정상 및 낭포성 신장에서 네프론의 3차원 구조
Mar 06, 2022
연락처: emily.li@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Cle'ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Gerard Friedlandiola1,6 , Terzi1,8 및 Marco Pontoglio1,8
키워드: 낭포성 신장 질환; 신장; 네프론; 신장염;조직 청소
신장 기능은 네프론의 복잡한 3차원 구조에 결정적으로 의존합니다. 모양이 변형되면신장 기능 장애. 전통적인 조직학적 방법은 3차원 조직 재건에 대한 주요 한계를 제시합니다. 여기에서 우리는 생리학적 및 병리학적 조건에서 단일 네프론의 재건을 위해 조직 청소, 다중 광자 현미경 및 디지털 추적을 결합했습니다. 세트네프론기능에 따라 위치, 모양, 크기가 다른 것을 확인하였다. 흥미롭게도 네프론은 평면에 있는 경향이 있습니다. 이 기술을 모델에 적용했을 때낭성 신장 질환, 낭종은 특정 네프론 분절에서만 발생하는 것으로 나타났습니다. 동일한 세그먼트를 따라 낭종은 확장되지 않은 정상적인 세뇨관 내에서 인접합니다. 또한, 포낭의 모양은 네프론 분절에 따라 다양하였다. 따라서 우리의 연구 결과는 단일 네프론 수준에서 복잡한 신장 구조를 시각화하기 위한 귀중한 전략을 제공하고 더 중요하게는 방광 형성과 같은 병리학적 과정을 이해하기 위한 기초를 제공합니다.
번역문
제거 방법은 형태학적 변화가 어떻게 병리학적 결과를 초래하는지 이해하기 위한 고유한 도구를 제공합니다. 신장은 네프론의 복잡한 {{0}차원 구조에 결정적으로 의존하는 물, 대사산물 및 전해질 처리를 통해 신체 항상성을 유지하는 중요한 기관입니다. 이 구조적 조직이 변경되면 신장 병태생리가 발생합니다. 현재 연구에서 우리는 광학 클리어링에 기반한 강력한 방법을 개발했으며,
생리학적 및 병리학적 조건에서 단일 네프론 수준에서 신장을 연구하기 위한 다광자 현미경 및 디지털 추적. 특히, 우리는 단일 네프론 규모의 다낭성 신장의 첫 번째 3-차원 재구성을 제공합니다. 이 방법은 여러 병리학적 맥락에 적용할 수 있어 신장 악화의 복잡한 과정을 더 잘 이해하고 결과적으로 보다 표적화된 치료 전략을 개발할 수 있습니다.
신장은 복잡한 3-차원(3D) 네프론 구조를 통해 신체 항상성을 유지합니다. 이 구조적 조직이 변경되면 신장 병태생리가 발생합니다.만성 신장 질환신장 병변의 발달이 특징입니다. 흥미롭게도 병리학자들은 만성 신장 질환 동안 병변의 분포가 매우 이질적이라고 보고했습니다.1,2 이것은 특정 네프론 분절이 다르게 손상될 수 있다는 사실을 반영하는지, 아니면 대안적으로 일부 네프론이 전체적으로 손상될 수 있는 다른 민감성을 가지고 있는지를 반영합니다. , 불명. 이 문제를 해결하려면 병리학 적 맥락에서 네프론의 3D 모양을 재구성하는 것이 필수적입니다.
저희의 지식으로는,네프론일련의 2D 섹션을 사용하여 완전히 재구성되었습니다.3–5 표준 조직학적 섹션이 고해상도를 제공하지만 3D 재구성은 힘들고 얻기 어렵습니다. 이것은 주로 슬라이싱 절차의 불가피한 영향인 기계적 왜곡 때문입니다. 또한, 2D 이미지에서 3D 재구성은 전체 장착 조직에서 3D 구조의 직접 이미징을 허용하지 않습니다.
다광자 현미경은 두꺼운 부분에서 형태학적 변화를 감지하는 능력을 향상시켰습니다. 그러나 중요한 한계는 빛의 산란으로 인해 접근 가능한 깊이가 얕다는 것입니다. 굴절률 차이를 최소화함으로써 투명제는 깊이를 이미지화하는 능력을 극적으로 향상시켰습니다.6,7 최초의 투명제가 1세기 전에 도입되었다는 사실에도 불구하고8, 주로 뇌를 위한 몇 가지 투명화 프로토콜이 개발된 것은 최근의 일입니다. .9–17 최근 연구에서는 간, 췌장 또는 신장과 같은 다른 고형 장기를 이미징할 수 있는 가능성이 있음을 보여주었습니다.18–26
신장 질환에 대한 cistanche
다낭성 신장 질환여러 모양체 유전자의 돌연변이를 포함하는 유전적으로 이질적인 장애는 가장 흔한 유전성 신장 질환입니다.27,28 다낭성 신장 질환은 신장의 완전한 파괴로 이어지는 낭종의 발달이 특징입니다.28 미세박리 연구에 따르면 낭종은 상염색체 우성 다낭성에서와 같이 네프론 분절의 "밀어내기"로 발달합니다.신장병; 상염색체 열성 다낭성에서와 같이 집합관(CD)의 확장성 확장신장병; 또는 nephronophthisis(NPHP)에서와 같이 수질 세뇨관에서만 발생합니다.27,29 그러나 낭종이 3D로 발달하고 서로 및 정상적인 인접 세뇨관과 조직화되는 방법은 아직 알려져 있지 않습니다.
여기에서 광학 클리어링과 다광자 현미경을 결합하여 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.네프론생리적 조건에서 형성되고 조직되며 방광 형성과 같은 질병 중에 어떻게 수정됩니다. 우리의 결과는 세 가지 유형의 네프론이 있으며 혈관이 네프론 공간 조직에 영향을 줄 수 있음을 보여줍니다. 흥미롭게도 우리는 네프론이 특정 평면에 있는 경향이 있음을 관찰했습니다. 예기치 않게 이 기술을 jck 마우스에 적용했을 때 우리는 낭종이 정상적인 세뇨관과 섞인 방추형 낭종이 있는 특정 네프론 분절에서만 발생하는 것을 관찰했습니다.
