이포스파미드 독성에 대한 조사는 간과 신장에서 일반적인 상류 조절제를 유발합니다
Feb 28, 2022
한형윤 외
추상적인:
이포스파미드는 다양한 고형암을 치료하는 데 사용되는 시클로포스파미드의 합성 유사체인 알킬화제입니다. 이 연구에서 이포스파마이드의 독성은 우수 실험실 관리 기준(Good Laboratory Practice) 지침에 따라 쥐에게 단일 및 다중 용량 복강 내 투여를 사용하여 평가되었으며 독성학적 발견을 뒷받침하기 위해 추가 마이크로어레이 실험이 따랐습니다. 이포스파미드(50mg/kg)의 단일 용량은 병리학적 변화를 유도하지 않았습니다. 한편, 7일 및 28일 연속 투여군에서 심각한 신독성이 관찰되었으며 혈중 요소질소 및 크레아티닌 수치가 유의하게 증가하였다. 독소 목록 분석에서 콜레스테롤 합성 관련 유전자는 간에서 대부분 영향을 받았고 신부전 관련 유전자는 간에서 영향을 받았습니다.신장이포스파미드 투여 후. 또한, 인터페론 조절 인자 7은 두 가지 모두에서 변경된 주요 업스트림 레귤레이터로 선택되었습니다.간그리고신장, ubiquitin 특이적 peptidase 18, 2를 포함하는 라디칼 S-adenosyl methionine 도메인, 인터페론 자극 유전자 15와 같은 다른 표적 유전자와 상호작용하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 실시간 RT-PCR 분석으로 추가로 확인되었습니다. 결론적으로, 신장 편향된 이포스파미드 장기 독성을 재확인하고, 양쪽 모두에서 동일하게 변경된 유전자를 확인했습니다.간그리고신장. 이포스파미드 유도 유전자와 장기 독성 사이의 정확한 관계를 밝히기 위해서는 더 포괄적인 독성유전체학적 연구가 필요합니다.
키워드:이포스파미드; 간독성; 신독성; 복강내 독성
1. 소개
Ifosfamide는 육종 및 림프종을 포함한 다양한 고형암을 치료하는 데 사용되는 시클로포스파미드의 합성 유사체인 알킬화제입니다. 이포스파미드는 DNA 복제와 RNA 생산을 방해하는 세포주기 비특이적 항암제이다[1]. 이포스파미드는 다른 독성 알킬화제에 비해 상대적으로 내약성이 우수하지만 임상 사용을 제한하는 수많은 생명을 위협하는 부작용과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다[2]. 이포스파미드의 주요 부작용에는 급성을 포함한 이포스파미드의 반응성 독성 종으로 인한 심각한 신장 손상이 있습니다.신장 부상, 간질성 신염, 출혈성 방광염, 판코니 증후군[3]. 임상에서 초기 신독성과 반복적인 고용량 이포스파미드로 유발된 하나의 장기 부전으로 이어진 장기 부전을 경험한 환자에서 심각한 다장기 독성이 보고되었습니다[4,5].
이포스파미드, 아크롤레인 및 클로로아세트알데히드의 독성 대사산물은 이포스파미드 장기 독성의 주요 원인입니다. 이전 연구는 주로 이포스파미드가 독성 대사산물, 특히 시토크롬 P450(CYP)으로 전환되는 데 영향을 미치는 요인에 중점을 두었습니다[6]. 신장에 상대적으로 풍부한 CYP3A4와 CYP3A5는 이포스파미드의 독성 변화를 일으켜 신독성을 유발한다[7]. 아크롤레인은 세포 내 반응성 산화 유전자 경로를 활성화하고 세포 소기관을 손상시킬 수 있는 반응성이 높은 알데히드입니다. 클로로아세트알데하이드는 세포내 글루타티온(GSH) 고갈 및 세포 사멸로 이어질 수 있는 미토콘드리아 호흡 사슬에서 복합체 I 활성화의 억제를 보고했습니다[8].
다기관 독성 연구는 독성 연구를 위해 특정 장기를 대상으로 하는 것보다 약물의 전신 효과를 이해하는 데 더 도움이 됩니다. 간과 신장은 약물 대사 및 배설에 관여하는 주요 기관이며 이러한 주요 기관은 약물 부작용에 취약합니다. 장기 독성이 종종 뒤따릅니다. 더욱이, 통합 독성학적 평가는 시스템에서 약물 유발 독성을 이해하고 예측하는 데 도움이 될 수 있는 다양한 병리학적 소견을 제시할 수 있습니다.
