철분 보충은 미토콘드리아 기능 강화를 통한 노화 지연 및 세포 수명 연장 Ⅱ

3.2. 철분 보충은 산화 스트레스 저항성을 증가시킵니다.

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세포 노화는 다음과 관련이 있습니다.산화 스트레스 증가생물학적 시스템을 손상시키고 노화 관련 질병을 완화시키는 [34]. 철분 보충이 노화를 지연시켰기 때문에산화 스트레스. 우리는산화 스트레스유도 화합물, 과산화수소(H2O2), 세포의 산화 저항성을 테스트합니다. 세포는 먼저 SD 배지에서 정지기 단계(72시간)까지 철의 존재 하에 성장시켰다. 그 후, 세포를 세척하고 다른 농도의 H로 배양했습니다.2O2 YPD 배지에서 24시간 동안 성장시켰다.산화스트레스 저항성은 H2O2- 처리된 세포와 처리되지 않은 대조군의 세포 성장을 비교하여 분석되었습니다. 우리는 철분이 보충된 세포가 대조군에 비해 산화 스트레스에 저항성이 있음을 발견했습니다(그림2및 S3). 철분 보충이 산화 스트레스에 대한 저항성을 제공하는지 확인하기 위해 BPS를 H로 철 및 세포 성장에 첨가했습니다.2O2 분석되었다. BPS의 추가는 철분이 보충된 세포의 산화 스트레스 저항성을 감소시켰습니다(그림2비). 이러한 결과는 노화를 지연시키고 세포 수명을 연장하는 철분 보충의 역할과 관련이 있습니다.

3.3. 철분 보충은 미토콘드리아 기능을 강화합니다

미토콘드리아는 철 이용과 대사를 위한 주요 세포 허브입니다[35–38]. 미토콘드리아 기능의 감소는 노화와 관련이 있습니다[39-43]. 철은 철-황 클러스터 및 헴 함유 단백질을 포함한 여러 미토콘드리아 단백질의 보조 인자 역할을 합니다[44-46]. 이러한 철 함유 단백질은 미토콘드리아 트리카르복실산(TCA) 주기 및 전자 수송 사슬(ETC)에 관여합니다(그림 3a). 우리는 철분 보충에 의한 세포 수명의 증가가 미토콘드리아 기능을 요구하는지 여부를 조사했습니다. 이를 테스트하기 위해 미토콘드리아 TCA 주기 유전자의 발현을 분석했습니다. 우리는 철 보충이 여러 TCA 주기 유전자의 발현을 상당히 유도한다는 것을 발견했습니다(그림 3b 및 S4a). TCA-주기 대사산물인 케토글루타레이트와 옥살로아세테이트는 미토콘드리아에서 격변 반응에 의해 글루타메이트와 아스파르테이트를 생성할 수 있습니다(그림 3a). 이 아미노산은 단백질, 지질 및 뉴클레오티드의 생합성에 이용됩니다[47-49]. 흥미롭게도, 글루타메이트(GDH1 및 GDH3) 및 아스파르테이트(AAT1 및 AAT2) 생합성 유전자의 발현은 철분이 보충된 세포에서 감소했습니다(그림 3c). 이 발현 프로파일은 철분 보충이 TCA 사이클 중간체의 소비 대신 보존을 촉진함을 시사합니다. 이 아이디어와 일치하여 미토콘드리아 보충 경로 유전자(PYC1, PYC2 및 GDH2)의 유전자 발현이 철분이 보충된 세포에서 크게 증가했습니다(그림 3c). PYC1 및 PYC2는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 피루베이트 카르복실라아제를 암호화합니다. GDH2는 글루타메이트로부터 α-케토글루타레이트를 합성하는 글루타메이트 탈수소효소를 암호화합니다. 함께, 이러한 결과는 철 보충이 TCA 주기 대사 산물을 증가시키기 위해 역류증을 예방하고 역류증을 예방하는 대사 상태에서 세포를 구성한다는 것을 시사합니다.

