통합 Omics 분석으로 신장 동종 이식 생검에서 미세혈관 염증 관련 경로 밝혀
Mar 24, 2022
고형 장기 이식에서 microRNA(miRNA)는 부상에 대한 반응으로 동종이식 세포 기능을 조절하는 핵심 역할을 하고 있습니다. 조직학적으로 미세혈관 염증으로 정의되는 거부 표현형인 항체 매개 거부 반응에서 miRNA의 역할에 대한 통찰력을 얻기 위해,신장 동종이식 생검은 miRNA뿐 아니라 전령 RNA(mRNA) 프로파일링을 거쳤습니다. BIOMARGIN 연구(발견 집단, N{0}};선택 집단, N{1}}, 검증 집단, N=298), 6개의 차등적으로 발현된 miRNA가 일관되게 확인되었습니다: miR-139-5p(아래) 및 miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p(위쪽). 이들의 발현 수준은 미세혈관 염증 강도와 점진적으로 상관관계가 있었다. miRNA 표적 유전자의 세포 특이성은 생체내 mRNA 표적을 독립적인 동종이식 생검 코호트의 단일 세포 RNA 시퀀싱과 통합하여 조사되었습니다. 내피 유래 miR{11}}p 발현은 MHC 관련 유전자 발현과 음의 상관관계가 있습니다. 반대로, 상피 유래 miR{14}}p 과발현은 저하된 신장 전해질 항상성 및 억제된 면역 관련 경로와 강하게 연관되었습니다. 면역 세포에서 miR{16}}p는 T 림프구에서 NF-kB 활성화를 조절한 반면 miR{18}}p는 항원 제시 세포에서 mRNA 스플라이싱을 조절했습니다. 전체적으로 통합 오믹스를 통해 미세혈관 염증과 관련된 새로운 경로를 규명할 수 있었고 관형 상피 세포의 대사 변형이 항체 매개 거부 반응의 결과로 주변 내피 구획을 넘어 발생한다고 제안했습니다.
키워드:신장이식, 마이크로RNA, 멀티오믹스, 미세혈관염증, 항체매개거부반응
소개~ 안에신장 이식(KT), 동종 면역 손상은 일반적으로 면역 침윤의 공간적 분포와 공여자 특이적 항-HLA 항체의 유무에 대한 정보에 따라 두 가지 유형의 동종이식 거부반응으로 이분된다. 진단은 Banff International Consensus 분류(1)에 따라 조직학적 병변의 등급과 함께 동종이식 생검에 의존합니다. 세뇨관염("t" 병변) 및 간질 염증("I" 병변)은 T 세포 매개 거부반응(TCMR)의 특징적인 조직학적 특징이며 세뇨관 간질 구획에 대한 직접적인 세포독성과 관련이 있습니다. 항체 매개 거부반응(ABMR)은 순환하는 항-HLA 항체와 미세혈관 구획을 표적으로 하는 염증과 가장 흔히 관련이 있습니다. 활성 ABMR 조직학적 병변은 결합하여 "미세혈관 염증"(MVI)으로 지칭되는 사구체 모세혈관("g" 병변) 및 세뇨관 주위 모세혈관("ptc" 병변)에 단핵 세포의 존재를 포함합니다. 만성 활동성 ABMR에서는 이식 사구체병증이나 동맥 내막 섬유증과 같은 만성 조직 손상이 이러한 급성 병변에 추가됩니다(1). 현재의 T' 세포 표적 면역억제제를 사용하여 TCMR은 제한된 예후 영향을 갖는 것으로 간주되는 반면 ABMR은 효과적인 치료 접근법의 부족과 관련된 이식 실패의 주요 원인입니다(2).
MVI 및 ABMR에 대한 더 나은 치료법을 찾기 위해서는 이러한 손상 과정의 기초가 되는 생물학적 메커니즘에 대한 더 나은 통찰력이 필요합니다. 높은 처리량의 오믹스 기술은 수천 개의 유전자, 단백질 및 대사 산물을 정확하고 동시에 동시에 스크리닝할 수 있기 때문에 목적에 적합한 것으로 보입니다(3). 전체 전사체 심문신장동종 이식 생검은 ABMR(4) 동안 손상된 상주 세포 또는 침투 세포 집단에서 심오한 mRNA 유전자 발현 변화를 입증했습니다. 한편, 마이크로RNA(miRNA)는 전사 후 수준에서 전령 RNA(mRNA)를 조절함으로써 세포 대사의 핵심 선수로 부상했습니다. 사실, miRNA는 증식, 세포자멸사, 분화 및 발달과 관련된 신체 생리학적 과정의 미세 조정에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으켰습니다(5). 당연히 조절되지 않은 miRNA 발현은 다음을 포함한 많은 병리의 발달을 초래합니다.신장 질환(6). miRNA 발현 프로파일이 질병 상태와 건강한 상태 사이에 다르기 때문에 많은 연구에서 miRNA를 단독으로 또는 다른 보다 전통적인 마커와 함께 분석하여 질병을 진단하고 질병 진행을 예측할 뿐만 아니라 잠재적인 치료 응용 프로그램을 설계하기 위해 분석했습니다(7).
고형 장기 이식의 맥락에서, miRNA는 면역 세포 기능의 조절 및 손상에 대한 동종이식 상주 세포의 반응에서의 역할을 통해 거부에 관여할 수 있습니다(6,8). 여러 연구에서 동종이식 miRNA를 TCMR 설정에서 바이오마커 및/또는 이펙터로 조사했지만(8,9), 지금까지 MVI 및 ABMR에 초점을 맞춘 연구는 없었습니다. 이 연구에서 우리는신장이 해로운 거부 표현형에서 miRNA의 역할에 대한 통찰력을 얻기 위해 동종 이식 생검.