많은 연구에서 유전자 발현 프로필을 사용하여 화학 물질의 잠재적인 부정적인 영향을 예측했습니다. 그러나 대부분의 초기 연구는 제한된 병리학적 증상으로 단일 표적 장기 독성을 평가하는 데 중점을 두었습니다[9]. 또한, 마이크로어레이 기반 유전자 프로파일링과 결합하여 잠재적인 약물 관련 독성을 예방할 수 있는 독성에 대한 포괄적인 시스템 수준 이해를 생성할 것입니다[10]. 이와 관련하여 독성 예측 모델 연구에서 유전자 발현 프로파일링을 이용한 통합 다기관 독성학적 접근이 시스템 내 약물의 독성 메커니즘을 이해하기에는 불충분한 단일 기관 독성 평가에서 파생된 독성 데이터를 극복하기 위해 사용되었습니다[11].
이 연구에서 우리는 이포스파미드의 독성을 설명합니다.신장그리고간Sprague-Dawley (SD) 쥐에서 급성 및 반복 노출 후. 지지 유전자 발현 프로파일링 분석을 수행하여 간 및 양쪽 모두에서 이포스파미드에 의해 변경된 공통 표적 유전자를 밝혀냈습니다.신장, 통합 이포스파미드 독성에 대한 통찰력을 제안합니다.
2. 결과
2.1. 단일 용량 독성 연구
12.5, 25 및 50 mg/kg 이포스파미드 그룹에서 독성이 관찰되지 않았으며 사망, 독성 증상, 체중 변화 또는 조직병리학적 소견이 관찰되지 않았습니다.
한편, 혈액학 연구에서 망상적혈구(RET)의 상대 수와 호중구(NEUA) 및 림프구(LYMA)의 절대 수는 용량 의존적으로 감소했습니다.
2.2. 1주 반복 투여 독성 연구
이포스파미드 투여 1주 후 전체 체중이 감소하였고, 체중 감소의 평균값은 100 mg/kg 그룹이 75 mg/kg 그룹보다 높았다(Table 1). 한편, 상대적 장기 중량은 이포스파미드 처리군에서 점차 증가하였다(표 2).
1주 연속 이포스파미드 IP 투여는 RBC, HGB, HCT, MCV, PLT를 포함한 혈액학 지수를 용량 의존적으로 억제하였다(표 3). 또한 BUN과 CREA는 대조군에서 이포스파미드군에 비해 1.2배 증가하였다(표 4).신장부상조직 병리학 연구에 의해 추가로 지원되었습니다.
75 및 100 mg/kg 이포스파미드 그룹의 마우스 간에서는 조직병리학적 징후가 관찰되지 않았습니다(그림 1A). 한편,신장75 및 100 mg/kg 이포스파미드 군에서 세뇨관 변성/확장(100 mg/kg 군에서 중등도 1개), 단세포 괴사, 요로상피 증식증 및 국소 출혈을 포함하여 최소에서 경미한 등급의 병리학적 변화가 있는 것으로 밝혀졌습니다. /혼잡(표 5). 또한 신장 세뇨관 영역에서 KIM{6}} 발현의 명백한 증가가 관찰되었습니다.신장100 mg/kg 그룹의 (그림 1B).
2.3. 4주간 반복 투여 독성 연구
연속 투여 21일 및 10일 후 각각 50(5/10) 및 70(10/10) mg/kg 처리군에서 사망률이 관찰되었다. 또한, 상대적 장기 중량이 증가함에 따라 체중 감소,간, 그리고신장, 모든 ifosfamide 처리 그룹에서 4-주 반복 투여 독성을 지원합니다.
생존한 대상에 대해 혈액학적 및 혈청 생화학적 분석을 수행했습니다. RET, RBC, MONA, EOSA 및 LUCA를 포함한 여러 혈액 매개변수는 이포스파미드 투여 4주 후에 유의하게 감소했습니다.
