운 미백 후보 물질로서의 가능성을 보여줍니다.

이번 연구는 시클로헤테로필린의 멜라닌 합성 억제 효과를 최초로 확인한 것으로, 자외선에 의한 피부 노화 억제 가능성을 제시했다. 또한 B16F10 세포의 신호 메커니즘, 미백과 관련된 신호 시스템 및 멜라닌 세포에 존재하는 다양한 항산화 효소에 대한 심층적인 영향이 필요한 것으로 보입니다.

참조

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