Karnovsky의 고정액은 안티센스 올리고뉴클레오티드 Ⅰ로 치료된 신장의 조직 처리에서 파생된 공포증으로 나타나는 인공물을 방지합니다.

추상적인: 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 치료법이 새로운 치료 방식으로 확인되었습니다.난치병. ~ 안에ASO로 치료된 신장, 호염기성 과립 외에도 액포가 근위 세뇨관에서 종종 관찰됩니다. 일부 보고서에서는 이러한 액포가 다음으로 인해 발생하는 2차 현상일 가능성이 있다고 설명했습니다.ASO 추출조직 처리 중. 본 연구에서는 Karnovsky 고정액 또는 4% 파라포름알데히드 인산염 완충액(PFA)으로 고정한 후의 신장 형태를 10% 중성 완충 포름알데히드 용액(NBF)과 비교했습니다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(LNA-ASO)가 포함된 고정 핵산 50mg/kg을 1주 또는 2주 동안 4회 정맥 주사한 암컷 Sprague-Dawley 쥐를 검사했습니다. 현미경적으로 NBF로 고정한 신장에서는 근위세뇨관의 액포와 호염기성 과립이 관찰되었다. 호염기성 과립은 ASO의 축적을 나타냅니다. 또한 일부 액포에는 희미한 호염기성 과립도 포함되어 있어 액포가 ASO 축적과 관련이 있음을 시사합니다. 근위 세뇨관에서는 중등도의 공포가 관찰되었지만, 공포 상피의 대부분은 면역조직화학적 염색에서 신장 손상 분자-1에 대해 음성이었습니다. Karnovsky 고정을 적용한 샘플에서는 근위 세뇨관의 공포가 관찰되지 않았지만 호염기성 과립이 관찰되었습니다. PFA 고정을 받은 샘플에서는 NBF 고정을 받은 샘플과 유사하게 액포와 호염기성 과립이 근위 세뇨관에서 관찰되었습니다. 전반적으로, 우리의 연구 결과는 기존 NBF 고정을 사용할 때 조직 처리 중 인공물로 인한 공포증이 과대평가될 가능성을 보여주었습니다. Karnovsky의 고정액은 인공 액포와 실제 신독성을 구별하는 데 유용한 대안으로 간주됩니다. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

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최근 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 치료법이 난치병 치료를 위한 새로운 방식으로 확립되었습니다1, 2. ASO는 리보핵산에 결합하여 유전자 발현을 억제하는 짧은 합성 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드입니다3.

독성학적으로 ASO 유발 독성은 ASO 서열과 관련된 혼성화 의존성 독성과 화학적 변형과 관련된 혼성화 비의존성 독성으로 분류됩니다. 혼성화와 무관한 독성은 1) ASO 축적, 2) 염증 유발 효과, 3) 앱타머 결합 효과의 세 가지 주요 메커니즘에 의해 유발됩니다4. ASO의 축적은 주로 간과 신장에서 관찰되며 과도한 축적은 이들 기관의 기능 장애로 이어집니다5. 전 염증 효과는 설치류와 원숭이의 Toll 유사 수용체에 대한 결합을 통해 선천성 면역 체계를 자극하거나 원숭이에서 ASO에 의한 인자 H의 억제를 통한 대체 보체 경로의 활성화를 통해 유도됩니다6. 앱타머 결합 효과는 혈소판 활성화 및 응집/혈소판 감소증을 유도하여 혈소판 특이적 수용체에 결합합니다7. 더욱이, 간세포의 세포내 단백질에 대한 앱타머 결합은 간독성의 원인 중 하나로 간주됩니다8-10. 이러한 독성을 탐지하기 위해 연구자들은 여러 가지 비임상 분석법을 개발했습니다. 이들 중 조직병리학적 검사는 ASO 축적을 검출하는 가장 민감한 검사 중 하나입니다.

조직병리학적으로 ASO의 축적은 간이나 신장 근위세뇨관의 쿠퍼 세포의 세포질에서 호염기성 과립으로 흔히 관찰됩니다. 호염기성 과립의 눈에 띄는 축적은 퇴행성 변화의 발생률 또는 심각도 증가와 관련이 있으며, 일반적으로 신장 근위 세뇨관 상피의 공포증 또는 퇴화/괴사로 관찰됩니다4. 호염기성 과립만으로는 독성학적으로 중요한 것으로 간주되지 않습니다11. 따라서 퇴행성 변화로부터 호염기성 과립 축적을 구별하는 것은 ASO 관련 독성을 평가하는 데 중요합니다.