그림 3.철분 보충은 미토콘드리아 기능을 향상시킵니다. (a) 미토콘드리아 개요TCA(트리카르복실산) 사이클과 ETC(전자 수송 사슬)를 주요 촉매제로 하고anaplerotic 반응이 설명됩니다. (b) 원영양 효모 균주를 100µM FeSO4 30에서 8시간 동안 SD 배지에서 성장◦C. 배양액에서 RNA를 추출하고표시된 TCA 주기 유전자의 발현을 정량적 RT-PCR로 분석했습니다. (c) 표현cataplerotic 유전자의 분석 (GDH1, GDH3, AAT1,그리고AAT2) 및 보충 유전자(PYC1, PYC2,그리고GDH2) 정량적 RT-PCR로 수행하였다. (d) ETC 유전자의 발현 분석은정량적 RT-PCR. 통계 학적으로 유의 (*p < 0.05) was determined by Student's t-시험.

TCA 사이클 반응은 NADH와 FADH를 생성합니다.2 ETC 복합체 I 및 II에 의해 산화되고 TCA 사이클의 기능에 필요합니다(그림3ㅏ). 하지만S. 세레비시애complex I이 부족하면 환원 당량은 NADH 탈수소 효소를 통해 호흡 사슬로 전달됩니다. 석신산 탈수소효소는 중심적인 역할을 하며 TCA 주기와 ETC 복합체 II 모두에 참여합니다(그림3ㅏ). 놀랍게도, succinate dehydrogenase(SDH1그리고SDH2)는 분석된 모든 TCA 주기 유전자 중에서 고도로 상향조절되었습니다(그림3b,d). 이러한 결과는 TCA 사이클 플럭스가 특정 중간체를 축적하는 대신 ETC를 향해 계속됨을 나타냅니다. 마찬가지로, ETC 복합체의 다른 모든 유전자의 발현은 철분이 보충된 세포에서 고도로 상향 조절되었습니다(그림3디). ETC는 활성산소종(ROS)의 생성과 관련되어SOD2유전자 [50]. 미토콘드리아 슈퍼옥사이드의 주요 스캐빈저인 망간-슈퍼옥사이드 디스뮤타제(MnSOD)를 암호화합니다.SOD2ETC 유전자의 발현과 일치하는 철분 보충 세포에서 유전자 발현이 상향 조절되었습니다 (보충 그림 S4a). 우리는 ETC 복합체 I, III 및 IV의 양성자 펌프에 의해 생성되는 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 추가로 분석했습니다. 우리는 철 보충이 세포의 MMP를 증가시킨다는 것을 발견했습니다(보충 그림 S4b). 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 미토콘드리아의 구조를 조사했습니다. 우리는 철분 보충이 미토콘드리아의 단편화를 방지한다는 것을 발견했습니다(보충 그림 S4c). 전체적으로, 이러한 결과는 철 보충이 세포의 미토콘드리아 기능을 강화한다는 것을 나타냅니다.

3.4. 철분 보충은 세포 수명 연장에 필요한 ATP 수준을 증가시킵니다.

미토콘드리아 TCA 회로 반응은 전자를 ETC로 전달하고 산화적 인산화(OXPHOS)를 통해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하는 환원 등가물 NADH 및 FADH2를 생성합니다(그림3ㅏ). TCA 회로 및 ETC 유전자의 발현이 철분 보충에 의해 강화되었기 때문에 우리는 ATP 합성에 미치는 영향을 테스트했습니다. 미토콘드리아 TCA 회로의 발현 프로필과 일치하여, ETC 유전자 발현과 ATP 수준은 철분이 보충된 세포에서 높았습니다(그림4ㅏ). 그런 다음 철분이 보충된 세포의 수명을 연장하기 위해 ATP가 필요한지 여부를 질문했습니다. 우리는 ATP 합성을 억제하고 효모의 CLS를 측정했습니다. Antimycin A(AMA)는 복잡한 III에 결합하고 미토콘드리아 ETC에서 전자 전달을 차단하는 ATP 합성의 억제제입니다.51]. 우리는 먼저 ATP 수준을 조사했고 AMA 처리가 ATP 합성을 억제한다는 것을 발견했습니다(그림4비). 철분이 보충된 세포의 세포 수명에 대한 AMA의 효과를 추가로 테스트했습니다. 효모 세포를 SD 배지에서 철 및 AMA와 함께 배양하였다. 세포의 성장은 24시간 후에 포화 상태에 도달했습니다(보충 그림 S5). 그 후, 우리는 생존율을 측정했고 AMA 치료가 철분 보충 매개 수명 연장을 억제한다는 것을 발견했습니다(그림4씨). 함께, 이러한 결과는 철분 보충이 세포 수명 연장에 필요한 ATP 수준을 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 우리는 또한 AMA 처리된 세포의 수명이 대조군보다 낮음을 관찰했습니다(그림4c) ATP를 합성할 수 없으면 수명이 단축됨을 추가로 확인합니다.