결과
실험 설정
전체의 형태를 연구하기 위해네프론환경과 관련하여 광학 클리어링 및 다광자 현미경을 기반으로 하는 기술을 채택했습니다(보충 그림 S1A). 다양한 광학 제거 프로토콜을 비교하여 신장의 경우 벤질 알코올/벤질 벤조에이트(BABB)가 효능 측면에서 가장 적절하다는 것을 확인했습니다(보충 그림 S1B 및 C 및 보충 표 S1).
3D 재구성 및 디지털 추적에는 고해상도 및 높은 신호 대 배경 비율을 가진 고품질 이미지가 필요합니다. 우리는 네이티브 형광에 의해 제공되는 광학 신호가 신장 섹션에 걸쳐 균일하지 않다는 것을 관찰했습니다. 특히, 수질의 이미지는 낮은 신호 대 배경 비율로 잘 대조되지 않았습니다(보충 그림 S2). 신호 대 배경 비율을 개선하기 위해 과요오드산-쉬프(보충 그림 S1D)로 섹션을 염색했습니다. 이 염색이 2-광자 형광 동안 얇은 섹션에서 고대비를 발생시킨다는 것을 경험적으로 언급했기 때문입니다. 그러나 신호는 두꺼운 과요오드산-Schiff 염색된 신장 섹션 전체에서 균일하지 않았습니다(보충 그림 S1E). 따라서 우리는 사구체와 세뇨관을 염색하는 땅콩 응집소와 밀 배아 응집소, 혈관을 표시하는 Griffonia simplicifolia 응집소와 같은 형광색소 결합 렉틴으로 신장 부분을 염색했습니다.30 놀랍게도 이러한 렉틴의 조합으로 신호 대 신호 전달 배경 비율이 전체적으로 크게 증가했습니다.신장 섹션, xy 평면과 z 축 모두에서 크게 개선되었습니다(보충 그림 S1E 및 보충 영화 S1).
3D 네프론 세그먼트 시각화
전체 네프론의 모양을 시각화하기 위해 사구체의 요극에서 시작하여 CD 접합부에서 끝나는 경로를 추적했습니다(보충 영화 S2). 전 세계적으로 사용되는 렉틴이 모든 네프론 분절에 결합한다는 사실에도 불구하고, 우리는 주의 깊게 검사했을 때 이러한 렉틴이 다른 네프론 분절의 기저막 또는 관강막을 염색하는 방식에서 특정 패턴을 특징으로 한다는 것을 알아냈습니다. 즉, 우리는 다른 네프론 세그먼트를 식별하기 위해 렉틴 염색의 고정 관념 패턴을 이용했습니다. 이러한 방식으로 우리는 6개의 엔티티를 쉽게 식별할 수 있었습니다: 근위 세뇨관(PT), Henle 루프의 가는 사지(TL), HL의 두꺼운 오름차순(TAL), 원위 세뇨관(DCT), 연결 세뇨관(CNT) ) 및 CD. PT와 TL 사이의 전환은 일반적인 PT 브러시 경계 신호의 갑작스러운 손실과 TL에서는 거의 없는 루멘 너비의 감소로 특징지어졌습니다(그림 1a). 반대로, TL과 TAL 사이의 전환은 외부 관 직경의 상당한 증가와 상대적으로 일정한 루멘 폭을 특징으로 합니다(그림 1b). 모두에서네프론, TAL에서 DCT로의 전환은 사구체의 혈관 극에서 체계적으로 발견되었습니다. 이 전환은 주로 내강 직경의 상당한 증가로 인한 외부 관 직경의 갑작스러운 확대를 특징으로 합니다(그림 1c). DCT와 CNT 사이의 전환은 관 직경과 루멘 모두의 감소를 특징으로 합니다(그림 1d). 마지막으로, CNT와 피질 CD 사이의 연결은 관 직경과 루멘 모두의 갑작스러운 증가를 특징으로 합니다(그림 1e). 이러한 형태학적 전환의 정량화는 통계적으로 중요했으며(그림 1f), 특정 관형 마커로 염색하여 관련성을 확인했습니다(보충 그림 S3–S5 및 보충 영화 S3–S5).
깊이에 따라 PT의 모양과 크기가 다름
두꺼운 염색신장 섹션전체 PT 세그먼트의 공간 진화 좌표를 추적할 수 있습니다. 흥미롭게도 우리는 그들의 모양이 극도로 다양하고 피질에서 사구체의 위치에 의해 결정된다는 것을 발견했습니다. 전 세계적으로 3가지 패턴을 식별했습니다. fifirst cor는 피질의 가장 외부 부분(신장 캡슐에 가까운 가장 외부 30%)을 차지하는 가장 표면적인 네프론(SN)(그림 2a, 보충 영화 S6)에 반응했습니다. 그들의 복잡한 부분은 자신의 사구체 주위에 단지 6-7개의 회선으로 조밀한 구조를 형성하여 매우 작고 빽빽하게 채워진 공간을 차지합니다. 이 SN의 회선은 수질로 내려가는 길고 곧은 직근으로 끝났습니다. 이 스펙트럼의 반대쪽 끝에서 두 번째 패턴을 관찰했습니다.네프론피질의 가장 깊은 부분(내부 깊이가 40% 더 높음), 수질(수질 인접 네프론[JN]) 옆에 있습니다(그림 2a, 보충 그림 S6 및 보충 영화 S6). 그들의 PT는 유두쪽으로 체계적으로 하강한 다음 U가 신낭을 향해 상승하는 초기의 짧은 루프를 특징으로 합니다. SN과 대조적으로, JN 근위 세뇨관은 자체 사구체 주위에서 진화한 큰 코일을 특징으로 하며 인접 피질에서 크고 느슨하게 채워진 영역을 차지합니다. JN의 PT의 복잡한 부분에는 10~15개의 회선이 있어 큰 도메인을 형성합니다. 마지막으로, 세 번째 패턴에는 피질(중간 네프론[MN])의 중간 부분에 위치한 네프론이 포함되었습니다(그림 2a, 보충 영화 S6). 흥미롭게도 이 세관은 SN과 JN 사이의 전환을 나타내는 모양과 공간적 방향을 가지고 있습니다. 사실, 그들은 SN보다 크지만 JN보다 작은 코일을 가진 8-9개의 회선을 포함했습니다. 또한, MN은 JN보다 par recta가 더 길었습니다. 흥미롭게도, PT의 모양을 전체적으로 비교한 결과 SN과 MN은 균질한 패턴을 갖는 반면 JN은 매우 이질적인 것으로 나타났습니다(보충 그림 S6). 또한, 여러 네프론의 공간 재구성은 PT가 결코 섞이지 않는 것으로 나타났으며(보충 영화 S6), 이는 각 네프론이 피질에서 고유한 개별 공간을 차지함을 나타냅니다.