ASO를 처리한 시노몰구스 원숭이의 신장 근위세뇨관에서 흔히 관찰되는 액포는 호염기성 물질을 함유하고 있으며 세포 내에서 호염기성 과립과 동일한 일반적인 분포를 나타냅니다11, 12. 몇몇 보고서에서는 고정 과정이 신장에 영향을 미칠 수 있다고 제안했습니다. phagolysosomal 구획 내에서 ASO 축적의 출현5, 11. 또한 Henry et al. 그리고 Engelhardt는 파라포름알데히드/글루타랄드 하이드 관류 고정 신장에는 액포가 없기 때문에 근위 세뇨관의 액포는 처리 중 ASO 추출로 인한 2차 현상일 가능성이 높다고 설명했습니다5, 11. 처리된 시노몰구스 원숭이의 근위 세뇨관 내 액포 mipomersen과 함께 고정 과정 중에 나타나는 것으로 추측됩니다13.

따라서 ASO 치료로 인한 공포증은 일부 경우 인공물일 수 있지만, 이 가설은 명확하게 입증되지 않았으며 독성학적 평가를 위한 적절한 고정 방법을 확인한 보고도 없습니다. 따라서 본 연구에서는 Karnovsky 고정액 또는 4% 파라포름알데히드 인산염 완충액(PFA)으로 고정한 후의 신장 형태를 10% 중성 완충 포름알데히드 용액(NBF)과 비교했습니다. 또한 인공물 유래 공포증을 방지하기 위한 대체 고정제로 Karnovsky 고정액의 유용성을 시연했습니다.

4주령 암컷 Sprague-Dawley 쥐를 Charles River Laboratories Japan Inc.(일본 가나가와 소재)에서 구입하여 실험실 조건에 적응시켰습니다. 동물은 통제된 조건(12-시간 명암 주기, 온도 23 ± 2도, 상대 습도 50 ± 25%) 하에서 유지되었으며 표준 상업용 식단(오토클레이브 CR-LPF; 일본 도쿄 소재 Oriental Yeast Co., Ltd.) 및 수돗물. 20마리의 동물을 다음 4개 그룹(각각 5마리)으로 할당했습니다: 1-주 식염수 처리 그룹(대조- 1W), 2-주 식염수 처리 그룹(대조{ {14}}W), 1-주 안티센스 올리고뉴클레오티드(LNA-ASO) 처리군(ASO{18}}W), 2-주 LNA ASO 처리군 (ASO-2W). 50 mg/kg LNA-ASO 투여 개시 당시 동물은 5주령이었습니다. LNA-ASO는 다음 요법에 따라 총 4회 정맥 투여되었습니다: ASO{30}}W 그룹에서는 1일, 4일, 8일 및 11일; ASO{35}}W 그룹의 1, 2, 3, 4일차. Control-1W 및 ASO-1W 그룹의 동물은 7일차에 희생되었습니다. Control-2W 및 ASO{40}}W 그룹의 동물은 7일에 희생되었습니다. 14. 각 말기 부검 시 이소플루란을 이용한 깊은 마취 하에 복대정맥으로부터 임상 병리학을 위한 혈액 샘플을 채취했습니다. 혈액 샘플링 후, 즉시 복부 대동맥을 절단하여 모든 쥐를 방혈하여 안락사시켰다. 체외 표면, 흉부 및 복강, 내장을 육안으로 검사하고, 좌측 신장을 적출하여 현미경 검사를 위해 가공하였다. 모든 절차는 미츠비시 타나베 파마 주식회사의 실험 동물의 공급 및 보관 및 동물 실험에 관한 규칙에 따라 수행되었습니다.

혈청 샘플은 혈액 샘플을 4도에서 원심분리하여 채취했습니다. 혈액 요소질소(BUN) 및 크레아티닌(CRE) 수준을 평가하기 위해 TBA-2000FR 기기(일본 도치기 소재 Canon Medical Systems Corporation)를 사용하여 혈청 생화학 분석을 수행했습니다.

신장은 다음과 같이 세 가지 고정액을 사용하여 고정하였다. 신장을 가로로 세 부분으로 나눈 후 신우를 포함한 중간 부분을 10% NBF에 5일간 고정하였다. 두개골 부분을 Karnovsky 고정액(Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Japan)으로 고정했습니다. 꼬리 부분을 4도에서 17시간 동안 4% PFA에 고정한 후 24시간 동안 10% NBF에 두었습니다. 각 고정 샘플을 탈수하고 파라핀에 묻었습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 조직 절편을 준비했습니다. 신장 손상 분자-1(KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; 1:300 희석) 및 리소좀 관련 막 단백질 2(LAMP{{)를 표적으로 하는 항체를 사용하여 면역조직화학적 염색을 수행했습니다. 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA; 1:1000 희석) 항원 회수 후(구연산염 완충액, pH 6.0, 10분간 가열 또는 20분간 압력 하에서 가열). 2차 항체로는 Histofine Simple Stain Rat MAX PO(Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan)를 사용했습니다.

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