대조군과 비교하여 생화학적 분석은 이포스파미드 투여 4주 후 통계적 차이를 보였다. 예를 들어, 50 mg/kg 처리군에서 대조군에 비해 AST 및 CK 수준이 유의하게 증가하였고 A/G 비율, GLU 및 GGT가 감소했습니다(p < 0.01).="">
2.4. 이포스파미드 유도 유전자 발현 분석
이포스파미드로 유도된 DEG는 간에서 확인되었으며신장조직(표 6). 간에서, 차등적으로 발현된 유전자는 100 mg/kg BW/day에서 2672개의 유전자를 포함하고, 1283개의 유전자가 상향조절되고, 1389개의 유전자가 하향조절되었다. 신장에서 401개의 유전자가 100mg/kg BW/day에서 차등적으로 발현되었습니다. 149개의 유전자가 상향 조절되고 252개의 유전자가 하향 조절되었습니다. 간과 신장 모두에서 하향 조절된 유전자의 수가 상향 조절된 유전자의 수보다 더 많았다. 이것은 ifosfamide 치료가 유전자 발현을 억제하는 것으로 보입니다.
생물학적 기능 분석 결과는 표 7에 나열되어 있습니다. 1-주 ifosfamide 투여는 주로 간에서 기관 발달과 관련된 유전자를 변경하는 것으로 나타났습니다. 에서신장, 면역세포의 국소화와 관련된 유전자가 대부분 영향을 받는 것으로 확인되었다.
DEG의 표준 경로 분석에서 콜레스테롤 합성 및 항원 제시 경로 관련 유전자의 변화는간그리고신장조직, 각각 (그림 2). 또한, LXE/RXR 및 급성기 반응 신호전달은간그리고신장각각 지질 항상성과 염증성 사이토카인 신호전달과 관련이 있습니다.
간 독소 목록 분석에서 콜레스테롤 합성 관련 유전자가 대부분 영향을 받았고 양성 급성기 반응 단백질과 급성 신부전 패널이 그 뒤를 이었다(Table 8). 또한, 신장 목록 결과는 가역성 사구체신염 바이오마커 및 급성 신부전 패널을 포함하여 신부전 관련 유전자가 일반적으로 이포스파미드에 의해 영향을 받는 것으로 나타났습니다.
IPA 지식 기반을 기반으로 일반적인 상류 조절자는 이포스파미드 치료 후 간과 신장에서 유전자 발현을 조절합니다(그림 3). IRF7은 간과 신장 모두에서 변화하는 주요 조절자였으며 USP18, RSAD2 및 ISG15와 같은 다른 표적 유전자와 상호작용하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 실시간 RT-PCR 분석을 통해 IRF7, USP18, RSAD2, ISG15의 발현을 확인하였다. 각 유전자의 변화 정도는 간과 신장에 따라 다르지만, 이포스파미드 투여 1주일 후 간과 신장 조직 모두에서 발현이 억제되었다. RSAD2와 USP18은 각각 간과 신장에서 이포스파미드 처리에 의해 대부분 유전자를 변형시켰다.
3. 토론
이 연구에서는 GLP 표준에 따라 쥐에서 IP 경로를 통해 다양한 용량과 노출 조건으로 여러 기관에서 포괄적인 이포스파미드 독성을 조사했습니다. 임상에서 이포스파미드는 입양 면역 요법과 결합된 세포 독성 및 면역 조절 효과와 함께 이중 모드 항종양 작용을 나타낼 수 있습니다[12]. 이포스파미드는 주로 신장경로를 통해 제거되는 것으로 알려져 있으며 투여량의 약 80%가 변하지 않은 형태이며 신독성은 이포스파미드의 일반적으로 알려진 부작용이며 클로로아세트알데히드 및 아크롤레인과 같은 대사산물이 임상적 사용을 담당한다[13, 14].