형태 분석은 MN에 대한 중간 측면과 함께 SN과 JN의 크기와 모양에서 큰 차이를 확인했습니다. JN의 PT는 SN의 PT보다 2-배 이상 길었습니다(그림 2b). 그러나 직진성은 JN보다 SN에서 더 컸으며(그림 2c), JN 세관이 훨씬 더 구불구불하다는 관찰과 일치합니다(그림 2a, 보충 그림 S6).
그림 1|네프론 분절을 식별하는 데 사용되는 형태학적 기준. (a-e) 대조군 마우스에서 네프론의 다른 부분의 형태. 네프론은 사구체의 요극에서 집합관까지 추적되었습니다(근위 세뇨관[PT]: 청록색; 헨레 루프의 가는 다리[TL]: 밝은 회색, 헨레 루프의 두꺼운 오름차순[TAL]: 짙은 회색; 원위 세뇨관 [DCT]: 분홍색, 연결 세관 [CNT]: 노란색, 피질 집합관 [CCD]: 주황색). 화살표는 다른 네프론 세그먼트의 직경을 나타냅니다. (계속되는)
그림 1|(계속) (f) 다른 네프론 세그먼트의 외부 관 직경의 정량화. 데이터는 평균 SEM으로 표시됩니다. Tukey-Kramer 테스트가 뒤따르는 분산 분석: **P < 0.01,="" ***p=""><>
그림 3|3차원(3D) 네프론 재구성은 3가지 유형의 네프론을 나타냅니다. (a) 대조군 마우스에서 사구체에서 피질 피질(파란색), 중간 피질(녹색) 및 수질병합 영역(빨간색)의 수집 덕트까지 전체 네프론(왼쪽 패널)의 대표적인 3D 이미지. 3가지 다른 유형의 네프론에 대한 네프론 분할(오른쪽 패널). 바 ¼ 150mm. (b) 3가지 유형의 네프론에 대한 헨레 루프의 2개 다리 사이의 거리를 정량화합니다. (c) (계속)에 대한 네프론 길이의 정량화
그림 3|(계속) 3가지 종류의 네프론. (d) 네프론의 유형에 따른 네프론의 다른 부분의 길이 정량화. 데이터는 평균 -SEM으로 표시됩니다. Tukey-Kramer 테스트가 뒤따르는 분산 분석: juxtamedullary nephron(JN) 대 표면 nephron(SN): ###P < 0.001;="" jn="" 대="" 중간="" 네프론(mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001.="" cnt,="" 연결="" 세관;="" dct,="" 원위="" 복잡한="" 세뇨관;="" pt,="" 근위="" 세뇨관;="" tal,="" henle="" 루프의="" 두꺼운="" 오름차순="" 사지;="" tl,="" henle="" 루프의="" 얇은="">
사구체 크기는 깊이에 따라 다릅니다.
그런 다음 3개 영역 각각에서 무작위로 선택된 사구체의 깊이와 직경을 분석했습니다. 형태학적 분석은 사구체가 JN 및 SN에서 각각 신장 캡슐로부터 평균 783 mm 및 355 mm에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 이전에 보고된 바와 같이, 우리는 사구체의 크기가 깊이에 따라 다양함을 관찰했습니다. 특히, JN의 사구체 부피는 SN 및 MN의 사구체 부피보다 3배 더 컸습니다(그림 2d).
3D 네프론 재건
그런 다음 PT에서 CNT까지 전체 네프론의 공간적 진화를 추적했습니다. 3D 재구성에 대한 글로벌 뷰는 네프론 모양이 SN, MN 및 JN 간에 다르다는 것을 확인했습니다(그림 3a, 보충 영화 S7). 이러한 차이는 주로 PT의 구조에 기인한다. 또한 HL이 다른 3D 공간 구성을 가지고 있음을 관찰했습니다. 특히, TL과 TAL은 SN과 MN보다 JN에서 더 멀리 분리되었습니다(그림 3b). 형태 측정 분석에 따르면 JN은 전체적으로 SN보다 2-배 더 길었습니다(그림 3c). 증가된 길이는 모든 네프론 유형에서 유사한 절대 길이를 갖는 경향이 있는 TAL 및 DCT를 제외하고 모든 세그먼트에서 비례적으로 분포되었습니다(그림 3d). 이것은 네프론 신장이 놀랍게도 균일하게 패턴화된 과정임을 시사했습니다.
아치형 혈관은 juxtamedullary PT convolution에 영향을 미칩니다.