재료 및 방법 연구 설계이 연구는신장이식편 부상 연구 프로그램(BIOMARGIN, https://cordis.europa. eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, 번호 NCT02832661), 동종 이식 면역 병변의 바이오마커를 찾기 위해 유럽 연구 컨소시엄이 주도신장 이식진단 및/또는 예후 가치가 있는 수혜자. BIOMARGIN은 4시에 수행된 다기관, 전향적, 다단계 연구입니다.신장 이식유럽 내 센터(프랑스 파리 네커 병원, 벨기에 루벤 대학 병원, 독일 하노버 하노버 의과대학, 프랑스 리모주 대학 병원) 2013년 4월과 2015년 6월 사이에 스크리닝 및 적응증 생검 시점에 샘플을 전향적으로 수집했습니다(그림 IA). 모든 이식은 음성 보체 의존성 세포독성 교차 일치로 수행되었습니다. 이 4개의 임상 센터에서 프로토콜 생검은 적응증 생검에 추가하여 지역 센터 관행에 따라 3,12, 때로는 이식 후 24개월에 수행되었습니다. 각 사이트의 기관 검토 위원회는 연구를 승인했으며 모든 환자는 서면 동의서를 제공했습니다.
연구 집단연구는 세 단계로 나누어졌습니다(그림 1A). 첫 번째 사례-대조군 발견 단계에서 N=88 생검 샘플이 전역 miRNA 발현 분석에 사용되었습니다(잠재적 정규화 miRNA 제외 N=754 miRNA). . 우리는 가용성 및 조직학적 기준에 따라 샘플을 선택했습니다(사구체신염 또는 폴리오마바이러스 관련 신병증으로 진단된 경우 및 진단이 불명확한 경우 제외). 지역 생검 판독값을 기반으로 첫 번째 선택이 이루어졌으며, 이는 원래 센터와 별개인 병리학자 그룹의 중앙 판독을 통해 더욱 개선되었습니다. 통계 분석(miRNA 선택 참조)을 사용하여 확장된 miRNA 목록을 선택했으며, 이는 조직학적 표현형 간에 가장 차등적으로 발현되었으며, 이는 후속적으로 2단계에서 정량화되었습니다.
두 번째(선택) 단계에서 유사한 사례 대조 연구 설계가 사용되었으며, 여기서 N=99 생검 샘플에 대해 표적 miRNA 발현 분석(N=143)이 수행되었습니다. 동일한 통계 파이프라인을 적용하여 훨씬 더 제한된 miRNA 목록을 선택하여 3단계에서 후속적으로 정량화했습니다. 마지막으로, 세 번째(검증) 코호트에서 모든 샘플은 2014년 6월 24일과 2015년 7월 2일 사이에 BIOMARGIN 프로토콜에 따라 전향적으로 연속적으로 수집되었으며 적절한신장두 번째 선택 단계의 결과로 선택된 38개의 miRNA에 대해 동종 이식 생검 품질을 평가했습니다. 이 실제 환경 코호트에서는 조직학, 인구 통계, 시간 또는 샘플 가용성 및 품질 관리 기준(생검 및 RNA 수율의 적절성) 이외의 다른 요인을 기반으로 선택하지 않았습니다.
miRNA 선택강력한 통계 파이프라인은 생체 신호 R 패키지(1l)의 확장으로서 R(R Core Team(1{2}}), 버전 1.0.44)의 BIOMARGIN 연구를 위해 특별히 개발되었습니다. 간단히 말해서, 발견 단계에서 우리는 단변량 및 다변량 접근법을 포함하는 기능 선택 전략을 수행했습니다. 단변량 선택의 경우 비모수 테스트(Wilcoxon-Mann-Whitney 테스트)와 모수 테스트(Student's t-test) 및 Discovery 집단(BIOS-03-0023, BIOS-06-0238)을 사용했습니다. 각 다변수 모델에서 각 miRNA 전사체의 예측 점수를 통합하여 "다변수 점수"를 산출했습니다. 이러한 단변량 및 다변량 분석 결과를 결합하여 우리는 다음 단계에서 정량화할 확장 목록의 일부가 될 miRNA 후보의 하위 집합을 순위 지정하고 선택할 수 있었습니다.VMI 경로에 초점을 맞춘 이 사후 분석을 위해 세 코호트 모두에서 Wilcoxon 테스트를 사용하여 각 miRNA의 중앙값 정규화 발현을 사례와 대조군 간에 비교했습니다. Benjamini & Hochberg FDR(False Discover Rate) 방법을 사용하여 다중 테스트를 제어했습니다.
임상병리학적 평가개별 조직학적 병변 점수는 Banff 2019 기준(16)에 따라 반정량적으로 평가되었습니다. "미세혈관 염증"(MVI)이라는 용어는 사구체염(g) 및/또는 세뇨관주위 모세혈관염(ptc)의 조합을 나타내는 데 사용되었습니다. 모든 ABMR 사례는 Banf 2015 또는 Banff 2017 분류(조직학적 급성 조직 손상의 증거 및 혈관 내피와의 현재/최근 항체 상호작용의 증거), 그러나 모두가 세 번째 기준[공여자 특이적 항체(DSA) 및/또는 CAd 염색의 혈청학적 증거]를 충족하지는 않았습니다. 이식 후 DSA는 지역 센터 관행에 따라 결정되었으며, DSA 양성은 생검 시점 또는 그 이전의 모든 시점에서 평균 형광 강도(MFI) 값이 500인 검출 가능한 공여자 특이적 혈청 항-HLA 항체로 정의되었습니다.