본 연구에서 1-주 반복 독성 연구는 이포스파미드 유래 장기 독성을 탐색하는 데 적합했습니다. 1주일 동안의 이포스파미드 투여는 용량 의존적 방식으로 혈액 지수를 억제했는데, 이는 전형적인 이포스파미드 유래 골수 억제를 반영할 수 있습니다. 신독성과 함께 골수억제가 주요 용량 제한 이포스파미드 독성 중 하나이며 백혈구 감소증이 일반적으로 혈소판 감소증보다 더 심각하다는 여러 보고가 있습니다[15,16]. Ifosfamide 신독성은 근위세뇨관 기능의 손상으로 비가역적인 손상을 일으키는 Fanconi 증후군을 유발할 수 있으며 독성 대사산물인 acrolein은 출혈성 방광염과 함께 요독성을 유발한다[17]. 이는 본 연구의 결과와 일치한다. 조직 병리학 연구에서 신장과 간을 검사하여 이포스파미드 유래 병리학적 변화를 조사했습니다. 75 및 100 mg/kg 이포스파미드 투여군에서 신우 부위의 요로상피 증식증과 함께 세뇨관 변성 및 확장의 넓은 영역이 감지되었습니다. 또한, 신장 근위 세뇨관 손상 분자인 KIM{12}}의 발현은 이포스파미드 관련 신독성의 존재를 뒷받침했습니다. 한편, 간에서는 최소한의 문맥주위 공포(periportal vacuolation)만이 관찰되었다. 또한, AST와 ALT 값은 용량 의존적으로 감소하였지만, 그 변화는 참고 범위 내에 있었다[18]. 간 효소 수치 감소에 대한 더 깊은 이유는 더 연구해야 합니다. 일반적으로 이포스파미드는 간독성과 드물게 연관되는 알킬화제로 인정되며, 특히 독소루비신과 같은 다른 화학요법 약물과 병용할 때 간 손상을 유발하는 경우가 소수에 불과합니다[19].
최근 고처리량 기술을 이용한 독성학의 유전자 발현 데이터의 눈부신 발전으로 독성 연구에서 충분히 큰 데이터 세트가 생성되었으며, 유전자 프로파일을 화학적 독성 예측에 적용하려는 많은 시도가 이루어졌다[10,20]. 본 연구에서는 이포스파미드 투여에 의해 유도된 전사체 반응을 분석하기 위해 마이크로어레이 분석을 수행하였으며, fold change가 1.5 이상인 DEG를 표적 유전자로 선정하여 생물학적 기능, 정준경로, Tox list 분석을 이용하였다. 이포스파미드 유도 유전자의 기능을 이해한다. 간과 신장에서 다기관 독성의 가능성을 평가하기 위해 추가적인 상류 조절자 분석이 수행되었습니다.
이 연구에서는 DEG가 1.{1}}배 변경되었으며 간(52%)과 신장(62%) 모두에서 하향 조절된 유전자가 상향 조절된 유전자보다 약간 더 우세했습니다. 생물학적 기능 분석 결과, 이포스파미드는 간과 신장에서 공통적으로 관찰되는 조직 발달과 관련된 생물학적 기능으로 유전자를 변화시키는 것으로 나타났습니다.
Snouber et al.의 이전 연구. [21]은 이포스파미드 처리가 미세유체 배양에서 Nrf{2}} 매개 스트레스 산화 반응 경로를 하향 조절하는 것으로 밝혀졌다고 보고했습니다[21]. 이전 연구와 일관되게, NRF{4}}매개 산화 스트레스 반응 경로는 상위 네트워크에 의해 크게 조절되었으며, 이는 현재의 표준 경로와 독소 목록 분석에 의해 확인되었습니다. 현재 변경된 Nrf-2 매개 스트레스 산화 반응 경로는 이포스파미드 독성 대사산물과 밀접한 관련이 있을 수 있습니다. 다중 이포스파미드 독성 대사산물은 강력한 항산화제인 GSH와 반응하여 경로를 따라 다른 부위에서 접합체를 형성할 수 있으며, GSH 수준의 감소는 독성을 증가시키며, 이는 이포스파미드 장기 독성에서 산화 스트레스의 의미를 나타냅니다[8,22 ]. 이와 관련하여 메스나 및 N-아세틸시스테인을 사용하여 이포스파미드 장기 독성을 완화시켰다. Mesna는 Michael 첨가를 통해 주로 아크롤레인에 대한 이포스파미드 독성 대사산물에 결합하여 덜 유해한 물질을 형성함으로써 지역 해독제 역할을 합니다[23]. 또한, N-아세틸시스테인은 항산화 활성을 갖고 산화 스트레스 조건에서 GSH 고갈을 개선하는 것으로 보고되었습니다[24]. 이포스파미드 해독제와 신독성 조건에서 조절되는 경로 사이의 정확한 관계를 밝히기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 메스나 또는 N-아세틸시스테인에 의한 이포스파미드 독성 개선이 Nrf 매개 스트레스 산화 반응 경로를 개선할 수 있다고 추측할 수 있습니다.