보다 포괄적인 관점을 얻기 위해신장 구조, 우리는 아치형 혈관과 그 가지를 피질 방사 혈관으로 추적할 수 있는 Griffonia simplicifolia agglutinin 염색을 이용했습니다(그림 4a, 보충 영화 S8). 흥미롭게도, 네프론과 혈관의 수반되는 3D 재구성은 아치형 혈관이 근처의 세관과 놀라운 평행 공간 조직에 있는 경향이 있음을 보여주었습니다. 특히, 특정 JN(제약된 JN)이 따르는 경로가 인근 선박의 경로를 따르는 경향이 있음을 관찰했습니다(그림 4b, 보충 영화 S9). 놀랍게도, 이 편향(JN 네프론의 하위 집합에서만 관찰됨)은 PT 모양의 큰 이질성을 설명했습니다(보충 그림 S6). 형태학적 분석은 "구속된" PT가 "비구속된" 것보다 훨씬 더 길고 더 구불구불한(직진도 감소) 것으로 나타났습니다(그림 4c 및 d). SN과 MN 모두의 복잡한 부분이 아치형 혈관 위에 위치하고 구속되지 않았다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
세관은 평면에 있는 경향이 있습니다.
흥미롭게도, 네프론의 3D 모양을 조사한 결과 네프론이 평면에 놓여 있는 경향이 있는 것으로 나타났습니다(그림 5a; 보충 영화 S10). 이 매개변수를 정량화하고 이 형태의 가능한 통계적 편향을 평가하기 위해 우리는 세뇨관이 루프에 의해 정의된 평면 밖으로 구부러지는 일반적인 경향을 측정했습니다. 우리의 측정은 연속 측정된 각도와 연속 지점 사이의 길이(그림 5b)의 동일한 세트로 생성된 무작위 보행의 시뮬레이션 모델과 비교하여 세관이 평면에서 더 작은 편차로 진화하는 경향이 있음을 보여주었습니다(그림 5c). 이것은 세관이 평면을 따라 경로를 제한하는 경향이 있음을 나타냅니다. 관찰된 차이는 통계적으로 매우 유의했습니다(P <>
cistanche는 신장 기능을 향상시킬 수 있습니다
3D 네프론 재건은 낭종 발달에 대한 특정 패턴을 나타냅니다
우리 프로토콜이 무질서한 병리학적 조직에서 네프론을 추적할 수 있는지 확인하기 위해 NPHP 및 낭성 질환의 널리 사용되는 모델인 jck 마우스에서 낭종의 모양과 공간 분포를 특성화했습니다.31–{1}}D 이미지는 그럼에도 불구하고 두드러진 낭종의 출현에 대해 네프론의 일반적인 3D 과정은 대조군 마우스의 과정과 크게 다르지 않았습니다(보충 영화 S11). 유사하게, 형태 측정 분석은 네프론의 전체 길이, 사구체 부피 및 각 네프론의 길이를 확인했습니다.네프론세그먼트는 대조군 마우스의 세그먼트와 비슷했습니다(보충 그림 S7). 참고로, 낭종 발달로 인해 HL에서 TL과 TAL을 구별할 수 없었습니다. 모든 네프론에서 방추형 낭종이 발생했습니다(보충 영화 S11 및 S12). 가장 두드러진 특징 중 하나는 방추형 낭포성 팽창이 동일한 경로를 따라 여러 위치에서 발생했다는 관찰이었습니다.네프론세그먼트(보충 동영상 S12 및 S13). 흥미롭게도, 우리는 PT 및 HL 하강 사지에서 낭종이 발생하지 않는다는 것을 관찰했습니다(그림 6a, 보충 영화 S12). 대조적으로, 그들은 CNT와 연속하여 HL 오름차순, DCT, CNT 및 CD의 상부에서 주로 검출되었습니다(그림 6a, 보충 영화 S12). 특히, 우리는 DCT와 CNT 세그먼트가 각각의 더 먼 부분에서 낭종을 개발할 확률이 특별히 증가했음을 관찰했습니다(그림 6b). 3D 재구성 이미지의 정량적 형태 측정 분석 결과 당 총 낭종 부피가 밝혀졌습니다.네프론CNT에서 특히 높았다(그림 7a). 또한, 우리는 HL 및 DCT의 낭종 확대가 SN 및 MN보다 JN에서 더 크다는 것을 관찰했습니다(그림 7a, 보충 영화 S12). 또한, 낭종 발생률은 다른 유형의 네프론보다 JN에서 상당히 높았습니다(그림 7b). 우리는 또한 평균 사구체 간 거리(가장 가까운 5개 사구체에서 계산됨)가 낭포성 생쥐, 특히 더 피상적인 피질에서 특히 증가하는 경향이 있음을 관찰했습니다(보충 그림 S8).
수많은 낭종의 3D 재구성은 모양과 부피가 극도로 다양하다는 것을 보여주었습니다(그림 6c, 보충 영화 S11 및 S13). HL 상행지에서 낭종은 직경이 작은 방추형을 가졌다. DCT에서 낭종은 다소 구형이고 더 큰 모양을 가지며 확장되지 않은 세뇨관 사이에 산재되어 있습니다. 흥미롭게도, DCT와 CNT 사이의 전환은 정상적인 비확장 구조로 체계적으로 특징지어졌습니다. 대조적으로, CNT에서 우리는 CD와 직접 접촉하는 인접한 확장된 낭포 구조를 체계적으로 관찰했습니다. 흥미롭게도 CD에서 이 구조는 점진적으로 정상적인 세뇨관 크기로 축소되었습니다. 더 원위부에서는 CD의 인접한 부분에서 더 이상의 낭종이 발견되지 않았습니다. 또 다른 일관된 특징은 HL 오름차순에서 낭종의 독특한 공간적 조직화였습니다. 사실, 낭종이 SN의 루프에 더 깊고 더 가까웠지만 JN의 더 피상적이고 DCT에 더 가깝습니다(그림 6c). 다시 말하지만, 낭종은 MN에서 중간 위치를 차지했습니다(그림 6c).