mRNA 및 miRNA 프로파일링을 위한 생검 샘플에서 RNA 추출2개의 바늘 코어를 각각 가져갔습니다.신장동종이식 생검. 하나는 기존의 조직학적 등급화에 사용되었고 나머지 절반은 즉시 Allprotect Tissue Reagent(Qiagen Benelux BV, Venlo, The Netherlands)에 보관되었습니다. Allprotect 튜브는 4C(최소 24시간에서 최대 72시간)에서 보관되었습니다. , 그런 다음 RNA 추출까지-20도에서 보관합니다. 총 RNA는신장QIAcube 기기(Qiagen Benelux BV)에서 Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit(Qiagen Benelux BV)를 사용하여 동종이식 생검 표본. NanoDrop ND{4}} 분광광도계(Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Ghent, Belgium). RNA 무결성 번호(RIN)는 Bioanalyzer 2100 기기(Agilent Technologies BelgiumNV)에서 Eukaryote nano/pico RNA Kit(Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgium)로 평가되었습니다. 품질 관리 지수는 VMI와 No MVI그룹 [RIN(mean±SD):5.6±1.96vs5.4±1.97,P{14}}.66;260/280 비율(mean±SD):1.87±0.06 vs 1.87±0.1l,P{26 }}.40]. 낮은 RIN(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">
CISTANCHE는 신장/신장 투석을 개선할 것입니다
miRNA 프로파일링Specific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35개는 표현되지 않은 것으로 간주되었다. RNU44와 RNU48은 모든 샘플에서 일관된 발현을 보여 평균(RNU44 + RNU48) 변이 계수가 어레이 카드 A에서 3.73%, 어레이 카드 B에서 3.79%]였으며 모든 하위 연구에서 데이터 정규화를 위한 하우스키핑 유전자로 사용되었습니다.
mRNA 전사체 분석전사체 분석은 이미 설명한 바와 같이 마이크로어레이에 의해 수행되었습니다(17). 간단히 말해서, 생검 샘플에서 추출한 총 RNA를 먼저 증폭하고 GeneChip 39 IVT PLUS 시약 키트(Affymetrix)를 사용하여 상보적 RNA(cRNA)로 비오틴화하고 Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2에 하이브리드화했습니다.{4}} Arrays( Affymetrix)는 전체 게놈을 포함하는 54,675개의 프로브 세트로 구성되었습니다. RMA(Robust Multichip Average) 정규화를 사용했습니다. 각 mRNA의 정규화 중앙값을 Wilcoxon 테스트를 사용하여 사례와 대조군 간에 비교했습니다. Benjamini & Hochberg FDR(False Discover Rate) 방법을 적용하여 다중 테스트로 인한 위험 알파의 인플레이션을 제어했습니다. 마이크로어레이 데이터는 마이크로어레이 실험 지침에 대한 최소 정보에 따라 처리되었습니다.
인실리코 분석Biological Interpretation Of Multiomics EXperiments(BIOMEX) 소프트웨어는 Ensembl ID 주석을 사용하여 전사 데이터 차등 분석에 사용되었습니다(18). Ingenuity Pathway Analysis(IPA, Build: 478438M Content version:44691306, Qiagen) 및 OMICSnet(19)을 사용하여 선택된 miRNA에 의해 조절되는 유전자 세트를 결정했습니다. OMICSnet은 전체 경로를 사용하여 Reactome 경로 데이터베이스로 유전자 온톨로지 분석을 수행하는 데 사용되었습니다(20). 유전자 네트워크 구축은 완전히 감독되지 않았으며 네트워크의 다른 모든 유전자와 모든 단일 유전자의 보고된 분자 상호작용 수에 의존했습니다. 상호작용이 가장 많은 유전자는 자동으로 네트워크의 중앙에 위치했고, 상호작용이 적은 유전자는 주변으로 퍼졌다. 선택된 miRNA의 세포 기원은 인간 세포 및 조직에서 유전자 발현의 캡 분석을 제공하는 Fantom5 프로젝트(21)를 사용하여 조사되었습니다. miRNA 발현 분석을 위해 우리는 모든신장-관련 구조 세포 및 모든 순환 조혈 세포, 추가 선택 없음.
단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터 분석이전에 발표된 2개의 ABMR 생검과 이식 감시 생검에 해당하는 4개의 건강한 참조에서 얻은 인간 단일 세포 RNA 시퀀싱(siRNA-seq) 데이터가 사용되었습니다. 관련 원시 카운트 또는 매트릭스는 GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo)(22) 및신장정밀 의학 프로젝트(KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). 샘플당 생성된 원시 유전자 발현 매트릭스를 병합하고 Seurat V4 패키지를 사용하여 분석했습니다(23). Seurat 개체를 만들고 필터링하기 위해 적용된 매개변수는 5{8}}0~10000개의 감지된 유전자와 25% 미만의 미토콘드리아 전사체를 발현하는 세포의 포함입니다. 필터링 후 모든 개체는 Seurat(24)의 SCTransform 통합 워크플로를 사용하여 통합되었습니다. 간단히 말해서 PrepSCTIntegration 함수를 사용하여 통합에 3000개의 기능이 사용되었고 일괄 효과를 제한하기 위해 FindIntegrationAnchors 함수가 사용되었습니다. 전체 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 데이터 세트는 DimPlot 기능과 상위 16개 주요 구성요소를 사용하여 생성되었습니다. 클러스터는 0.6 해상도의 FindNeighbors 및 FindClusters 기능을 사용하여 구축되었습니다. 클러스터 식별은 각 클러스터에서 특정 마커의 표현을 평가하여 FeaturePlot 기능을 사용하여 수행되었습니다. DotPlot 및 FeaturePlot 플로팅 기능을 사용하여 도트 플롯을 생성했으며 RNA 분석에서 정규화된 카운트를 입력 데이터로 사용했습니다.
