Krüppel-like Factor 6-매개 BCAA 이화의 손실은 쥐와 인간의 신장 손상에 기여합니다
Feb 25, 2022
에서 변경된 세포 대사신장근위세뇨관(PT) 세포는 급성에서 중요한 역할을 합니다.신장 손상 (아키). 전사 인자 Krüppel-like factor 6(KLF6)은 AKI 후 PT 초기에 빠르고 강력하게 유도됩니다. 우리는 PT-특이 Klf6 녹다운(Klf6PTKD)이 AKI 및신장마우스의 섬유증. 결합된 RNA 및 염색질 면역침전 시퀀싱 분석은 분지쇄 아미노산(BCAA) 이화 효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 Klf6PTKD 마우스에서 보존되었으며 KLF6이 이들 유전자의 프로모터 영역을 차지함을 입증했습니다. 반대로, 유도 가능한 KLF6 과발현은 BCAA 유전자의 발현을 억제하고신장 손상및 마우스의 섬유증. 시험관 내에서 KLF6을 과발현하는 손상된 세포는 BCAA 이화작용 유전자 발현에서 유사한 감소를 보였고 BCAA를 덜 활용할 수 있었습니다. 또한 BCAA 이화작용에서 속도 제한 효소의 한 서브유닛을 인코딩하는 BCKDHB의 녹다운은 ATP 생성을 감소시키는 반면 BCAA 이화작용 증강제 BT2로 치료하면 신진대사가 증가했습니다. 분석신장 기능, KLF6 및 인간 만성에서 BCAA 유전자 발현신장병환자들은 KLF6과 둘 다 사이에 유의한 역상관관계를 보여주었습니다.신장 기능 및 BCAA 발현. 따라서 BCAA 이화작용의 KLF 매개{0}}억제를 표적으로 하는 것은 AKI 및신장섬유증.
CISTANCHE는 신장/신부전을 개선할 것입니다
만성병 환자신장병(CKD)는 상당한 이환율과 사망률을 유발하며 미국 성인 인구에서 ~15%의 유병률을 보입니다. CKD는 반복되는 급성 발작으로 인해 발생할 수 있습니다.신장 손상(AKI) 환경 또는 독성 모욕에 기인하거나 다른 질병 또는 치료에 이차적일 수 있습니다. 대부분의 경우 근위세뇨관(PT)은 AKI의 주요 손상 부위입니다. PT 세포의 높은 대사 활동은 허혈성 손상에 취약하게 만들고 약물과 독소의 배설에서 역할은 잠재적으로 손상을 줄 수 있는 유동을 필요로 합니다. PT 세포(1)를 통한 에이전트. 그러한 부류의 약제는 PT 세포에 축적되어 AKI 및 네프론 손실을 유발하는 DNA 손상 화학요법제입니다. 손상 후 PT 세포는 Wnt 및 Hedgehog 계열 구성원 및 사이토카인과 같은 용해성 인자를 역분화 및 분비합니다(1-4). 살아남은 역분화 PT 세포는 세포 주기에 재진입하고 증식하여 손상된 PT를 복구한 다음 완전히 기능하는 PT 세포로 재분화될 수 있습니다(2). 그러나 대신 G2/M 체크포인트에서 세포 주기 정지를 겪는 세포는 회복되지 않을 수 있으며, 이는 위축 및 전섬유화 신호의 상향 조절로 이어지며(5), 상주하는 섬유아세포를 세포외 기질 단백질을 분비하는 근섬유아세포로 분화를 자극하여 섬유증을 촉발합니다. 대식세포 및 T 세포와 같은 면역 세포 모집(1).
키워드:신장; 급성 신장 손상; 근위 세뇨관; 전사 인자; 분지쇄 아미노산
병원성 신호 전달 경로를 유도하는 것 외에도 손상된 PT 세포는 크게 변경된 세포 대사를 보여줍니다. 손상되지 않은 PT 세포는 ATP 생산을 위해 미토콘드리아 지방산 산화, 트리카르복실산(TCA) 주기 및 산화적 인산화에 크게 의존합니다. 그러나 부상을 입었을 때 지방산 산화가 억제되고 해당과정의 약간의 보상적 상향 조절만 가능하여 부상당한 PT에서 전체 ATP 수준이 감소합니다(6). 또한, 시험관 내 지방산 산화 억제는 관상 상피 세포의 역분화 및 세포 사멸을 유발하고 생체 내 악화신장 손상엽산 치료 후 (6). 흥미롭게도, 미토콘드리아 지방산 산화 또는 과산화소체 지방산 산화(FAO)의 상향 조절은신장 손상(6, 7), 세포 대사의 보존이 AKI에서 치료 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 인간 CKD와 마우스에서 허혈 재관류 손상(IRI) 후 신장 생검에 대한 전사체 연구는 조절되지 않은 지방산 대사와 아미노산 대사를 보여줍니다(6, 8). PT 지방산 산화의 역할은 이전에 AKI에서 설명되었지만 AKI에서 PT 아미노산 대사의 역할은 여전히 탐구되어야 합니다. 또한, 현재까지 설명된 PT 손상의 메커니즘은 개별 신호 분자의 녹아웃 및 과발현이 있는 마우스 모델을 사용하여 크게 탐구되었지만 섬유성/염증성 및 대사성 둘 다의 전체 경로 및 정상 회복과 위축 사이의 전환 메커니즘 AKI에서 규제되며 잘 특성화되지 않습니다.