그림 5|네프론 세뇨관은 평평한 구조로 진화하는 경향이 있습니다. (a) 네프론 근위 세뇨관의 전형적인 경로. 이 경로는 평면에 누워 있는 경향을 보여줍니다. 경로 전개의 평면성은 관찰자의 관점과 적절하게 회전되고 정렬될 때 더 잘 볼 수 있습니다(왼쪽에 다른 평면에 표시되는 동일한 관형 세그먼트의 오른쪽 표현 참조). 각도). (b) 4개의 세그먼트로 구성된 관형 경로의 도식적 표현(예: 주어진 관형 경로를 정의하는 5개 점 사이). 경로가 "평면을 벗어나는" 경향이 있는 정도는 여기에서 "베타"로 표시된 각도로 나타낼 수 있습니다. (계속되는)
그림 5|(계속) 이 각도는 평면을 기준으로 세그먼트 p{1}}p4 사이에서 측정되며(바로 앞의 점 p3, p2 및 p1로 정의됨) 구성표에서 짙은 회색 직사각형으로 표시됩니다. 그런 다음 베타 각도의 계산은 관형 경로의 점 집합을 따라 재귀적으로 계산되었습니다. 이러한 베타 각도의 편향 정도를 평가하기 위해 각 관 경로(모든 연속 세그먼트 사이에서 측정)의 동일한 연속 알파 각도 세트를 사용하여 무작위 보행(Monte Carlo 시뮬레이션[MCs])을 시뮬레이션했습니다. 이 무작위 걷기는 동일한 알파 각도 세트와 무작위 베타 각도로 경로를 생성했습니다. (c) 베타 각도의 전체 분포와 근위 세뇨관(PT), 헨레 루프의 가는 사지(TL), 헨레 루프의 두꺼운 오름차순(TAL), 원위 복잡한 세뇨관의 MC 결과에 대한 바이올린 플롯( DCT) 및 결합 세뇨관(CNT). MC, P <>
논의
전통적인 조직학적 방법은 네프론의 전체적인 모양에 영향을 미치는 병리학적 변화를 감지하는 능력이 제한적입니다. 여기에서 우리는 정상 및 병리학적 조건에서 전례 없는 공간적 세부 사항으로 신장 구조에 대한 중요한 질문을 해결할 가능성이 있는 조직 청소를 기반으로 하는 강력한 접근 방식을 제시합니다. 우리의 결과는 기능적 특이성과 일치하는 위치, 모양 및 크기가 다른 3가지 유형의 네프론이 존재함을 확인했습니다. 또한, 우리는 네프론이 평면에 놓여 있고 선박 공간 조직에 적응하는 경향이 있음을 보여주었습니다. 흥미롭게도 이 기술을 다음 모델에 적용했을 때낭성 신장 질환, 우리는 모두에서 낭종이 발생하는 것을 관찰했습니다.
네프론, 그러나 특정 부분에서만. 흥미롭게도, 우리는 낭종의 모양이 네프론 분절에 따라 다르며 동일한 네프론을 따라 낭종이 정상적인 비확장 세뇨관과 삽입된다는 것을 보여주었습니다. 종합하면, 이러한 결과는 네프론과 혈관의 공간적 배열에 대한 최초의 3D 특성화를 제공하고 중요하게는 방광형성과 같은 병리학적 과정을 이해하기 위한 기초를 제공합니다.
신장 광학 청소는 높은 수준의 자가형광 및 세포 밀도로 인해 어렵습니다. 서로 다른 제거 프로토콜을 비교하여 BABB에서 가장 깊은 부분에 위치한 구조의 시각화 및 재구성을 구현하는 강력한 기술을 확인했습니다.신장, 즉 수질. 또한 BABB는 신속하고 확장 가능하며 일단 삭제되면 이미지 수집 전에 샘플을 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 이 기술의 또 다른 주요 이점은 저렴한 비용입니다. 제거제는 구조의 축소 또는 확대를 초래할 수 있습니다.9-17 그러나 이러한 신장 크기 수정은 등방성이므로 상대적 측정이 영향을 받거나 해석을 편향시킬 것으로 예상되지 않습니다. 가장 중요한 제한 사항 중 하나는 시간이 많이 소요되는 구조의 주석입니다. 그럼에도 불구하고 이러한 한계를 빠르게 극복할 수 있는 딥러닝 기반 기술이 늘어나고 있다.
고전적 기법으로 얻은 결과와 일치하게, 우리 연구는 네프론이 위치에 따라 모양과 길이가 다르다는 것을 보여주었습니다. 특히, 우리는 JN이 복잡한 PT와 더 큰 사구체를 가지고 있고 SN보다 2배 더 긴 것을 관찰했습니다. 늘어난 길이는 모든 네프론 세그먼트에 비례적으로 영향을 미치기 때문에 조화로운 과정의 결과입니다. 우리는 또한 JN이 더 큰 HL을 갖는다는 것을 관찰했습니다. 전체적으로, 이러한 데이터는 SN과 JN의 미세 해부학이 상당히 다르고 MN이 중간 기능을 표시한다는 것을 분명히 보여줍니다. 흥미롭게도 생리학적 연구에 따르면 네프론은 기능적으로도 다릅니다.2 이러한 차이의 근간이 되는 형태 발생학적 사건은 아직 알려져 있지 않습니다. 따라서 JN의 특정 구조가 기능의 특수성을 설명할 수 있다고 추측하고 싶은 유혹이 있습니다.
흥미롭게도, 처음으로 네프론과 그 주변 혈관의 3D 재구성을 제공함으로써 우리는 아치형 혈관과 네프론의 하위 그룹 사이의 공간적 제약을 발견했습니다. 따라서 선박이 길을 지시할 수 있다고 생각할 수 있습니다.네프론34,35 계산 시뮬레이션과 결합된 네프론의 3D 모양을 검사하면 네프론이 절대 섞이지 않고 각 네프론이 평면에 놓이는 경향이 있음이 밝혀졌습니다. 이 관찰의 기능적 의미는 아직 밝혀지지 않았습니다.