3.5. 철분 보충은 AMPK 녹아웃 돌연변이의 가속화된 노화를 방지합니다

AMPK는 세포 에너지 항상성의 마스터 조절자입니다.20,21]. 효모에서 AMPK의 고도로 보존된 인간 유사체S. 세레비시애Snf1 단백질은 [52]. AMPK는 미토콘드리아 기능을 활성화하여 에너지 제한 조건에서 ATP를 생성합니다. 최근 보고에 따르면 나이가 들어감에 따라 미토콘드리아 기능이 감소하는 것은 부분적으로 서로 다른 노화 유기체에서 손상된 AMPK 활동을 통해 발생합니다.53,54]. 따라서 AMPK 활성의 부재는 미토콘드리아 기능에 영향을 미치고 노화와 수명의 가장 중요한 결정 요인인 신진대사, 스트레스 저항성, 세포 생존을 포함한 수많은 세포 기능을 손상시킵니다. 이전 연구와 일치하여 우리는발견snf1녹아웃 돌연변이는 ATP 수준, 산화 스트레스에 대한 저항성 및 수명을 손상시켰습니다(그림5a–c). 

그림 5.철분 보충은 AMPK 녹아웃 돌연변이의 가속화된 노화를 구합니다. 그만큼효모 원영양 야생형 및 AMPK 녹아웃 돌연변이(snf1∆) 균주를 정지 상태로 성장시켰다.30에서 72시간 동안 SD 매체의 상◦C. (a) 야생형의 ATP 분석 및snf1∆ 균주. (b) 산화야생형의 스트레스 분석 및snf1∆ H가 다른 균주2O2 농도. (c) 연대순야생형의 수명(CLS) 분석 및snf1∆ 균주. (d) 야생형의 ATP 분석 및snf1∆ 균주다양한 농도의 FeSO로 배양4. (e) 야생형 및snf1∆ 다양한 농도의 FeSO로 배양된 균주4. (f) 야생형의 CLS 분석 및snf1∆ 다양한 농도의 FeSO로 배양된 균주4. 통계 학적으로 유의 (*p < 0.05) was determined학생의t-시험.

이후snf1돌연변이가 미토콘드리아 기능에 결함이 있는 경우 철 보충이 가속화된 노화 표현형을 구할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 그래서 철분을 보충했습니다.snf1돌연변이를 분석하고 ATP 수준, 산화 스트레스 및 수명을 분석했습니다. 우리는 철분 보충이 ATP 수준, 산화 스트레스에 대한 저항성 및 수명을 증가시킨다는 것을 발견했습니다(그림5d-f). 전체적으로, 이러한 발견은 철분 보충이 미토콘드리아 기능을 증가시켜 노화를 지연시키고 세포 수명을 연장시킨다는 것을 확인시켜 주었습니다.