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통계 분석환자 및 기증자의 특성은 범주형 변수에 대한 숫자, 백분율 및 빈도로 설명되었습니다. 정규 분포의 경우 평균과 표준 편차(SD), 치우친 분포가 있는 변수의 경우 중앙값 및 사분위수 범위(IQR)를 사용하여 연속형 변수를 보고했습니다. 적절한 경우 Fisher 또는 Wilcoxon 테스트를 사용하여 특성을 비교했습니다. MVI 강도에 따른 miRNA 발현 중앙값을 비교하기 위해 Kruskal-Wallis test를 사용하였고, 상관관계 분석을 위해 Spearman test를 사용하였다. 0보다 작은 P-값에 대한 통계적 유의성을 고려했습니다.05. 통계 분석 및 데이터 표시를 위해 GraphPad Prism(버전 8; GraphPad Software, San Diego, CA) 및 RStudio(버전 4.{14}}.3)를 사용했습니다. 다음 R 패키지가 사용되었습니다. 히트맵 분석용 heatmap3(heatmap3_1.1.9), 레이더 플롯용 fmsb(fmsb{12}}.7.0) 및 scales(scales_1.1.1) 패키지 막대 그래프의 경우 ggplot2(ggplot2_3.3.5), 상관 행렬 분석의 경우 complot(corrplot_0.90).
결과
MVI 관련 miRNA의 다단계 식별Between April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). 다른 59명의 환자(MVI-)는 T-세포 매개 거부반응(TCMR, N=8), 간질 섬유증 및 세뇨관 위축(IFIA, N=20) 및 정상 생검(N{{6})을 포함하는 다양한 진단을 제시했습니다. }}), MVI 없음. 754개의 miRNA 후보 중에서 18개의 miRNA가 MVI 플러스 그룹과 MVI 그룹 간에 차등적으로 발현되었습니다(그림 1B). 선택 코호트에서 143개 miRNA의 제한된 목록이 99개 샘플에서 정량화되었습니다. 이 선택 코호트에서 14개의 miRNA가 (N{14}})ABMR이 있는 경우와 없는 경우(N{15}})ABMR(그림 1C) 사이에 차등적으로 발현되었습니다. 마지막으로, 가장 큰 횡단면 코호트에서 38개의 miRNA가 298개의 샘플에서 정량화되었으며, 그 중 12개의 miRNA가 ABMR(N{21}})과 ABMR 없음(N{22}}) 생검 사이에서 차등적으로 발현되었습니다(그림 1D ).
6개의 MVI 관련 MiRNA의 일관된 식별 및 조직학과의 상관관계다음으로, 우리는 차등적으로 발현된 miRNA의 3개 목록을 교차하고 3개의 독립적인 코호트에서 MVI 또는 ABMR과 일관되게 연관된 6개의 miRNA를 식별했습니다(그림 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p 및 miR-223-3p는 MVI/ABMR에서 과발현된 반면 miR-139-5p 발현은 감소했습니다. 레이더 플롯(그림 2B)은 6개의 miRNA의 경우와 대조군 사이의 차등 발현을 각 단계에 대해 표시하고 3개의 독립적인 코호트에서 miRNA 프로파일의 견고성을 지원합니다. 다음으로, 우리는 6개의 miRNA 발현이 483개의 동종 이식 생검 모두에서 개별 조직학적 병변과 어떻게 연관되는지 연구했습니다. 5개의 상향 조절된 miRNA의 발현은 MVI 병변 강도에 따라 점진적으로 증가하는 반면 miR{16}}p의 발현은 음의 상관관계가 있습니다(그림 2C).MiR{18}}p/{19}}p/ 150-5p/{21}}p/{22}}p는 ABMR 관련 특징(g, ptc, C4d 침착)뿐만 아니라 TCMR 관련 병변(i, t ) 및 IFTA 병변(ct, ci)은 공통적이고 비-ABMR 특이적 염증 및 흉터 과정에 관여함을 시사합니다. 또는 본질적으로 병변 사이에 고유한 공선성이 존재할 수 있으므로 한 병변에 대한 진정한 특이성을 식별할 수 없습니다. MiR{28}}p는 TCMR 또는 IFTA의 조직학적 병변과 상관관계가 없었습니다(그림 2D).
Multi-Omics 통합: MV에서 mRNA-miRNA 상호작용다음으로, 우리는 이전에 발표된 발견 세트(25개)에서 MVI 플러스와 MVI- 케이스 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 평가했습니다. 54,675개의 프로브 중 MVI 플러스와 MVI-
1085개의 하향 조절된 유전자와 1670개의 상향 조절된 유전자로 구성된 그룹(그림 3A). MVI 플러스 샘플에서 가장 차별적으로 발현된 mRNA는 CXCL9와 CXCL10으로, 이들 유전자가 ABMR에서 가장 과발현된다는 이전 보고서(17,26)와 일치합니다. 다음으로, 우리는 IPA와 OMICSnet을 사용하여 각 miRNA에 대한 추정 표적 유전자를 in silico로 식별했습니다. 총 4504개의 mRNA가 6개의 miRNA 중 적어도 하나의 표적이 될 것으로 예측되었습니다. 그런 다음 이 4504개의 예측된 표적을 동종 이식 생검에서 DEG와 통합했습니다. 통합 miRNA/mRNA 분석을 통해 miRp가 표적으로 하는 61개의 DEG가 확인되었으며 MVI와 생검에서 유의하게 증가했습니다. 또한 miR{19}}p, miR{20}}p, miR{21}}p, miR{ {22}}p 및 miR{23}}p(그림 3B).