동안 낭종 발생다낭성 신장 질환여전히 흥미로운 과정입니다. 낭종 발달을 특징으로 하는 병리학적 상태인 NPHP는 소아 및 청소년에서 말기 신장 질환을 유발하는 가장 흔한 유전 질환입니다. 지금까지 20개의 NPHP 유전자가 확인되었습니다.36 그 중 NEK8은 섬모 기능과 세포 주기 진행에 역할을 하는 Never in mitosis A-related kinase family의 구성원을 인코딩합니다.37 Nek8은 원래 다음에서 돌연변이된 유전자로 특징지어졌습니다. jck mice.32 특히, 동일한 단백질 도메인의 돌연변이가 인간에서 NPHP9를 유발하는 것으로 나타났습니다.{7}}D 연구에 따르면 낭종의 발달은 다양한 형태의 다낭성 신장 질환에 따라 크게 다릅니다.27,29 특히 , NPHP에서 낭종은 CD와 DCT에서 독점적으로 파생되는 것으로 보입니다.31 유익하지만 이러한 면역조직화학 연구는 특정 관형 표지자의 소실이 이러한 관찰을 인공적으로 설명할 가능성에 대해 논쟁할 수 없습니다. 따라서 우리의 3D 연구는 낭종 발달이 특정 네프론 분절만을 포함할 수 있는 과정이라는 첫 번째 명확한 증거를 제공합니다. 흥미롭게도 NIMA(Never In mitosis gene A)–Related Kinase 8(NEK8)은 모든 네프론 분절의 세포질에서 발현되지만 섬모에서의 발현은 DCT 및 CD로 제한됩니다. 이 부분들만이 낭종을 발생시키는 경향이 있기 때문에,31 우리는 NEK8 모양체 기능의 붕괴가 낭종 형성에 중요한 사건이라고 가정할 수 있습니다. 흥미롭게도, 우리는 방추형 낭종이 정상적인 비확장 세뇨관과 연속되어 있음을 관찰했습니다. 열성 생식계열 돌연변이가 세포의 하위 집합에서만 병리학적 표현형을 초래한다는 사실은 상염색체 우성 다낭성 종양에 대해 제안된 바와 같이 두 번째 사건이 이들 세포에서 낭종 발달을 유발할 수 있음을 시사합니다.신장병.40,41
우리는 또한 적어도 PT와 CNT 사이에 위치한 낭종을 고려할 때 낭종 확대가 SN보다 JN에서 더 우세하다는 것을 관찰했습니다. 일관되게, 사구체 경화증의 맥락에서 사구체 병변은 SN보다 JN에서 더 자주 발견된다고 보고되었습니다.1,21,42네프론사구체 여과율과 수송/효소 활동이 JN의 악화에 대한 증가된 감수성을 설명한다는 것은 추가 조사가 필요한 흥미로운 가설입니다.
요약하면, 우리는 구체적으로 표지된 내부 구조(네프론, 혈관 및 낭종)의 공간적 및 정량적 분포를 직접 기록하기 위해 충분한 분자 특이성과 해상도로 3D로 신장을 이미지화하는 새로운 기술을 설명합니다. 직접 정량화를 위한 편의성, 속도 및 능력을 감안할 때 이 기술이 신장 병태생리학을 이해하는 강력한 도구가 될 것으로 기대합니다.
그림 6|3차원(3D) 네프론 재구성은 낭종이 특정 네프론 세그먼트에서만 발생한다는 것을 보여줍니다. (a) jck 마우스의 표면 피질(파란색), 중간 피질(녹색) 및 골수 인접 영역(빨간색)의 수집 덕트에 사구체에서 전체 네프론(왼쪽 패널)의 낭종 부피 렌더링이 있는 대표적인 3D 이미지. 3가지 다른 유형의 네프론에 대한 네프론 분할(오른쪽 패널). 바 ¼ 150mm. (b) jck 마우스의 다른 네프론 분절에서 낭종이 발생할 확률. (계속되는)
그림 6|(계속) 수평 축은 50개의 빈에 해당하는 네프론의 정규화된 길이입니다(근위 세뇨관[PT], 청록색; 헨레 루프[HL], 흰색, 원위 세뇨관[DCT], 분홍색, 연결 세뇨관[CNT], 노란색) . (c) HL(왼쪽 패널), DCT(중간 패널), CNT 및 피질 수집 덕트(CCD)(오른쪽 패널)의 오름차순 사지의 낭종 부피 렌더링이 있는 대표적인 3D 낭종 재구성 이미지(오른쪽 패널) 표재(상단 패널), 중간 (중간 패널) 및 jck 마우스의 juxtamedullary (하부 패널) 네프론. 바 ¼ 50mm.
행동 양식
동물
모든 동물 절차는 "Service Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris"와 Université Paris Descartes의 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 2개월 된 FVB/N 마우스(n=20)를 사용하여 신장 청소를 위한 실험 조건을 설정했습니다. 그런 다음 연구는 2-주된 jck 수컷 생쥐(n=4)와 대조군(n=3)에서 수행되었습니다.
신장 조직의 준비
죽이기 전에, 마우스는 25ml의 헤파린화 식염수(1000IU/l)에 이어 75ml의 인산완충식염수(PBS) 중 4% 파라포름알데히드로 심장내 카테터 삽입을 통해 관류했습니다. 실험은 자일라진(Rompun 2%, Bayer, Leverkusen, Germany, 6 mg/g 체중) 및 케타민(Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, France, 120 mg/g 체중) 마취하에 수행되었습니다.
제거 연구를 위해 신장을 4% 파라포름알데히드에 4시간 동안 고정하고 4% 아가로스 및 1.{4}}신장 문을 둘러싸고 있는 1.{4}}mm 두께의 섹션을 잘라내어 4C에서 PBS에 보관했습니다.신장 섹션먼저 염색한 다음 지워졌습니다.