전사 인자는 다중 다운스트림 표적의 발현을 조절하고 피드백 루프를 형성하는 능력으로 인해 기본적인 생물학적 과정의 마스터 레귤레이터 역할을 합니다. AKI에서 FOS 및 JUN 계열 구성원과 같이 잘 연구된 전사 인자는 고도로 상향 조절됩니다. 인간 샘플의 IRI에 대한 분자 반응과 쥐의 편측성 요관 폐쇄(UUO) 후 PT 번역 프로파일링에 대한 최근 연구에서도 유사한 조기 손상 반응 유전자로 아연-핑거 전사 인자 Krüppel-like factor 6(KLF6)이 확인되었습니다(9, 10 ). KLF는 고도로 보존된 C-말단 DNA-결합 도메인과 광범위하게 발현되는 가변 N 말단을 갖는 아연-핑거 전사 인자 패밀리로 구성되어 있습니다.신장(11). KLF6은 세포 증식 및 분화, 세포자멸사, DNA 손상 반응 및 미토콘드리아 기능과 같은 여러 과정에서 역할을 하며(12) 간, 심장 및신장상황에 따른 효과가 있는 섬유증(13, 14). 내신장, KLF6은 사구체 족세포에서 발현되며 국소 분절 사구체 경화증(FSGS) 설정에서 미토콘드리아 기능의 필수 조절자입니다(15). 사구체 족세포에서의 발현에 더하여, KLF6은 PT에서도 다양하게 발현되지만, 정상 기능 또는 손상 후 PT 세포에서의 역할은 이해되지 않는다. HK-2 세포에서 KLF6의 과발현은 E-cadherin이 감소하고 vimentin 발현이 증가하는 역분화 표현형을 초래했으며 또한 대식세포 염증 단백질의 발현을 증가시켰습니다-3(16). 또한 KLF6 발현은 높은 포도당에 반응하여 증가했으며 이 효과는 TGFB1의 녹다운 또는 TGF{11}} 중화항체 처리에 의해 차단되었습니다. TGF{12}}로 직접 처리하면 KLF6 발현도 유도되어 HK{14}} 세포에서 가능한 양성 피드백 루프를 나타냅니다(16). KLF6은 또한 DNA 손상 화학요법 약물인 시스플라틴의 세포자멸사 이하 용량에 의해 시험관 내 암세포에서 유도되는 것으로 나타났습니다(17). DNA 손상에 대한 PT KLF6의 역할을 결정하기 위해 우리는 자연적으로 발생하는 독소 aristolochic acid I(AAI)를 사용했습니다. AAI 관련 신병증은 임상적으로 관련이 있으며(18), AAI 독성은 PT에 매우 특이적이므로 특히 PT 손상에 대한 반응에서 PT KLF6의 역할에 대한 연구가 가능합니다. 또한 AAI는 대부분의 시스플라틴 요법과 대조적으로 마우스에서 AKI와 섬유증으로의 전환을 안정적으로 유발합니다(19). AAI는 기저외측 유기 음이온 수송체(OAT) 1~3을 통해 PT 세포에 들어가고 아리스토락탐(AL)-DNA 부가물의 형성을 통한 유전독성 효과와 미토콘드리아 손상을 유발하는 세포독성 효과를 모두 가지고 있어 활성산소를 생성하고 정상 세포를 특이적으로 억제합니다. 수용체 매개 세포내이입(18-20)과 같은 PT 기능. 여기에서 우리는 생쥐의 기능 획득 및 기능 상실 연구를 통해 PT에서 특히 KLF6 발현의 조절을 통해 분지쇄 아미노산(BCAA) 이화작용의 KLF 매개 억제가 AKI에 기여한다는 것을 보여줍니다. 그리고 이어지는신장섬유증.
결과
AAI 치료는 신장 PT Klf6 발현을 증가시킵니다. KLF 계열의 여러 구성원이 상피 세포에서 발현되기 때문에신장(21), 우리는 처음에 이러한 상피 Klfs에 대해 qRT-PCR을 수행했습니다.신장피질은 C57BL/6 마우스에서 비히클(디메틸 설폭사이드[DMSO])에 비해 PT-특이적 독소, AAI의 단일 투여 후 24시간 후에 수확되었습니다. Klf4, Klf5 및 Klf6은 유의하게 상향 조절된 반면 Klf15는 유의하게 하향 조절되었으며(그림 1A), 이러한 유전자 발현의 변화는 혈청 크레아티닌의 유의한 상승 이전에 발생했습니다(그림 1B). Klf6 상향 조절이 일시적인지 또는 연장되는지 여부를 결정하기 위해 우리는 2회 주사 또는 3주(활성 단계) 또는 AAI 없이 3주 후 3주 동안(개조 단계) AAI를 3일 간격으로 여러 번 주사했습니다(그림 1C). . PT는 1회 주사 후 24시간 동안 그대로 유지되었지만 2회 주사 후 PT 세포는 세포 사멸을 겪었고 여러 AAI 용량으로 처리된 마우스는 PT, 염증성 침윤물, 단백질의 손실을 보여주었습니다.
캐스트 및 리모델링 단계의 끝에서 섬유증 (그림 1D). Klf6 발현은 손상의 활성 및 리모델링 단계에서 유의하게 상승된 상태로 유지되었으며(그림 1E), 이는 손상의 급성 및 섬유성 단계 전반에 걸쳐 KLF6의 역할을 시사합니다. KLF6은 사구체, 세뇨관 및 염증 세포에서 발현되며, 신장 피질 Klf6 발현의 관찰된 증가에 대한 PT 특이적 Klf6 발현의 기여도를 결정하기 위해 우리는 미세 해부된 S2/S3 PT 세그먼트에서 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 수행했습니다. h PT 세포 손실 전 AAI 주사 1회 후. Klf6은 잘 알려진 초기 반응 전사인자 Fos 및 Jun에 필적하는 수준으로 고도로 상향 조절되었으며, 이는 Klf6 메신저 RNA(mRNA) 발현의 조기 유도가신장PT 세포에서의 발현에 의해 구동됩니다(그림 1F). 이러한 발견은 부상당한 마우스와 인간의 PT 세포에서 Klf6의 상향 조절을 보여주는 최근에 발표된 단일 세포/핵 RNA-seq 데이터와 일치합니다.신장(22, 23). 마지막으로, 이전에 보고된 IRI 시간 경과 연구(8)에서 발현 어레이의 데이터 마이닝은 Fos 및 Jun과 유사하게 AKI의 2시간 이내에 KLF6 발현의 초기 유도를 확인했습니다(그림 1G). 이러한 데이터는 Klf6이 PT-특이적 독소 AAI로 처리한 후 및 IRI 후에 초기 유도성 손상 반응 유전자이고 AAI의 중단에도 불구하고 상승된 상태를 유지함을 시사합니다.