4. 토론

영양소는 세포의 기능적 상태를 결정하며 필수 영양소의 결핍은 인간의 건강을 위협합니다.55,56]. 또한 영양소는 다음을 포함한 여러 생물학적 과정을 제어하는 ​​세포 대사의 주요 조절자입니다.노화, 여러 주요 위험 요소만성 질환. 감소신진대사 활동의 특징 중 하나이다.노화 [10]. 포유류를 포함한 다양한 유기체에 대한 최근 연구는 라파마이신 및 메트포르민 약물 투여를 포함한 노화 방지 중재를 통해 노화를 지연시키고 건강 기간을 늘릴 수 있음을 입증했습니다.11,16]. 이 약물은 세포의 중요한 대사 조절자인 영양소 감지 복합체 TORC1과 AMPK를 표적으로 합니다.11,16]. 

철분은 세포의 몇 가지 중요한 대사 반응에 관여하는 필수 영양소입니다.23–26]. 철분 결핍은 대사 활동을 손상시켜 세포 기능을 손상시켜 빈혈, 인지 장애,근력 [26,57–59]. 철분 결핍은 노인 인구에서 널리 퍼져 있습니다.보다 크거나 같음65세 [60–62]. 

철분은 대사 과정을 조절하기 때문에 노화에서의 역할을 조사했습니다. 연대순 노화에서 철의 역할을 조사하기 위해 효모를 모델 유기체로 활용했습니다. 우리는 효모의 CLS에 대한 철분 보충의 효과를 조사했습니다. FeSO4 및 FeCl3 세포 수명을 늘렸습니다. 서로 다른 황산 염, 염화물 및 철 킬레이트 염을 사용하여 세포 수명이 철에 의해 연장됨을 확인했습니다. 노화는 세포 기능에 유해하고 세포 생존을 감소시키는 산화 스트레스의 점진적인 축적과 관련이 있다[34]. 철분 보충이 노화를 지연시킨다는 사실을 발견했기 때문에 철분 보충이 산화 스트레스에 대한 저항성을 제공할 수 있는지 테스트했습니다. 산화 스트레스 표현형을 조사하기 위해 세포를 산화 유도제 H로 처리했습니다.2O2 그리고 세포 생존율을 측정했습니다. 우리는 철 보충이 대조군에 비해 산화 스트레스 저항성을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 이러한 발견은 수명 연장에서 철분 보충의 역할과 관련이 있습니다.

우리는 철분 보충의 노화 방지 메커니즘을 더 밝혀냈습니다. 미토콘드리아는 철분 이용과 대사의 주요 세포 소비자입니다.35–38]. 먼저 미토콘드리아 TCA 주기 유전자의 발현을 분석했습니다. 우리는 거의 모든 TCA 주기 유전자의 발현이 철분 보충에 의해 상향 조절된다는 것을 발견했습니다. 중요한 것은, 철분 보충이 미토콘드리아 아나플러시스의 발현을 하향 조절하고 격변 대사 유전자를 상향 조절한다는 것입니다. 이러한 결과는 철 보충이 TCA 주기 중간체의 합성을 강화하고 세포 이용을 방지한다는 것을 보여줍니다. 이러한 발견은 TCA 사이클 중간체의 정기적인 수출이 미토콘드리아 무결성에 영향을 미치기 때문에 철분 보충의 노화 방지 활동을 뒷받침했습니다.47]. 또한 미토콘드리아 탄소 풀을 보충하는 것은 세포 노화 동안 생존에 필요한 미토콘드리아 기능을 유지하는 데 필수적입니다.

TCA 사이클 중간체 -케토글루타레이트는 다른 유기체의 수명을 연장하는 것으로 나타났습니다.63]. 그러나 우리는 철분 보충이 -케토글루타레이트 탈수소효소(KGD1그리고KGD2) 변환 - 숙시닐-CoA를 형성하는 케토글루타레이트. 또한, 우리는 succinate dehydrogenase 유전자(SDH1그리고SDH2)는 TCA 주기의 다른 테스트된 유전자 중에서 고도로 상향조절되었습니다. 중요한 것은 석신산 탈수소효소가 TCA 회로와 ETC 복합체 II 모두에 참여한다는 것입니다. 이러한 결과는 특정 TCA 주기 중간체를 축적하는 대신 철분 보충의 노화 방지 활동이 ETC 경로와 관련될 수 있음을 시사합니다.