얇은 부분에 대한 면역조직화학 연구의 경우,신장밤새 4% 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀 포매 및 4-mm 섹션을 절단했습니다.
더럽히는 것
과요오드산-쉬프 염색. 1.{1}}mm 신장 절편을 제거하기 전에 실온에서 5분 동안 순수 또는 1:100 PBS로 희석된 과요오드산-Schiff에서 배양했습니다.
얇은 파라핀이 포함된 섹션에 대한 면역조직화학. 파라핀이 포함된 신장의 4마이크로미터 섹션을 항원 검색을 위해 가열하고 형광색소 결합 렉틴과 함께 4C에서 밤새 배양하여 세관(로다민 땅콩 응집소[RL{5}}] 및 로다민 밀 배아 응집소[RL{{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, 1:200으로 희석) 및 별개의 관형 분절을 묘사하기 위한 분절 특이적 1차 항체(비오틴화된 Lotus tetragonolobus lectin[B{10}}], Vector Laboratories, 1:200로 희석: 100, 마우스 항-Calbindin D28K [D{15}}], Santa Cruz, Heidelberg, Germany, 1:200으로 희석, 염소 항 AQP2 [C{19}}], Santa Cruz, 1:200에서 희석) . 다음날, 섹션을 실온에서 1시간 동안 이차 항체(Alexa Fluor 488 conjugate [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A{26}}], Invitrogen; 항-마우스 Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA, 모두 1:500으로 희석) 40,{33}}디아미디노{34}}페닐인돌로 착색하기 전에. 모든 이미지는 Nikon Eclipse E800 현미경(Champigny sur Marne, France)으로 획득했으며 FiJi 소프트웨어(버전 1.50)를 사용하여 준비했습니다.
두꺼운 부분의 렉틴 염색. 1.{1}}mm 두께의 신장 절편을 Texas Red 또는 flfluorescein isothiocyanate 결합 렉틴(땅콩 응집소(RL{5}}) 및 밀 배아 응집소(RL{6})에서 1개월 동안 4C에서 배양했습니다. }), 0.1% PBS 아지드 및 0.1% Triton-X에 1:10{11}} 희석 그런 다음 섹션을 청소하기 전에 PBS로 2주 동안 매일 세척했습니다.
광학 클리어링
스케일 제거를 위해 1.{1}}mm 신장 섹션을 ScaleA2(4M 요소, 0.1% Triton X-100, 1{10}}% 글리세롤) 또는 ScaleB4에서 배양했습니다. (8M 요소, 0.1% Triton X{12}}) 4C에서 2주, 최대 1년
BABB 제거를 위해 1.{1}}mm 신장 섹션을 실온에서 에탄올의 순차적 헹굼에서 탈수했습니다. 그런 다음 샘플을 4C에서 2일 이상 동안 1:2 비율로 BABB(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)에서 배양했습니다.
2광자 현미경 이미지 획득
Mai Tai HP Titanium-Sapphire Laser(Spectra-Physics, Santa Clara, CA)가 장착된 도립 다광자 현미경(LaVision BioTec)에서 수성 겔로 조직을 이미지화했습니다(보충 그림 S1A). 여기 파장은 전력의 8%에서 815nm였습니다. 20 침수 대물렌즈(XLUMPLFL2{10}}XW, Olympus[일본 도쿄], 개구수, 0.95, 작동 거리, 2.0mm)를 사용했습니다. 형광 획득을 위해 우리는 593/40 nm 대역 통과 필터와 함께 80%에서 디스캔되지 않은 검출기를 사용했습니다.
첫 번째 단계는 최적이 아닌 획득 매개변수(400mm 400mm 및 1011 1011픽셀, 10% 중첩 및 평균 2)를 사용하여 중간 z 스택에서 2D 모자이크 이미지 획득으로 구성되어 가장 관련성이 높은 중심 필드 선택을 안내합니다. (보충 그림 S9A). 관심 있는 xy 그리드 및 z 필드가 정의되면 매개변수를 조정하여 고품질 이미지를 획득했습니다. 이러한 접근 방식은 관심 영역을 z 스택당 512 필드로 줄였습니다. 그런 다음 우리는 850 z 스택/광학 슬라이스({11}mm 단계 크기)를 확보했습니다.신장 섹션.
이미지 스티칭, 처리 및 추적
각 스택은 피지 소프트웨어(http://fifiji.sc/Fiji)의 "그리드/컬렉션 스티칭" 플러그인을 사용하여 대규모 이미지 컬렉션의 스티칭을 허용하는 Preibisch et al.에 의해 개발된 방법에 따라 타일링되었습니다. . 스티칭 후 인접한 두 이미지 사이의 중요한 이동을 관찰했기 때문에 Python으로 사용자 지정 일치 프로그램을 작성했습니다. 이 프로그램은 이미지 이동을 보정하여 이미지를 올바르게 정렬할 수 있도록 합니다(보충 그림 S9B). 스티치 보정된 이미지는 Imaris 버전 8.4.2(Bitplane, Zurich, Switzerland)를 사용하여 분석되었습니다. Imaris의 fifilament 추적기 패키지 수동 모드를 사용하여 세관과 혈관을 추적하고 MATLAB으로 개발한 Imaris Xtension(https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone{11}}Join{12 }} 필라멘트_Tool.zip?dl¼0)(보충 그림 S9C). 사구체와 낭종은 Imaris 표면 패키지의 수동 모드를 사용하여 3D로 재구성되었습니다. Imaris의 스팟 패키지의 수동 모드를 사용하여 3D 사구체 공간 구성을 표시했습니다.