KLF6의 PT-특이적 손실은 AAI 치료 후 활성 및 리모델링 단계에서 신장 손상을 약화시킵니다.AAI 유발 손상에 대한 PT 특이적 KLF6의 기여도를 결정하기 위해 우리는 Klf6fl/fl 마우스(24)를 Pepck-Cre 마우스(25)와 교배하여 Klf6(Klf6PTKD)의 PT 특이적 녹다운을 갖는 마우스를 생성했습니다. Klf6PTKD 마우스는 Klf6fl/fl 마우스와 비교하여 PT 특이적 KLF6 단백질 발현의 현저한 녹다운이 있었지만 간에서 Klf6 mRNA 발현의 변화는 없었고 생존 가능하고 비옥했습니다(SI 부록, 그림 S1 A-C). 에 뚜렷한 차이는 없었다.신장24주령의 Klf6fl/fl 및 Klf6PTKD 마우스 사이의 조직학 또는 기능(SI 부록, 그림 S1 D 및 E), OAT 1~3(Slc22a6, Slc22a7 및 Slc22a8)의 발현 수준, AAI PT 진입 경로, 크게 다르지 않았다(SI 부록, 그림 S1F).
대조군(Klf6fl/fl) 및 Klf6PTKD 마우스는 3주 동안 매 3일마다 비히클(DMSO) 또는 3 mg/kg AAI로 복강 내 처리하고 마지막 AAI 주사 후 3일을 안락사시켜 손상의 활성 단계 또는 3주 후 손상의 리모델링 단계를 평가하기 위한 마지막 AAI 주입(그림 1C). Klf6fl/fl 및 Klf6PTKD 마우스는 1회의 주사 후와 활성 및 리모델링 단계의 끝에서 유사한 양의 AL-DNA 부가물을 가졌으며(SI 부록, 그림 S1 G 및 H), 이는 AAI의 유사한 PT 흡수 및 AL의 복구를 시사합니다 -Klf6fl/fl 및 Klf6PTKD 마우스의 DNA 부가물. 주사를 받는 동안 AAI를 투여한 마우스는 DMSO를 투여한 마우스에 비해 체중이 감소했으며, AAI의 최종 주사 시 Klf6fl/fl 및 Klf6PTKD 마우스 모두에서 기준선에서 유사한 ~18% 감소한 후 유사한 양의 체중을 회복했습니다. SI 부록, 그림 S2A).신장시작({0}}일) 체중 대비 체중은 활성 단계가 끝날 때 DMSO 및 AAI 처리 Klf6fl/fl 및 Klf6PTKD 마우스 간에 유사했습니다(SI 부록, 그림 S2B). 리모델링 단계에서,신장AAI 처리된 Klf6fl/fl 마우스의 무게는 DMSO 처리된 마우스의 무게보다 훨씬 적었지만 AAI 처리된 Klf6PTKD 마우스에서는신장가중치는 보존되었습니다(SI 부록, 그림 S2B).신장 기능혈청 크레아티닌(그림 2A) 및 요소 질소(그림 2B) 농도를 측정하여 평가했습니다. 혈청 크레아티닌과 요소 질소 농도는 DMSO에 비해 AAI를 투여받은 마우스에서 유의하게 상승했습니다. 그러나 상승은 Klf6fl/fl 마우스에 비해 Klf6PTKD 마우스에서 상당히 적었습니다(그림 2A 및 B). 헤마톡실린 및 에오신 및 과요오드산 Schiff 염색을 사용한 조직학적 분석은 AAI로 처리된 Klf6fl/fl 및 Klf6PTKD 마우스 모두에 남아있는 기저막, 염증성 침윤물이 있는 배출 세관을 가지고 있음을 보여주었습니다.
외부 피질, 그리고 피질과 수질 모두에서 다중 단백질 캐스트(그림 2C 및 D). 그러나, 이러한 특징은 Klf6fl/fl 마우스에 비해 Klf6PTKD 마우스에서 덜 심각했으며, 세관 및 더 작은 염증 침윤물이 보존되었습니다. PT 영역의 분석은 완전히 분화된 PT 세포에서 온전한 PT 브러시 경계를 식별하기 위해 형광 로터스 렉틴 염색을 사용하고 손상된 PT를 식별하기 위해 사이토케라틴-20(KRT{4}})에 대한 면역 형광을 사용하여 수행되었습니다(8). DMSO로 처리된 마우스와 비교하여, AAI로 처리된 Klf6fl/fl 및 Klf6PTKD 마우스 모두 로터스 렉틴 염색의 손실과 KRT{8}} 발현의 유도에 의해 나타난 바와 같이 성숙한 PT의 상당한 손실을 가졌으며, 이는 두 가지 모두에서 PT 손상을 나타냅니다. 활성 및 리모델링 단계(그림 2E 및 SI 부록, 그림 S2C). AAI로 처리된 Klf6PTKD 마우스는 활성 단계와 리모델링 단계 모두에서 유사한 수준의 KRT{13}} 유도와 함께 Klf6fl/fl 마우스와 비교하여 성숙한 PT가 유의하게 보존되었습니다. 리모델링 단계의 삼색 염색신장Klf6fl/fl 마우스에서 섬유성 물질의 광범위한 침착을 보여주었으며 Klf6PTKD 마우스에서는 섬유증이 현저히 적었습니다(그림 2F, 파란색 염색, SI 부록, 표 S1). 면역형광법(그림 2G 및 SI 부록, 그림 S2D)을 사용하여 검출된 섬유성 기질 성분 콜라겐 I의 침착은 콜라겐 I이 AAI가 있는 Klf6fl/fl 마우스에서 유의하게 증가했지만 AAI가 있는 Klf6PTKD 마우스에서는 DMSO에 비해 유의하게 증가하지 않았음을 보여주었습니다. 활성 단계. 리모델링 단계에서 콜라겐 I은 AAI가 있는 Klf6fl/fl 및 AAI가 있는 Klf6PTKD 마우스에서 유의하게 증가했으며, AAI가 있는 Klf6fl/fl 마우스와 비교하여 AAI가 있는 Klf6PTKD 마우스의 면적 비율이 상당히 낮습니다. CD68 + 대식세포 및 GR{13}} + 골수 단핵구로 구성된 간질 염증 세포가 Klf6fl/fl에 존재했습니다.