이 연구에서 염증 관련 신호는 간과 신장 모두에서 일반적으로 상향 조절되었으며, 이는 표준 경로 분석에서 급성 단계 신호로 인식될 수 있습니다. 이 결과는 두 조직 모두에서 이포스파미드 장기 독성의 병태생리학에서 염증 반응의 의미를 나타내었으며, 이는 상류 조절자 분석에 의해 추가로 뒷받침되었습니다. 상류 조절자 분석에서 USP18, RSAD2, ISG15를 포함한 IRF7과 인터페론(IFN) 신호 관련 유전자가 간과 신장의 공통 상류 조절자로 선택되었습니다. IRF7은 면역세포의 세포질에서 구성적으로 발현되는 림프구 특이적 인자로서 I형 인터페론, 바이러스 감염, 다양한 세포의 외부 자극에 의해서도 유도될 수 있다[25]. 이전 연구에서는 다양한 종양 세포에서 논란의 여지가 있는 IRF7의 발암성 또는 항종양성 특성을 보고했으며, IRF7 발현의 변화는 DNA 손상과 관련이 있었습니다[26-28].
IRF7은 항바이러스 기능에 대한 I형 IFN에서의 중요한 조절 역할 외에도 TLR4 신호 전달 경로를 통해 염증 반응을 억제하는 것으로 보고되었습니다[29]. 또한 Stout-Delgado et al. [30]은 노화로 인한 산화적 증가는 IRF7 활성을 손상시키는 반면 항산화제에 의한 스트레스 감소는 IRF7 활성을 향상시킨다고 보고했다. 이 연구에서 이포스파미드 투여는 상류 조절인자의 발현을 억제하였고, 발현 패턴은 간과 신장 모두에서 동일하였다. IRF7 발현의 현재 변화는 염증 반응 및 이포스파미드의 세포독성 알킬화제 특성과 관련될 수 있으며, 이는 IRF7이 이포스파미드 장기 독성에 대한 유망한 표적임을 시사할 수 있습니다.
이 연구에서 우리는 이포스파미드 투여 후 간과 신장 모두에서 동일하게 억제되는 유전자를 발견했지만, 그 독성학적 중요성에 대한 해석은 신장에만 집중되어 있어 현재의 발견을 제한합니다. 더욱이, 현재 변경된 유전자에 대한 상업적으로 이용 가능한 이포스파미드 해독제의 효과와 관련된 추가 확인 연구는 현재 발견을 뒷받침할 수 있습니다.
결론적으로, 이포스파미드 투여에 대한 반복 독성 연구(1주)는 간독성보다는 편향된 신독성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 결과는 IRF-7 억제를 포함하는 이포스파미드 유도 간독성 및 신독성 기전에 대한 증거를 제공합니다. 이포스파미드의 전신 독성 기전을 밝히고 유전자와 장기 독성 사이의 관계를 뒷받침하기 위해서는 면역 관련 장기에 대한 추가 독성유전체학적 연구가 필요합니다.
4. 재료 및 방법
4.1. 동물 연구
8주령 수컷 특이적 병원체가 없는 Sprague-Dawley(SD) 쥐(n=140)를 Orient Bio Inc.(한국 성남)에서 입수했습니다. 실험 전 일주일 동안 동물을 검사하고 실험실 환경 조건에 적응시켰다. 모든 동물은 통제된 실험실 조건(온도, 23 ± 3 ºC, 습도, 55 ± 10%, 12/{10}}h 명암 주기)에서 플라스틱 케이지에 가두어 실험용 음식과 물을 자유롭게 섭취했습니다. 동물 연구는 한국독성시험연구원(대전, 한국)의 기관동물관리사용위원회의 승인을 받았으며 모든 절차는 식품의약품안전청의 의약품 안전성평가 시험지침에 따라 수행되었습니다. 동물 연구는 단회 투여(급성) 및 반복 투여(1주 및 4주) 연속 투여 독성 연구의 세 부분으로 나눴습니다. 각 독성 연구에서 40마리의 쥐를 Path/Tox 시스템(버전 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA)을 사용하여 4개 그룹(대조군, t1, t2 및 t3)에 무작위로 할당했습니다.