형태측정
Imaris의 fifilament 추적기 패키지를 사용하여 관형 세그먼트 길이, 네프론 길이 및 직진도를 결정했습니다. Imaris 소프트웨어에 따르면 직진도는 2점 사이의 거리와 네프론 세그먼트 경로의 길이 사이의 비율로 정량화되었습니다. 31개의 PT와 12개의 전체 네프론이 3개의 야생형 마우스에서 재구성 및 측정된 반면, 37개의 PT 및 17개의 전체 네프론은 4개의 jck 마우스에서 재구성 및 측정되었습니다. 낭종과
사구체 부피는 Imaris의 "표면 패키지"를 사용하여 결정되었습니다. 31개 및 34개의 사구체가 야생형 및 jck 마우스에서 각각 측정되었다. 총 74개의 낭종이 측정되었습니다.
관형 회전의 "평면 밖" 각도("베타"로 표시)는 평면(3개의 연속 점으로 정의됨)과 공간에서 다음 연속 네 번째 점이 있는 방향 사이에서 측정되었습니다(그림 5b). 관찰된 편향의 통계적 의미를 평가하기 위해 동일한 알파 각도 세트를 가진 동일한 세그먼트로 구성된 구조에서 베타 각도의 무작위 회전(몬테 카를로 시뮬레이션)으로 베타 각도 분포를 시뮬레이션했습니다.
낭성 병변이 발생할 확률 계산을 위해네프론세그먼트, 우리는 공간의 점 집합으로 각 네프론을 나타냅니다. 각 지점은 낭종의 존재 대 정상 구조 및 분절 유형과 관련하여 주석이 달렸습니다. 각 표준화된 길이(50개의 빈으로 설정)에서의 확률은 낭성 주석이 있는 포인트 수와 빈의 총 포인트 수 사이의 비율로 계산되었습니다.
평균 사구체 간 거리를 계산하기 위해 각 사구체에 대해 가장 가까운 5개 사구체에서 계산된 평균 사구체 간 거리를 고려했습니다.
데이터 분석 및 통계
데이터는 평균 SEM으로 표시됩니다. 실험 그룹 간의 차이는 Tukey-Kramer 테스트에 의해 유의미한 경우(P < {0}}.05)="" 분산="" 분석을="" 사용하여="" 평가되었습니다.="" 두="" 그룹만="" 비교할="" 때는="" mann-whitney="" 테스트를="" 사용했습니다.="" graph="" prism="" 소프트웨어(san="" diego,="" ca,="" 버전="" 9.0.0)를="" 사용하여="" 통계="" 분석을="">
폭로
모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.
감사의 말
우리는 기술 지원을 위해 구조 연방 드 Recherche Necker의 Laboratoire 실험 Animale et Transgenese(LEAT), 조직학 및 이미징 플랫폼에 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어주신 Pierre Isard, Marie-Claire Gubler, Nicolas Kuperwasser에게 감사드립니다. 이 작업은 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d' Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development(바젤 , 스위스) 및 Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle(파리, 프랑스).
저자 기여
TB, NG, MZ는 실험을 설계 및 수행하고 데이터를 분석했습니다. FB, LT, MGT 및 SG도 몇 가지 실험을 수행하고 데이터를 분석했습니다. MB와 CN은 마우스 실험을 수행했습니다. TB와 MZ도 원고 작성에 기여했습니다. GF는 원고를 수정했습니다. FT와 MP는 개념적 틀을 제공하고 연구를 설계하고 프로젝트를 감독하고 논문을 작성했습니다.
cistanche는 신장을 강화할 수 있습니다
보충 자료
보충 파일(PDF)
그림 S1. 실험 설정, 획득 절차 및 이미지 처리.
그림 S2. xy 및 z 해상도에서 자가형광 신호의 한계.
그림 S3. 4-mm 파라핀이 포함된 신장 섹션에서 PT와 TL 사이의 전환에 대한 2차원 이미지.
그림 S4. 4-mm 파라핀이 포함된 신장 섹션에서 TAL과 DCT 사이의 전환에 대한 2차원 이미지.
그림 S5. 4-mm 파라핀이 포함된 신장 절편에서 DCT와 CNT 사이의 전환에 대한 2차원 이미지.
그림 S6. 3차원 재구성은 근위 세뇨관의 3가지 다른 모양을 나타냅니다.
그림 S7. 3차원 재구성은 네프론의 길이와 분할이 낭종의 영향을 받지 않는다는 것을 보여줍니다.
그림 S8. 대조군 및 낭포성 신장에서 사구체의 밀도.
그림 S9. 획득 절차 및 후처리 이미지 처리.
표 S1. 청산 방법 비교. 추가 파일(영화)
영화 S1. 렉틴 염색은 해상도와 신호 대 배경 비율을 현저하게 향상시킵니다.
영화 S2. 세뇨관 경로 추적.
영화 S3. 근위 세뇨관과 헨레 고리의 가는 다리 사이의 접합부를 보여주는 깨끗한 신장의 3차원 재구성.
영화 S4. Henle 루프의 두꺼운 상행지와 원위 복잡한 세뇨관 사이의 접합부를 보여주는 깨끗한 신장의 3차원 재구성.
영화 S5. 원위 세뇨관과 연결 세뇨관 사이의 접합부를 보여주는 깨끗한 신장의 3차원 재구성.
영화 S6. 근위세뇨관의 모양과 크기는 깊이에 따라 다릅니다.
영화 S7. 대조군 마우스의 3차원 네프론 재건.
영화 S8. 아치형 혈관에서 피질 방사 혈관으로의 혈관 경로 추적.
영화 S9. 아치형 혈관은 juxtamedullary proximal tubules의 모양을 모델링합니다.
영화 S10. 네프론은 평면에 누워 있는 경향이 있습니다.
영화 S11. 3차원 네프론 재건은 낭종 발달에 대한 특정 패턴을 보여줍니다.
영화 S12. 3차원 네프론 분할은 특정 네프론 세그먼트에서 낭종이 발생함을 보여줍니다.
영화 S13. 다낭성 신장에서 네프론과 혈관의 공간적 배열과 상호관계
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