및 Klf6PTKD 마우스는 AAI로 처리되었지만 활성 단계와 리모델링 단계 모두에서 Klf6PTKD 마우스에서는 훨씬 덜 풍부했습니다(그림 2H). 따라서, AAI 처리된 대조군 마우스와 유사한 양의 AL-DNA 부가물의 존재에도 불구하고, PT-특이적 KLF6의 손실은 AAI-유도된 PT 손상, 섬유증 및 염증으로부터 보호합니다. KLF6의 PT-특이적 손실은 AAI 치료 후 염증 신호를 감소시키고 세포 대사를 보존합니다. 우리는 PT KLF6의 손실이 부상으로부터 보호하는 메커니즘을 이해하고자 했으며, 따라서 우리는 다음의 RNA-seq를 수행했습니다.신장cortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- 또는<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">
KLF6에 의해 잠재적으로 직간접적으로 조절되는 경로를 결정하기 위해 Encyclopedia of DNA Elements 프로젝트의 KLF6 염색질 면역침전 시퀀싱(ChIP-Seq) 데이터를 사용하여 KLF6 결합 부위의 존재 및 위치를 기반으로 분류하여 차등적으로 발현된 유전자를 추가로 분석했습니다. . 클래스 2 유전자는 전사 시작 부위(TSS)의 ±1kb 이내에 KLF6 결합 부위가 1개 이상 있는 것으로 정의하고, 클래스 1 유전자는 전사 시작 부위(TSS)의 ±1과 1{13}}kb 사이에 최소 1개의 KLF6 결합 부위를 갖는 것으로 정의했습니다. TSS 및 클래스 0 유전자는 TSS의 ±1{31}} kb 내에 KLF6 결합 부위가 없는 것으로 간주됩니다. 활성 단계에서 Klf6fl/fl 마우스에서 상향 조절되고 Klf6PTKD 대 Klf6fl/fl 마우스에서 유의하게 하향 조절된 538개의 유전자가 있었습니다. 이러한 538개 유전자의 경로 농축 분석은 선천 면역(예: TYROBP, 포식소체 및 대식세포) 관련 및 세포 접착(예: 인테그린, 국소 접착) 관련 경로가 유의하게 풍부함을 보여주었습니다(그림 3A). KLF6 결합 부위에 따른 유전자 분류는 대부분의 DEG(428/538)에 KLF6 결합 부위(class 0)가 없는 것으로 나타났으며, class 2 유전자(72)와 class 0 유전자를 별도로 농축 분석 는 이러한 경로의 중요성이 클래스 0 유전자에 의해 강력하게 유도된다는 것을 보여주었으며, 이는 Klf6PTKD 마우스에서 이러한 유전자의 더 낮은 발현이 PT 특이적 Klf6 녹다운의 결과로 더 적은 PT 손상의 간접적인 효과일 가능성이 있음을 나타냅니다(그림 3A).
CISTANCHE는 신장/신장 기능을 개선합니다
Klf6fl/fl 마우스에서 하향 조절되고 Klf6PTKD 대 Klf6fl/fl 마우스에서 유의하게 보존(상향 조절)된 388개의 유전자가 있었습니다. 경로 농축 분석은 이러한 유전자가 아미노산 대사 및 지방산 대사가 두드러지는 대사 경로를 나타내는 것으로 나타났습니다(그림 3B 및 SI 부록, 그림 S4). 클래스 2 유전자(1{{1{19}}}}3) 및 클래스 0 유전자(246개)의 농축 분석은 TSS의 ±1kb 내에 KLF6 결합 부위를 갖는 유전자의 ~25%에도 불구하고( 클래스 2), 이 유전자 하위 집합은 이러한 경로의 매우 중요한 P 값에 대한 동인이었습니다. 놀랍게도, 특정 아미노산(Val, Leu, Ile[BCAA] 및 Gly, Ser, Thr) 대사 경로는 클래스 2 유전자만 분석했을 때 동등하게 유의했으며, 이는 KLF6에 의한 이러한 경로의 잠재적인 직접 조절을 시사합니다(그림 3B). . 대조적으로, 지방산 대사 경로 및 PPAR 신호 전달 경로의 높은 중요성은 주로 클래스 0 유전자에 의해 구동되었으며, 이는 PT-특이적 Klf6 녹다운의 결과로 이러한 경로의 간접적인 보존을 시사합니다. 모든 차등적으로 조절되는 유전자를 사용한 특정 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 대사 경로(지방산 분해, 아미노산 대사, TCA 주기 및 해당과정)에 대한 유전자 세트 농축 분석은 이들이 다음에서 유의하게 상향 조절(보존)되는 것으로 확인되었습니다. Klf6PTKD 대 Klf6fl/fl 마우스(그림 3C).