MV 관련 miRNA의 세포 기원6개의 miRNA의 세포 기원은 다양한 특징을 보였다.신장miRNA 아틀라스를 사용한 세포 및 조혈 세포 아형 온라인 이용 가능[팬텀 데이터베이스(27)]. 비지도 클러스터링 식별신장면역 세포 유래 miRNA의 세포 유래 miRNA(그림 4A). 또한 각 miRNA에 대해 하나 또는 두 개의 우세한 세포 유형을 밝혔습니다. MiR-139-5p는 주로 사구체 내피 세포(EC)에서 발현되는 것으로 나타났습니다. MiR-222-3p의 발현은 관상 염증(Banff lesions"t", 그림 2D)과 상관관계가 없었지만 주로 다음과 관련이 있었습니다.신장상피 세포. 나머지 4개의 miRNA는 주로 말초혈액 단핵구(PBMC) 또는 과립구에서 발현되었으며, miR{0}}p는 NK 세포 및 단핵구, miR{1}}p는 CD4 및 CD8 플러스 T 세포, miR -155-5p는 CD19와 B 세포 및 대식세포, miR{6}}p는 호중구에 있습니다.
단일 세포 RNA 시퀀싱은 모든 신장 세포 및 침윤성 면역 세포를 식별했습니다 각 MVI 관련 miRNA의 잠재적 역할을 특성화하기 위해 공개적으로 사용 가능한 sc-RNAseq 데이터 두 개를 분석했습니다.신장ABMR 및 높은 MVI 점수(g2, ptc3)(22)가 있는 동종이식 생검. 이 데이터 세트는 MVI가 없는 4개의 건강한 참조 생검과 통합되었습니다. 품질 관리 및 필터링 후 31545개의 세포가 감지되었고 감독되지 않은 클러스터링은 12개의 클러스터를 나타냈습니다(그림 4B). 우리는 잘 확립된 마커(28)를 사용하여 모든 주요 상주 및 침윤 세포 하위 유형을 식별하고 레이블을 지정했습니다(보충 그림 S2). 다음으로 우리는 6개의 miRNA가 기원한 것으로 생각되는 세포 집단에 초점을 맞추었습니다. 이 목표에서 우리는 세포를 내피, 상피, 림프구 및 APC에 해당하는 4개의 주요 클러스터로 계층화했습니다(그림 4C). 이러한 데이터의 이전 분석(22)에 따라 sc-RNASeg 데이터세트에서 호중구 또는 NK 세포 집단이 검출되지 않았습니다.
miR-139-5p는 MVI 동안 EC 활성화 및 항원 제시 경로를 제어합니다.MiR{0}}p는 MVI/ABMR이 있는 경우에 본 연구에서 유일하게 하향조절된 miRNA였으며(그림 2A) 주로 사구체 EC에서 유래하는 것으로 밝혀졌습니다(그림 4A). 표적 유전자 중 61개가 MVI 플러스 케이스의 벌크 마이크로어레이에서 상향조절되는 것으로 확인되었으며(그림 3B)그의 발현은 이전에 확인된 3개의 EC 서브클러스터(그림 4B,C)에서 단일 세포 분해능에서 추가로 조사되었습니다. 그림 5A에 표시된 것처럼 활성화된 ECcluster는 MVI 플러스 샘플에서만 감지할 수 있었습니다. 또한 61개 유전자 중 절반(N{10}})이 3개의 EC 하위 클러스터에 관계없이 sc-RNAseq MVI와 생검에서 일관되게 증가했습니다. 그 중 GBP5가 가장 많이 증가한 유전자였다. 다음으로, 이러한 30개의 내피 유래 전사체를 사용한 유전자 온톨로지 분석은 UBE2D1 및 YWHAG를 유전자 네트워크의 중심 플레이어로 식별했습니다(그림 5B). 보다 구체적으로, 면역 관련 경로 및 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 매개 항원 처리 및 제시 경로가 풍부해졌습니다(그림 5C). Pseudotime 분석은 EC 활성화 과정에서 유전자 발현 변화를 더 잘 특성화하기 위해 수행되었으며, 세포 상태 궤적(그림 5D,E), UBE2D1, YWHAG 및 GBP5는 MVI 관련 내피 활성화 동안 지속적으로 증가했습니다. MHC 관련 유전자 HLA-A, -B 및 -DRA에 대해 매우 유사한 궤도가 발견되었지만 VCAM1, CXCL9 및 CXCL10과 같은 보나파이드 내피 활성화 및 염증 마커에 대해서도 발견되었으며, 이는 이러한 모든 유전자가 내피 활성화 동안 동시에 발현된다는 것을 시사합니다. 종합하면, 이러한 결과는 miR{32}}p가 MV 병변 동안 감소되고 활성화된 EC에서 MHC 항원 제시 경로를 더 이상 억제하지 않는다는 것을 시사합니다.
miR{0}}p 둘 다 손상신장MVI 동안 상피 세포의 생리학적 및 면역 관련 경로 다음으로 우리는 MVI 샘플에서 상향 조절된 miRNA인 miR{1}}p에 초점을 맞추었습니다.신장상피 세포 기원 및 ABMR 관련 조직학적 병변에 대한 보다 배타적인 상관관계(그림 2A, D, 4A). 벌크 동종이식 조직에서 43개의 표적 유전자 발현이 하향조절되었고(그림 3B) 단일에서 추가로 평가되었습니다. 다른 셀 해상도신장우리가 이전에 식별한 상피 집단(그림 4B, C). 확인된 모든 유전자에서 이러한 43개(95%) 유전자 중 41개의 엄청난 감소신장상피 세포 클러스터는 유전자 침묵을 시사합니다
VMI의 프로필(그림 6A). 흥미롭게도 4개의 유전자가신장생리학적 경로(ERBB4, ATPIB1, TIMM50 및 KIF3B)뿐만 아니라 면역 관련 유전자(TRAPI 및 PEBPI)도 네트워크의 중심 유전자로 확인되었습니다(그림 6B). 43유전자의 유전자 온톨로지는 ErbB 신호전달 경로의 농축뿐만 아니라 면역 관련 경로 및 사이토카인 반응(그림 6C) 및 ERBB4 발현이 모든 영역에서 추가로 확인되었습니다.신장세포(그림 6D). 전체적으로 이러한 결과는 VMI 동안 높은 수준의-222-3p가신장상피 세포는 두 가지 모두에 관여하는 유전자의 강력한 억제와 관련이 있습니다.신장상피의 전해질 항상성 경로 및 면역 관련 경로.