TCA주기는 ETC와 기능적으로 연결되어 있기 때문에 ETC 유전자의 발현을 분석했습니다. 우리는 철 보충이 ETC 유전자의 발현을 크게 상향 조절한다는 것을 발견했습니다. TCA 사이클 제품 NADH 및 FADH2 ETC 복합체에 의해 산화되고 OXPHOS를 통해 ATP를 생성합니다. 우리는 철 보충이 TCA 주기 및 ETC 유전자의 상향 조절과 상관관계가 있는 세포 ATP 수준을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 다음으로 우리는 철분 보충에 의한 ATP 수준의 증가가 세포 수명 연장에 필요한지 여부를 해명했습니다. 우리는 철분 보충에 의한 수명 연장이 ATP 합성을 억제함으로써 폐지됨을 발견했습니다. 따라서 이러한 발견은 철분 보충이 세포 수명 연장에 필요한 ATP 수준을 증가시킨다는 것을 시사합니다. 우리의 결과는 세포 수명에서 ATP의 역할을 보여주는 이전 보고서와 일치합니다.51,64,65]. 또한 미토콘드리아 기능을 향상시키기 위해 철분 보충을 활용하고 AMPK 돌연변이의 짧은 수명과 산화 스트레스에 민감한 표현형을 구했습니다. 전체적으로, 이러한 결과는 철 보충이 노화를 지연시키고 세포의 수명을 증가시키는 미토콘드리아 기능을 강화한다는 것을 보여주었습니다.

최근 연구에 따르면 철분 보충은 리소좀이 손상된 돌연변이의 미토콘드리아 결함을 복구하고 노화 동안 미토콘드리아 감소를 방지하는 것으로 나타났습니다.66,67]. 따라서 우리의 결과는 철분 보충이 미토콘드리아 기능을 향상시킨다는 이전 연구 결과를 뒷받침합니다. 흥미롭게도 초기 연구 중 하나는 철분 보충이 리소좀 손상 돌연변이의 가속화된 복제 노화를 구했다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 그야생형 세포에 미치는 영향은 보고서에 포함되지 않았습니다.67]. 그럼에도 불구하고 우리의 결과는 이전 연구 결과와 상관관계가 있으며 다양한 노화 모델(연대기적 노화)에도 불구하고 철분 보충이 노화를 지연시키고 세포 수명을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 따라서 집합적으로 우리의 결과와 이전 보고서는 철분 보충이 노화를 목표로 하고 수명을 늘리는 잠재적인 치료법이 될 수 있음을 분명히 시사합니다.

보충 자료:그림 S1: 철분이 보충된 효모 세포의 성장 및 연대순 수명 분석; 그림 S2: 다양한 철, 황산염 및 염화물 함유 염 보충 효모 세포의 성장 분석; 그림 S3: 철분이 보충된 효모 세포의 산화 스트레스 저항성 분석. 그림 S4: 미토콘드리아 유전자 발현, 막 전위 및 철 보충 효모 세포의 구조 분석; 그림 S5: 철 및 항마이신 A 보충 효모 세포의 성장 분석; 표 S1: 이 연구에서 RT-PCR에 사용된 프라이머 목록.

저자 기여:JLJ: 방법론, 공식 분석, 조사 및 검토; TCYN: 방법론, 공식 분석, 조사 및 검토; FN: 검증, 공식 분석 및 검토; FE: 검토, 편집 및 감독; MA: 개념화, 데이터 큐레이션, 방법론, 작성, 검토, 편집 및 감독. 모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

자금 조달:이 작업은 BII(Bioinformatics Institute), A*STAR Career Development Fund(C210112008) 및 Global Healthy Longevity Catalyst Awards 보조금(MOH-000758-00)의 지원을 받았습니다.

감사의 말:이 연구를 지원해 주신 Maurer-Stroh Sebastian, Lee Hwee Kuan, Loo Lit Hsin, Chiam Keng Hwee, Prakash Arumugam에게 감사드립니다.

이해 상충:저자는 경쟁하는 금전적 및 비재정적 이익을 선언하지 않습니다.

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