4.2. 독성 실험
독성 연구는 단일 투여(급성) 및 2회 반복 투여(1주 또는 4주 연속 투여) 독성 연구의 3개 섹션으로 구분되었습니다. 각 독성 연구에 대해 쥐를 적절한 그룹(단일 및 4-주 독성 연구의 경우 대조군, 용량 1, 용량 2 및 용량 3, 1-의 경우 대조군, 용량 1 및 용량 2)에 무작위로 할당했습니다. Path/Tox 시스템(version. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA)을 사용하여 주 독성 연구). 독성 연구에서 이포스파미드는 복강내(IP) 경로를 통해 투여되었고 대조군은 증류수(DW)를 받았다. 독성 연구에 사용된 이포스파미드 용량은 급성 독성 연구(12.5, 25, 50mg/kg), 1-주 독성 연구(75 및 100mg/kg BW/일), {{19 }}주 독성 연구(25, 50 및 70 mg/kg BW/일). 동물의 일반적인 임상 증상, 체중 및 사망률은 투여하는 동안 매일 기록되었고 모든 동물은 마지막 이포스파미드 투여 후 24시간 후에 희생되었다. 혈액 샘플을 수집하여 혈청 생화학 및 혈액학적 분석을 위해 각각 미세원심분리 튜브 및 EDTA-K2 튜브에 넣었습니다. 간 및 신장 조직을 포름알데히드로 고정하고 조직병리학적 분석을 실시하였다. 추가 면역조직화학, 마이크로어레이 분석 및 실시간 RT-PCR이 아급성 독성 연구(100mg/kg BW/일)의 간 및 신장 조직에서 수행되었습니다.
4.3. 혈액 및 혈청 생화학적 분석
표준 혈액학 검사는 ADVIA 120 혈액학 시스템(Bayer, Fernwald, Germany)을 사용하여 수행되었습니다. 다음 지표가 사용되었습니다: 백혈구 수(WBC), 적혈구 수(RBC), 헤마토크릿(HCT), 헤모글로빈 농도, 평균 미립자 부피(MCV), 평균 미립자 헤모글로빈(MCH), 혈소판 수(PLT), 림프구(LYM), 단핵구(MON), 호중구(NEU), 호염기구(BAS), 호산구(EOS) 및 큰 비염색 세포(LUC) 및 망상적혈구(RET) 수.
생화학 분석은 원심 분리된 혈청이 있는 자동 분석기(TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Japan)를 사용하여 수행되었습니다. 주요 생화학적 지표는 알라닌 아미노전이효소(ALT), 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알칼리성 인산분해효소(ALP), 혈액 소변 질소(BUN), 크레아티닌(CREA), 포도당(GLU), 총 콜레스테롤(TCHO), 알부민/글로불린 비율이었습니다. (A/G), 트리글리세리드(TG), 총 빌리루빈(TB), 감마-글루타밀 트랜스퍼라제(GGT), 인지질(PL), 칼슘, 염화물, 무기 나트륨, 인 및 칼륨.
4.4. 조직병리 및 면역조직화학 검사
파라핀이 포매된 조직을 5-µm 두께로 절단하고 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하고 현미경으로 검사했습니다.
신장 조직에 면역조직화학을 실시하였다. 탈파라핀화되고 세척된 섹션을 10% 염소 혈청과 함께 사전 인큐베이션하여 비특이적 염색을 차단했습니다. 그런 다음 슬라이드를 1차 항-KIM1 항체(1:750; Santa Cruz, CA, USA)와 함께 밤새 인큐베이션했습니다. 일차항체를 제거한 후 절편을 VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit(Vector Laboratories, Peterborough, UK)로 처리하고 광학현미경으로 KIM1 발현을 조사하였다.
4.5. 마이크로어레이 분석 및 단백질-단백질 상호작용(PPI) 분석
1-주(100 mg/kg) 그룹의 간과 신장을 균질화하고 RNase 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출했습니다. cDNA 합성은 cDNA 합성 키트(Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 달성하고 마이크로어레이 및 PPI 분석을 수행했습니다.