miR-150-5p는 MVI 동안 T 림프구에서 NF-kB 활성화를 조절합니다 유사하게, 우리는 T 세포 클러스터에서 MVI 동안 miR-150-5p의 조절 역할을 조사했으며, 여기에서 가장 우세하게 발현되었습니다 (그림 4A). 우리는 대량 동종 이식 생검 샘플에서 확인된 58개의 감소된 MVI 관련 DEG를 플로팅하고(그림 3B) sc-RNAseq T-세포 클러스터에서 유전자 발현에 직면했습니다(그림 7A). miR{11}}p에 의해 표적화되고 MVI 동안 T 세포에서 특이적으로 과소발현되는 유전자의 비율은 놀라울 정도로 낮았으며(15/58,25.9%), 이는 생체 내에서 이러한 유전자의 전체적인 감소가 배타적 원인이 아님을 시사합니다. T 림프구 구획. 그럼에도 불구하고 이 15개 유전자의 고도로 선택된 목록에서 OMICSnet 플랫폼을 사용하여 유전자 네트워크를 구성하고(그림 7B) 유전자 온톨로지 분석을 수행했습니다(그림 7C). miR{20}}p 과발현이 NF와 관련이 있음을 관찰했습니다. - MVI 동안 T 림프구의 KB 조절.
miR-155-5p는 MV 동안 APC에서 mRNA 스플라이싱을 조절합니다 마지막으로 MVI 동안 과소발현된 52miR-155-5p-표적 유전자에 대해 정확히 동일한 전략을 적용했습니다(그림 3B). T 림프구의 miR-150-5p와 대조적으로 우리는 거의 2/3가 miR{6}}p 표적 유전자 중 APC sc-RNAseq 클러스터에서 지속적으로 감소했습니다(31/52,59.6%, 그림 8A). 유전자 네트워크 분석은 AIFMI와 CIAO1이 중심 유전자임을 보여주었다(그림 8B). 더욱이, 유전자 온톨로지는 mRNA 스플라이싱과 관련된 경로에서 강력한 농축을 나타냈다(그림 8C).
논의독특한 디자인으로 인해 BIOMARGIN 연구는 다중 오믹 데이터 통합을 위한 일반적인 프레임워크입니다. 실제로, 서로 다른 이식 센터의 많은 환자를 포함하는 발견, 선택 및 검증 코호트 모두에서 매우 강력한 파이프라인이 사용되었습니다. 3개의 독립적인 코호트에서 우리는 MVI 동안 6개의 miRNA의 독특한 발현 프로파일을 동시에 관찰하고 확인했습니다. miR-139-5p는 감소한 반면 miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p 및 miR-223-3p가 증가했습니다. 중요하게도, 이 6개의 miRNA 각각의 수준은 MVI 중증도와 상관관계가 있었으며, 이는 용량 의존적 조절 메커니즘을 시사합니다. 우리는 다음으로 각 miRNA 세포 기원을 조사하기 위해 실리콘 플랫폼에서 사용했습니다. 놀랍게도, 두 개의 별개의 miRNA 그룹이 관찰되었습니다. 첫 번째는 침투하는 면역 세포에서 파생되고 두 번째는 상주하는 면역 세포에 더 특이적입니다.신장세포. 그런 다음, miRNA와 mRNA 모두 생검 샘플의 동일한 발견 세트에서 측정되어 MVI와 관련된 생체 내에서 검증된 차등적으로 발현된 mRNA/miRNA의 통합 분석을 가능하게 했습니다. 마지막으로, 벌크 조직 분해능에서 mRNAs/miRNAs 연관을 설명한 후, 우리는 6개의 식별된 miRNA 중 4개에 대해 mRNA/miRNA가 단일 세포 분해능에서 상호작용하는 것을 확인했습니다.
흥미롭게도 miR{0}}p는 MVI 병변과 음의 상관관계가 있는 유일한 miRNA였습니다. 주로 EC에서 유래했으며 MHC 관련 유전자를 조절하는 것으로 보고되었습니다. 표적 유전자 중 UBE2D1은 MVI와 관련된 내피 활성화 동안 고도로 상향 조절되었습니다. UBE2D 계열은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에서 E2 유비퀴틴 접합 효소 계열이며(29, 30) UBeD1은 March-I 유비퀴틴화를 향상시켜 MHC 클래스 II 단백질의 상향 조절을 유도하는 것으로 나타났습니다(31). 또한, GBP5는 MVI 동안 가장 대표적인 유전자 비활성화 EC였으며, 이는 GBP5가 ABMR 생검(17)뿐만 아니라 혈액 샘플(32)에서도 높게 상향 조절된다는 우리의 최근 보고서와 일치합니다. 흥미롭게도, GBP5 발현은 CXCL9 및 CXCL10(33)과 함께 인간 자궁 미세혈관 내피 세포에서 유형 II 인터페론에 의해 유도될 수 있는 것으로 나타났습니다. 급성 거부 반응 과정에서 이 두 가지 전염증성 케모카인의 초기 역할은 잘 문서화되어 있으며 신장 이식 수용자의 일상적인 감시에서 급성 거부 반응 위험을 모니터링하기 위해 소변 내 농도가 제안되었습니다(34). 또 다른 miR{23}}p 표적은 YWHAG.YWHAG가 HLA-F의 단백질 계열을 코딩하며 당뇨병성 신증에서 활성 섬유화 과정 동안 차등적으로 발현되는 것으로 설명되었습니다(35). 염증 후 최종 공통 경로인 섬유증에서 miR{26}}p의 가능한 역할은 IFTA가 최근 ABMR 후 신장 동종이식편 생존을 예측하기 위한 종합 점수에 포함되었다는 점에서 더욱 관련이 있습니다(36). 종합하면, 이러한 결과는 miR{28}}p가 MVI 동안 Anethum 표면에서 더 이상 MCH 항원 발현을 억제하지 않고 화학유인 및 섬유증 과정에 참여할 수 있음을 시사하지만, 이러한 메커니즘은 MVI 및 MVI 동안 내피 표면에서 실험적으로 확인된 발현으로 남아 있습니다. 화학 유인 및 섬유화 과정에 참여할 수 있지만 이러한 메커니즘은 실험적으로 확인된 상태로 남아 있습니다.