KLF6 악화 유도신장 손상AAI 치료 후 BCAA 이화 유전자를 억제합니다. KLF6의 과발현이 반대 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해 "tet-on" 시스템을 사용하여 인간 KLF6(hKLF6OE, 이중 형질전환 CAG-rtTA, TRE-hKLF6)의 독시사이클린(DOX) 유도 발현이 있는 마우스 모델을 생성했습니다. 생쥐) (SI 부록, 그림 S5A). hKLF6OE 마우스는 7일 동안 DOX로 식이를 보충한 후 hKLF6 발현이 강력하게 유도되었으며 마우스 Klf6 발현에는 유의한 차이가 없었습니다(SI 부록, 그림 S5B).신장명백한 조직학적 손상 또는 손실을 나타내지 않았습니다.신장 기능15주 동안 DOX로 지속적으로 처리한 후(SI 부록, 그림 S5 C 및 D) 대조군 마우스(DOX 처리된 TRE-hKLF6)와 비교했습니다. 그러나, PT에서 hKLF6의 유도가 AKI를 악화시키고신장섬유증, hKLF6OE 및 대조군 마우스는 2주 동안 3일마다 1 mg/kg AAI 또는 DMSO의 더 낮은 용량으로 치료한 후 추가 3일(활성 단계) 또는 추가 2주(개조 단계) 후에 안락사를 처리했습니다(SI 부록, 그림 S6A). AAI를 받은 대조군과 hKLF6OE 마우스는 비슷한 양의 체중을 잃었습니다(SI 부록, 그림 S6B).신장가중치는 모든 그룹 간에 유사했습니다(SI 부록, 그림 S6C). hKLF6OE 마우스는 활성 단계에서 AAI 처리 후 대조군 마우스에 비해 혈청 크레아티닌과 요소 질소가 유의하게 상승했습니다(그림 4A 및 B). 이것은 더 높은 비율의 KRT-20-양성 PT와 함께 성숙한 PT의 손실을 동반했으며, 이는 두 시점에서 hKLF6OE 마우스에서 악화되었고(그림 4 C-E 및 SI 부록, 그림 S6D) 두 단계 모두에서 섬유증(그림 4F 및 SI 부록, 그림 S6E). BCAA 대사 경로에서 효소를 코딩하는 유전자의 qRT-PCR 분석은 대조군 및 hKLF6OE 마우스에서 AAI 처리 후 BCAA 유전자의 억제를 보여주었으며, 대조군 마우스와 비교하여 hKLF6OE 마우스에서 추가 억제를 나타냈다(도 4G). 또한, 여러 BCAA 유전자의 발현도 유의하게 감소되거나(Hibch) AAI 처리 없이(DMSO 처리) 대조군 마우스에 비해 hKLF6OE에서 더 낮은 발현 경향을 보였다(도 4G). 이러한 데이터는 성체 마우스에서 hKLF6의 유도가신장BCAA 이화작용을 코딩하는 유전자의 상당한 조절장애로 AKI 및 궁극적인 섬유증에 더 취약합니다.
KLF6의 유도는 시험관 내 ATP 생산을 위한 중요한 기질인 BCAA 이화작용을 억제합니다.미토콘드리아 BCAA ca 대사는 아세틸-CoA 및 숙시닐-CoA 생성에 의한 산화적 인산화에 기여할 수 있습니다(SI 부록, 그림 S4B). KLF6이 시험관 내에서 BCAA와 세포 대사를 조절하는지 여부를 조사하기 위해 먼저 AAI 처리 여부에 관계없이 KLF6(KLF{6}}OE)의 과발현이 있는 HK-2 세포에서 BCAA 대사 유전자의 발현을 평가했습니다. hKLF6OE 마우스에서와 같이 HK{9}} 세포에서만 KLF6의 과발현은 BCAA 효소, 특히 BCKDHB를 암호화하는 여러 유전자의 억제를 유도하는 경향을 보였습니다. 6시간 동안 25μM AAI를 처리한 대조군 KLF{10}Con 세포는 여러 효소의 발현을 유의하게 억제했으며, 이들은 AAI를 처리한 KLF{13}OE 세포에서 더욱 억제되었습니다(그림 5A). 에게
그림 3. KLF6의 손실은 AAI 치료 후 섬유화 경로를 억제하고 대사 경로를 보존합니다. (A) AAI 후 Klf6fl/fl 마우스에서 상향 조절된 유전자의 분류 및 경로 농축 분석, 그러나 AAI 후 Klf6PTKD 마우스에서 결합 부위 클래스에 따라 유의하게 덜 상향 조절된 유전자의 분류 및 경로 농축 분석: 클래스 2 내에서 1 KLF6 결합 부위 이상 ±1kb의 TSS; TSS에서 ±1 ~ 1{15}}kb에 1개 이상의 KLF6 결합 부위가 있는 클래스 1; 및 클래스 0 TSS에서 ± 10kb 이내에 KLF6 결합 사이트가 없습니다. (B) AAI 후 Klf6fl/fl 마우스에서 하향 조절된 유전자의 분류 및 경로 농축 분석, 그러나 AAI 후 Klf6PTKD 마우스에서 결합 부위 클래스에 따라 하향 조절(즉, 보존됨)이 현저히 덜한(즉, 보존됨) 클래스 2와 크거나 같음 TSS의 ±1kb 내에서 1개의 KLF6 결합 부위; TSS에서 ±1 ~ 10kb에 1개 이상의 KLF6 결합 부위가 있는 클래스 1; 및 TSS로부터 ±10kb 이내에 KLF6 결합 부위가 없는 클래스 0. (C) KEGG 지방산 분해(FA DEGRAD), 아미노산 대사(AA METAB) 및 TCA 주기(KEGG{35}}TCA)에 대해 차등적으로 발현된 모든 유전자를 사용한 유전자 세트 농축 분석 플롯.
AAI의 존재 하에 BCAA 유전자 발현의 이러한 억제가 BCAA 이화작용의 변화를 초래하는지 여부를 결정하기 위해 세포내 BCAA 농도를 측정했습니다. AAI 처리 후 KLF{0}} Con 세포는 BCAA의 감소를 보여 BCAA의 증가된 이화작용과 일치하며 잠재적으로 FA 산화 손실에 대한 보상으로 나타납니다(그림 5B). 그러나 이 효과는 AAI 처리 후 세포내 BCAA의 감소가 없는 KLF{2}}OE 세포에서 손실되었으며 이는 BCAA를 이화하는 능력 감소와 일치하며(그림 5B), 이는 감소된 미토콘드리아 ATP 생산과 관련이 있습니다. AAI 처리된 KLF{5}}Con 세포와 비교(그림 5C).