Microarray 분석은 Affymetrix GeneChip Rat {{0}.0 GeneChip Scanner 3000(Affymetrix Santa Clara, CA, USA) 및 결과는 GeneSpring GX v13.0 분석 소프트웨어(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 처리되었습니다. 이포스파미드 투여 후 1.{6}}배 이상 변화한 차등 발현 유전자(DEG)는 Tukey의 사후 검정과 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 선택되었습니다. 선택된 DEG의 생물학적 기능과 표준 경로는 Ingenuity Pathway Analysis 소프트웨어(IPA, 버전 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA)를 사용하여 분석되었으며, 상위 레귤레이터 분석을 수행하여 잠재적인 상위 레귤레이터를 식별했습니다. 이포스파미드 독성에서 파생된 DEG에 대한 책임이 있습니다. DEG의 추가 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석은 STRING 소프트웨어(버전 10)를 사용하여 수행되었으며 중간 신뢰도 점수가 0.4 이상일 때 상호작용을 확인했습니다. 단백질 상호작용은 교토 유전자 및 게놈 경로에 있는 두 단백질 사이에 예측된 연결이 존재할 대략적인 확률입니다.
4.6. 정량적 실시간 RT-PCR 연구
마이크로어레이 연구에서 공통 조절 유전자의 발현은 정량적 실시간 RT-PCR을 사용하여 확인되었습니다. 유전자 특이적 프라이머는 바이오니아(대전, 한국)로부터 입수하였다. 프라이머 서열은 다음과 같습니다: 인터페론 조절 인자 7(IRF7): 정방향, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 및 역방향, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; 유비퀴틴 특이적 펩티다제 18(USP18): 정방향, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA{12}} 및 역방향 5-GAACTGATTACCTCCCACTG{14}}; 2(RSAD2)를 포함하는 라디칼 S-아데노실 메티오닌 도메인: 정방향, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 및 역방향, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; 인터페론 자극 유전자 15(ISG15): 정방향, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC{26}}및 역방향, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.
제조업체의 지침에 따라 SuperScript II(Invitrogen, Carls bad, CA, USA) 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사했습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 SYBR Green 마스터 믹스(Applied Biosystems)와 함께 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 업스트림 조절 관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 분석했습니다. 내부 대조군으로는 18S ribosomal RNA primer를 사용하였으며, 그 결과는 정상 대조군에 대한 배수 변화로 표현하였다.
4.7. 통계 분석
데이터는 다중 비교 방법을 사용하여 통계적으로 분석되었습니다. Bartlett의 테스트에서 분산 동질성에서 유의미한 편차가 나타나지 않으면 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 p < {0}}.05의="" 유의="" 수준에서="" 그룹="" 평균이="" 다른지="" 확인했습니다.="" 또한="" dunnett의="" 테스트는="" anova="" 테스트에서="" 데이터가="" 유의미한="" 것으로="" 밝혀졌을="" 때="" 대조군과="" 처리="" 그룹="" 간의="" 데이터="" 차이를="" 결정하는="" 데="" 사용되었습니다.="" 또한="" bartlett의="" 검정에서="" 분산="" 균질성에서="" 상당한="" 편차가="" 관찰되면="" 비모수="" 비교="" 검정인="" kruskal-wallis(h)="" 검정을="" 수행하여="" p="">< 0.05에서="" 그룹="" 평균이="" 다른지="" 확인했습니다.="" kruskal-wallis(h)="" 검정에서="" 유의미한="" 차이가="" 관찰되면="" dunn's="" rank="" subtest를="" 수행하여="" 평균과="" 유의하게="" 다른="" 그룹="" 데이터의="" 특정="" 쌍을="" 정량화했습니다.="" fisher의="" 정확한="" 테스트는="" 데이터="" 쌍(유병률="" 및="" 백분율="" 포함)을="" 비교하기="" 위해="" 수행되었습니다.="" 확률="" 수준은="" 1="" 또는="" 5%로="" 설정되었습니다.="" path/tox(version.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="" usa)를="" 사용하여="" 다른="" 치료군의="" 데이터와="" 대조군의="" 데이터를="" 비교하여="" 통계적="" 분석을="">
데이터 가용성 설명:
데이터는 기사 또는 보충 자료에 포함되어 있습니다.
이해 상충:
저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
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