두번째신장우리가 식별한 -유도된 miRNA는 miR{1}}p이며, 그의 발현은 MVI 병변에 더 특이적입니다. 이는 g 및 PTC 점수 및 C4d 침착과 관련이 있지만 i 또는 t 병변과는 관련이 없습니다. 그러나 주로 상피 세포에서 유래했습니다. 세포 분해능에서 multi-omic 통합 후, 우리는 miR{4}}p가 증식, 이동, 성장 및 분화와 같은 기본적인 세포 기능에 중요한 ErbB 신호 전달을 주로 억제한다는 것을 확인했습니다(37). 인간 생물학에서 생리적 ErbB 신호는 다음을 위해 필요합니다.신장전해질 항상성과 신장 완전성의 유지(38). 우리의 결과는 또한 ADAM22, NRG1, ZNF91을 ErbB 신호 전달 관련 유전자로 MVI 동안 상피에서 현저하게 억제되는 것으로 확인했습니다. ATP1B1 및 KIF3B와 같은 신장 생리학에 필수적인 다른 유전자도 MVI 동안 miR{8}}p에 의해 신장 상피에서 억제되었습니다. 이전에 Baker et al. ATP1B1(Na + /K + -ATPase의 b1 서브유닛)이신장나트륨의 세뇨관 재흡수(39). 또한 Aguado-Fraile et al. 쥐 근위 세뇨관 세포에서 세포 인신 매매에 관여하는 것으로 Kinesin Family Member 3B (KIF3B)를 확인했습니다. KIF3B는 허혈/재관류에 대한 근위 상피 세뇨관 세포 반응의 핵심 매개체로 나타납니다.신장허혈성 손상 관리(40). 따라서 우리는 miR{1}}p가 상피에서 MVI 동안 필수 생리학적 경로를 억제한다고 추측할 수 있습니다. 또한 면역 관련 경로는 miR-222-3p 과발현에 의해 조절됩니다. TRAP1 및 PEBP1과 같은 중요한 유전자는 MVI가 강한 샘플에서 완전히 억제되었습니다. 흥미롭게도 TRAP1은신장편측성 요관 폐쇄가 있는 생쥐의 세뇨관간질 섬유화증신장관상 상피 세포 미토콘드리아(41). 또한, PEBP1은 항상성/기저 조건에서 MAPK 및 NF-kB 경로 모두의 억제를 통해 항염증 효과를 제공합니다(42). ~ 안에신장상피, Marko et al.의 연구. 허혈 후 NF-kB 활성화가 세뇨관 손상을 악화시키고 염증을 악화시킨다는 것을 우아하게 보여주었습니다(43). 우리의 손에서 PEBP1은 miR-222-3p에 의해 완전히 억제되었으며, 이는 MVI 동안 NF kB 경로가 해제됨을 시사합니다. 종합하면, 이러한 결과는 상피 생물학이 MVI 및신장상피 세포는 MVI 손상에 적극적으로 반응하지만 MVI에서 이 조직의 관련은 거의 해결되지 않습니다. 이러한 분자적 발견은 잘 정립되었지만 오랫동안 무시되어 온 ABMR 기준인 급성 세뇨관 손상 병변에 대한 새로운 정보를 제공할 수 있습니다. 게다가, 상피 세포는 엑소좀 miR{2}}p를 분비하고 대식세포에서 M2 표현형을 유도할 수 있는 것으로 나타났습니다(44). 한편, Li et al. 아주 최근에 M2 대식세포가 miR{6}}을 과발현하고 엑소좀 분비를 통해 미세 환경에서 이 miRNA를 전달한다고 보고했습니다. 신장 이식에서 miR-155은 다양한 상태(IFTA, 급성 거부 반응 및 TCMR)와 체액 또는 조직에서 증가했습니다(45). 흥미롭게도 miR- 155은 상피 세포에서 RASSF4를 표적으로 하여 상피-중간엽 전이를 촉진할 수 있습니다(46). 이 miRNA 기반의 대식세포와신장상피 세포는 여전히 평가되어야 합니다.신장 이식특히 MVI의 맥락에서. 이러한 발견에 따라 우리는 miR{0}}p가 주로 단핵구와 대식세포를 포함하는 APC에 의해 발현된다는 것을 관찰했습니다. 이 특정 하위 집합에서 miR{1}}p-표적 유전자 온톨로지는 premRNA 스플라이싱 경로가 풍부함을 나타냅니다. 흥미롭게도 Janssen et al. 폐 염증이 폐포 대식세포에서 pre-mRNA 스플라이싱 경로를 유도한다고 보고했습니다. 또한, pre-mRNA 스플라이싱 활성화는 (혈액 모집) 단핵구 유래 대식세포와 비교하여 조직 상주 대식세포에서 달랐습니다. 모집된 대식세포에서 핵심 대사의 변화가 보고되었으며 해당 과정을 통한 유출 증가와 트리카르복실산 회로(TCA 회로, 즉 Krebs 회로)를 통한 유출 감소가 보고되었습니다(47). miR-150-5p와 관련하여 우리는 MVI 동안의 과발현이 선천적 NKT 세포와 적응 T 세포를 모두 포함하는 림프구 클러스터의 NF-kB 경로와 관련이 있음을 발견했습니다. 흥미롭게도 miR{11}}p는 성숙하고 기능적인 NK 세포를 생성하는 데 중요하며(48) miR{13}}p 결핍 CD8 + T 세포는 세포 독성이 덜한 것으로 보고되었습니다(49). 게다가, CD8 T 세포는 또한 엑소좀에서 miRp를 분비할 수 있으며(50), 이는 차례로 관 상피 세포에서 섬유아세포 활성화를 촉진할 수 있습니다.신장최근 보고서(51, 52)에 의해 제안된 섬유화증.