ATP 생산을 측정하는 데 사용되는 표준 배지에는 고농도의 포도당(10mM 포도당, 1mM 글루타민 및 2mM 피루브산)이 포함되어 있으며 KLF6의 과발현만으로도 다른 에너지원의 사용을 변경할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 대신 다음과 같은 분석을 수행했습니다. 에너지 제한 배지(1mM 포도당, 글루타민 및 피루브산이 없는 무혈청 배지)에서 산소 소비율(OCR). KLF6-OE 세포는 미토콘드리아 OCR을 감소시켰지만(로테논/안티마이신 A 투여 후 결정된 초기 OCR에서 비미토콘드리아 OCR을 뺀 값으로 정의됨) 2-데옥시글루코스(2- DG) 및 유사한 FAO(에토목시르로 FAO를 차단한 후 OCR 감소)(그림 5D 및 E). 해당 과정의 손실에 대한 미토콘드리아 반응과 FA 산화로 인한 OCR이 KLF{11}OE 세포에서 변경되지 않았기 때문에 이는 전반적인 미토콘드리아 기능이 영향을 받지 않고 오히려 BCAA를 공급원으로 사용할 수 없음을 시사했습니다. 이러한 에너지 제한 조건에서 미토콘드리아 OCR의 기준선 감소를 설명합니다. BCAA 이화작용의 손실이 미토콘드리아 ATP 생산 감소로 이어지는지 여부를 확인하기 위해 BCKDHB를 녹다운하여 HK{13}} 세포를 생성했습니다(SI 부록, 그림 S7). BCKDHA와 BCKDHB는 BCAA 이화작용의 첫 번째 비가역적이고 속도 제한적인 단계를 촉매하고 BCKDH 키나제(BCKDK)에 의한 인산화에 의해 억제되는 거대 단백질 복합 분지쇄 케톤산 탈수소효소(BCKDH)의 두 소단위를 암호화합니다(28). 대조군 BCKDHB-SCR 및 녹다운 BCKDHB-sh 세포를 미토콘드리아 ATP 생산으로 이동시키기 위해 ATP 생산 속도 분석을 수행하기 전에 1시간 동안 해당과정을 차단하기 위해 2-DG에서 사전 배양했습니다. BCKDHB의 녹다운은 ATP 생산의 현저한 감소를 가져왔고, BCAA가 인간에서 ATP를 생성하는 데 사용됨을 보여줍니다.신장세포(그림 5F). 반대로
그림 4. hKLF6OE 마우스가 악화됨신장 손상BCAA 유전자 억제. (A 및 B) 활성 단계에서 DMSO 또는 AAI로 처리된 대조군 및 hKLF6OE 마우스의 혈청 크레아티닌(A) 및 요소 질소(B) 농도. n=4 - 그룹당 9; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" 대="" dmso를="" 사용한="" 동일한="" 유전자형;="" **p="">< 0.01="" 대="" aai를="" 사용한="" 대조군;="" 다중="" 테스트를="" 위한="" sidak="" 보정을="" 사용한="" 일원="" 분산="" 분석.="" (c="" 및="" d)="" 헤마톡실린="" 및="" 에오신(c)="" 및="" 과요오드산="" 쉬프(d)="" 염색을="" 사용하여="" 염색된="" 대표적인="" 조직학적="" 이미지.="" 노란색="" 화살표:="" 세뇨관="" 흘리기;="" 검은색="" 화살표:="" 잔여="" 기저막;="" 노란색="" 화살촉:="" 단백질="" 캐스트;="" 및="" 검은="" 화살촉:="" 염증성="" 침윤물.="" (축척="" 막대,="" 1{33}}0="" μm.)="" (e)="" 로터스="" 렉틴(ll)과="" 함께="" 염색된="" 손상된="" pt(빨간색)의="" 마커로서의="" 사이토케라틴-20(krt{14}})에="" 대한="" 면역형광="" 염색="" )="" 손상되지="" 않은="" pt의="" 마커(녹색).="" (축척="" 막대,="" 250="" μm.)="" (f)="" edu(마젠타)에="" 대한="" 공동="" 염색이="" 있는="" -sma(녹색)에="" 대한="" 면역형광="" 염색.="" (스케일="" 막대,="" 100="" μm.)="" (g)="" 활성="" 단계에서="" dmso="" 또는="" aai로="" 처리된="" hklf6oe="" 마우스="" 및="" 대조군에서="" bcaa="" 유전자의="" mrna="" 발현.="" n="5" 그룹당="" 9개;="" $p="">< 0.01,="" $$p="">< 0.001="" 대="" dmso를="" 사용한="" 대조군;="" aai가="" 있는="" 모든="" hklf6oe는="" dmso가="" 있는="" hklf6oe에="" 비해="" p="">< 0.001입니다.="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" 대="" 동일한="" 처리로="" 대조군;="" benjamini,="" kreiger="" 및="" yekutieli의="" 2단계="" 스텝업="" 모델을="" 사용하여="" 잘못된="" 발견률="" 수정이="" 있는="" 다중="" t="" 테스트.="" 데이터는="" 생물학적="" 복제="" 수를="" 나타내는="" n이="" 있는="" 평균="" ±="">
BCAA 이화작용을 향상시키기 위해 HK{0}} 세포를 BCKDK를 억제하는 BT2로 처리하여 BCKDH의 억제 인산화를 차단했습니다. 에너지 제한 조건에서 BT2 처리는 DMSO 처리된 세포에서 OCR을 증가시켰는데, 이는 해당과정이 억제된 후에도 유지되었으며 FAO 또는 비미토콘드리아 OCR의 변경으로 인한 것이 아닙니다(그림 5G 및 H). 이러한 발견은 BCAA 이화작용의 KLF{6}}매개 억제가 미토콘드리아 ATP 생산을 감소시키며, 이는 FAO가 손상되어 유사하게 에너지 제한 조건이 존재하는 세포 스트레스 환경에서 PT 손상을 악화시킬 수 있음을 나타냅니다.
다양한 마우스 및 인간에서 BCAA 유전자 발현 감소신장 손상. BCAA 유전자 발현의 손실이 PT 손실 전에 발생하고 AAI 유도 손상에서 크레아티닌 수준 증가가 발생하는지 확인하기 위해 우리는 단일 용량의 AAI로 처리하고 24시간 후에 안락사시킨 C57BL/6 마우스에서 qRT-PCR을 수행했습니다. Bckdhb, Hibch 및 Mccc2는 이 시점에서 이미 상당히 하향 조절되었으며, 다른 유전자(예: Acadm)는 하향 조절에 대한 강한 경향을 보여줍니다(그림 6A). 다른 마우스에서 BCAA 유전자 발현 연구신장 손상모델에서, 우리는 시스플라틴으로 처리된 마우스(그림 6B) 또는 UUO 대상(그림 6C)에서 qRT-PCR을 수행했습니다. 두 모델 모두에서 Klf6 발현은 비히클/대조군에 비해 고도로 상향 조절되었습니다. 시스플라틴 처리된 마우스에서 테스트한 BCAA 유전자 중 일부가 유의하게 하향 조절되었으며 다른 유전자의 하향 조절 경향이 있었습니다(그림 6B). UUO가 적용된 마우스에서 테스트된 모든 유전자는 UUO 후 3일과 7일 모두에서 유의하게 하향 조절되었으며(그림 6C), 이는 BCAA 유전자의 하향 조절이 손상 후 조기에 발생함을 시사합니다.
그림 5. KLF6 과발현은 시험관 내에서 BCAA 유전자 발현, ATP 생산 및 BCAA 활용을 억제합니다. (A) DMSO 또는 AAI로 처리된 대조군(Con) 또는 KLF6 과발현(OE) 플라스미드를 안정적으로 발현하는 HK-2 세포에서 KLF6 및 BCAA 대사 유전자의 발현. n 그룹당=4 *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" 대="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.001="" 대="" 동일한="" 셀라인="" dmso;="" 다중="" 테스트에="" 대한="" tukey="" 보정을="" 사용한="" 양방향="" anova.="" (b)="" dmso="" 또는="" aai로="" 처리된="" con="" 및="" oe="" 세포에서="" 총="" bcaa의="" 정량화.="" 그룹당="" n="6" $p="">< 0.05="" 대="" con="" dmso;="" 다중="" 테스트에="" 대한="" sidak의="" 수정을="" 사용한="" 일원="" 분산="" 분석.="" (c)="" aai="" 대="" dmso로="" 처리된="" con="" 및="" oe="" 세포에서="" 미토콘드리아="" atp="" 생산="" 속도의="" 백분율="" 변화.="" n="27" -="" 그룹당="" 30개;="" *p="">< 0.05,="" ***p="">< 0.001="" 대="" dmso,="" $p="">< 0.05="" 대="" con="" aai;="" 다중="" 테스트에="" 대한="" sidak의="" 수정을="" 사용한="" 일원="" 분산="" 분석.="" (d)="" 제한된="" 매체에서="" con="" 및="" oe="" 세포에="" 대한="" ocr="" 측정.="" 표시된="" 경우,="" 2-dg,="" 에토목시르(eto)="" 및="" 로테논/항마이신="" a의="" 조합(rot)을="" 첨가했습니다.="" 그룹당="" n="16." (e)="" 기본="" 미토콘드리아="" ocr(시작="" ocr에서="" rot-rot="" ocr을="" 뺀="" 값),="" 비미토콘드리아="" ocr(rot="" ocr="" 이후)의="" 정량화="" 및="" 2-dg({38}}dg="" 후="" 미토콘드리아="" 보상)를="" 추가한="" 후="" ocr의="" 변화="" 및="" 에토목시르(fao).="" 그룹당="" n="16;" **p="">< 0.01="" 대="" con;="" 다중="" 테스트에="" 대한="" tukey="" 보정을="" 사용한="" 양방향="" anova.="" (f)="" bckdhb-scr="" 및="" bckdhb-sh="" 세포에서="" 미토콘드리아="" atp="" 생산="" 속도.="" 그룹당="" n="14;" **p="">< 0.05,="" 짝을="" 이루지="" 않은="" t="" 테스트.="" (g)="" bt2의="" 부재="" 또는="" 존재하에="" 제한된="" 배지에서="" hk{48}}="" 세포의="" ocr="" 측정.="" 표시된="" 곳에="" 2-dg,="" eto="" 및="" rot가="" 추가되었습니다.="" (h)="" bt2의="" 부재="" 또는="" 존재="" 하에="" hk{52}}="" 세포에="" {{51}dg="" 및="" 에토목시르를="" 추가한="" 후="" 기저="" 미토콘드리아="" ocr,="" 비미토콘드리아="" ocr="" 및="" ocr의="" 변화="" 정량화.="" 그룹당="" n="8;" *p="">< 0.05="" 대="" bt2="" 없음;="" 다중="" 테스트에="" 대한="" tukey="" 보정을="" 사용한="" 양방향="" anova.="" 데이터는="" 생물학적="" 복제="" 수를="" 나타내는="" n이="" 있는="" 평균="" ±="">
유사하게, 36명의 인간 CKD 환자(고혈압 및 당뇨병신장 질환) 대조군 환자(6)와 비교하여 여러 BCAA 유전자가 AAI 처리된 마우스와 유사한 방식으로 하향 조절되는 것으로 나타났다(도 6D). 간의 관계를 더 명확히 하기 위해신장 기능, KLF6 발현 및 인간 CKD에서 BCAA 유전자의 발현에 대해, 우리는 다양한 질환을 가진 164명의 환자 시리즈의 tubu lointerstitial 구획에서 공개된 발현 어레이를 사용했습니다.신장 질환 (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>9{4}} mL/min/1.73m2)(모든 유전자에 대해 P < 0.001),="" 유전자="" 발현의="" 이러한="" 변경이="" 기능적="" 변화와="" 관련하여="" 조기에="" 발생할="" 수="" 있음을="" 보여줍니다.="" 종합적으로,="" 이러한="" 데이터는="" bcaa="" 이화작용에="" 중요한="" 유전자의="" klf="" 매개="" 억제가{6}}악화에="" 중요한="" 역할을="" 할="" 수="" 있음을="">신장 손상쥐 모델에서신장섬유증 및 인간 CKD.
논의
이 연구에서 우리는 PT-특이적 KLF6의 생체 내 역할을 입증합니다.신장 손상.KLF6은 PT 초기에 강력하고 일관되게 상향 조절됩니다.신장 손상그러나 이것은 임상적으로 관련이 있고 고도로 PT 특이적 독소 AAI로 치료한 후 PT Klf6 손실의 보호 효과에 의해 입증된 바와 같이 부적응 반응입니다. 또한, 우리는 AKI 및 이어지는 섬유증에 대한 가능한 기여자로서 손상된 PT에서 조절되지 않은 BCAA 대사의 잠재적 중요성을 보여줍니다. Klf6의 손실은 BCAA 이화 효소 발현의 보존으로 이어졌으며, 이러한 효소를 인코딩하는 여러 유전자는 TSS에 매우 근접한 KLF6 결합 부위를 가지며, 이는 KLF6이 BCAA 이화작용의 전사 억제제일 수 있음을 시사합니다. KLF 계열의 또 다른 구성원인 KLF15가 이전에 골격근 분지쇄 아미노전이효소 2(Bcat2) 발현을 조절하는 것으로 나타났지만(30), 다른 BCAA 효소의 조절은 보고되지 않았습니다. 우리는 KLF6이 BCAA 효소를 암호화하는 여러 유전자의 발현을 억제하는 작용을 한다고 가정합니다.