CISTANCHE는 신장/신장 기능을 향상시킵니다.
우리의 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우리는 다단계 설계에서 일관되게 식별된 6개의 miRNA에 대한 연구에 집중했습니다. 그러나 우리는 검증 코호트에서 정량화된 모든 알려진 miRNA의 일부만 사용하여 단계별 miRNA 선택을 진행했습니다. miRNA 선택을 위한 통계적 경로는 BIOMARGIN의 초기 설계에 의존했으며, 이는 여러 종점(ABMR뿐만 아니라 TCMR 및 IFTA)에 대한 진단 바이오마커를 식별하는 데 적합합니다. 따라서 발견 및 선택 코호트에서 크게 증가했지만(그림 2A), miR{4}}a는 검증 코호트에서 정량화되지 않았습니다. 따라서 miR{5}}은 문헌에서 신장 이식(53) 및 Treg 매개 동종면역 반응 조절(54)에서 허혈/재관류의 역할을 시사하지만 사실상 우리의 선택 과정에서 제외되었습니다. 또한, 더 강력한 샘플 크기가 miR-138(아래) 및 miR{10}}(위)와 같이 선택 코호트의 ABMR 사례에서 차등적으로 발현된 더 많은 miRNA를 산출했을 것이라는 점을 배제할 수 없습니다. 발견 코호트에서 같은 방향으로 경향을 보였다. 게다가, 우리는 자체 생검 샘플에 대해 sc-RNAseq 분석을 수행하지 않았지만 온라인에서 사용 가능한 sc-RNAseq 데이터 세트를 사용했습니다. 연구 설계 및 생검 샘플 수집 당시 scRNAseq 기술은 실제로 아직 사용할 수 없었고 새로 수집된 샘플이 필요하여 냉동 또는 파라핀 포매 샘플을 소급적으로 사용할 수 없었습니다. 유사하게, mRNA 프로파일링은 현재 차세대 RNA-seq에 의해 능가하는 당시의 벤치마크 기술인 마이크로어레이를 사용하여 수행되었습니다. 온라인에서 사용 가능한 sc-RNAseq 데이터 세트를 사용하면 환자의 기본 인구 통계학적 특성을 보고하는 능력이 제한됩니다. 이 누락된 정보는 인구 집단의 대표성에 대한 우려를 불러일으킬 수 있습니다. 또한, 우리는 시퀀싱의 기술적 측면을 제어하지 않았습니다. 따라서 선택한 해상도에서 sc-RNAseq 분석은 이러한 샘플에서 호중구 또는 NK 세포 클러스터를 감지하지 못했습니다. 따라서 miR{19}}p 및 miR{20}}p의 다운스트림 분석은 각각의 표적 유전자 네트워크 및 온톨로지를 구축하는 것으로 제한되었으며(보충 그림 S2) 단일 세포 분해능 탐색을 허용하지 않았습니다. 그러나 miR{24}}p의 27개 표적 유전자의 유전자 네트워크와 온톨로지는 ERBB 신호 전달과 함께 TCA 주기의 농축을 나타냈습니다(보충 그림 S2). 따라서 우리는 단핵구의 miR-155-5p와 호중구의 miR{27}}p가 모두 MVI 동안 이들 세포가 관여하는 대사 및 염증 반응에서 역할을 한다고 추측할 수 있습니다. 또한 miR{28}}p는 이미 신장 동종 이식 거부 반응에서 증가하는 것으로 나타났지만(9, 55, 56), 지금까지 ABMR과 구체적으로 연관되지는 않았습니다. 우리 연구의 또 다른 한계는 희귀 침투 세포의 특정 유전자 발현 변화가 대량 유전자 발현 분석에서 가려질 수 있다는 것입니다. 따라서 더 많은 샘플을 포함하는 추가 연구가 모든, 심지어 희귀한 세포 하위 유형에 대한 적절한 조사를 허용하기 위해 필요하지만 현재 기술의 상대적으로 높은 비용으로 인해 제한적입니다.
결론적으로, 우리는 여기에서 ABMR과 관련된 주요 조직학적 손상인 MVI와 관련된 분자 경로를 조사했습니다. 사용된 통합 omics 접근 방식을 통해 MVI와 관련된 새로운 경로를 밝힐 수 있었고 ABMR의 결과로 관형 상피 대사 변형이 인근 내피 구획을 넘어 발생한다고 제안합니다. 우리의 연구는 질병 메커니즘을 풀기 위한 멀티오믹스의 큰 잠재력을 보여주고,신장상주 및 동종이식편 침투 세포 하위 집합.