손상되지 않은 PT에서 Klf6 발현은 낮고 일부 PT 세포에서는 다양하게 발현되고 다른 세포에서는 발현되지 않습니다. 여러 유형의 부상 후에 발생하는 빠르고 강력한 상향 조절은 KLF6의 생리학적으로 중요한 역할을 시사합니다. 섬유아세포에서 KLF6은 최근 발암성 및 산화 스트레스에 대한 반응으로 상향 조절되어 세포 노화로 이어지는 반면, KLF6의 침묵은 DNA 손상 및 게놈 불안정성의 마커 축적을 초래하는 것으로 나타났습니다(31). 따라서 손상에서 KLF6의 생리학적 역할은 세포 노화를 유도하여 독성 또는 산화/허혈 손상으로 인해 발생할 수 있는 DNA 손상을 복구할 수 있습니다. 그러나 손상된 PT 세포에서 Klf6 상향 조절의 두 번째 결과는 PT 세포에서 특히 해로울 가능성이 있는 BCAA 이화작용의 억제인 것으로 보입니다. 흥미롭게도, Klf6PTKD 마우스의 기준선에서 PT-특이적 Klf6의 부분적 녹다운에도 불구하고, 이것은 여전히 부상 후 명확한 보호 효과를 부여할 수 있었습니다. 이것은 KLF6 수준 또는 활성의 작은 조작(예: 소분자 억제제 사용을 통한)만이 치료 효능을 나타낼 수 있음을 시사하기 때문에 중요한 치료 의미를 갖습니다. 실제로, 전사 인자는 다른 유전자 패밀리보다 가능성이 더 높습니다.
인간 게놈에서 투여 감도를 가질 수 있습니다(32). 유사하게, 우리의 유도성 KLF6 과발현 쥐 모델의 한 가지 한계는 PT 세포가 제한되지 않는다는 것이므로 향후 연구는 KLF6의 세포 상황 종속적 역할을 설명하기 위해 세포 특이적 유도성 모델을 사용하는 데 초점을 맞춰야 할 것입니다.
우리는 이전에 사구체 족세포에서 Klf6의 손실이 사이토크롬 c 산화효소 2(Sco2) 합성의 전사 활성화에서의 역할로 인해 FSGS 설정에서 해롭다는 것을 입증했습니다. FSGS에서 Klf6의 손실은 내재적 세포자멸사 경로의 활성화 증가와 함께 더 심한 섬유증으로 이어졌습니다(15). 사용 가능한 단일 세포 RNA-seq 데이터 세트의 질문은 건강한 마우스에서 다음을 보여줍니다.신장,Klf6은 PT 세포보다 훨씬 더 많은 비율의 족세포에서 발현되고 훨씬 더 높은 수준으로 발현됩니다(ref. 33; https://susztaklab.com/). 따라서 KLF6은 PT 세포보다 정상 족세포에서 더 중요한 생리학적 역할을 하는 반면, 다른 알려진 미토콘드리아 마스터 조절자(예: Ppara)는 족세포보다 PT 세포에서 훨씬 더 많이 발현됩니다. 따라서 족세포에서 Klf6의 손실은 PT 세포에서보다 더 해로운 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 내에서 다른 세포 유형에서 KLF6의 대조적인 역할신장심장과 간에서 세포 특이적 효과에 대한 이전의 발견과 유사합니다. 따라서 쥐의 심장 근육 세포에서 Klf6의 녹다운은 안지오텐신 II 과부하 후 심장 섬유증을 약화시켜 섬유증을 전파하는 KLF6의 역할을 시사하지만 심장 근섬유아세포에서 Klf6의 녹다운은 섬유증에 영향을 미치지 않습니다(14). 반대로 간에서 마우스 간세포에서 Klf6의 녹다운은 만성 CCl4 투여 후 간 섬유증에 영향을 미치지 않았지만 간 성상 세포에서 KLF6의 과발현은 섬유증을 감소시켜 KLF6이 보호적임을 시사합니다(13).
CISTANCHE는 신장/신장 통증을 개선합니다
FAO 손실신장 손상지금은 병리학에서 중요한 사건으로 알려져 있습니다.신장 손상실제로 섬유증에 직접 기여할 수 있습니다. 부상당하지 않은 PT의 주요 에너지원인 FAO가 없는 경우 다른 잠재적 에너지원이 더 중요할 수 있습니다. BCAA는 아세틸-CoA 및 숙시닐-CoA 생성을 통해 TCA 회로에 기여합니다. 최근 연구는 13C로 표지된 BCAA가 TCA 주기 중간체에 기여할 뿐만 아니라신장하지만신장췌장, 근육 및 백색 지방 조직(34) 다음으로 테스트된 기관의 TCA 주기 중간체에 13C가 네 번째로 많이 포함되어 BCAA가 TCA 주기에 잠재적으로 중요한 기여자임을 시사합니다. 그러나 정상 또는 부상에서 TCA 주기에 기여하는 BCAA 이화작용의 중요성신장, 이전에 탐색된 적이 없습니다. 예를 들어, PT BCAA 이화작용의 손실만으로도 PT 항상성 및/또는 복구의 변화를 일으킬 수 있는지 여부는 알려져 있지 않으며, 이러한 연구는 PT-특이적 Bckdhb 녹다운 마우스와 같은 새로운 마우스 모델의 생성이 필요합니다. 의 설정에서신장손상, FAO가 심하게 억제되면 추가 억제
BCAA 대사 효소를 암호화하는 유전자는 중요한 대체 에너지원의 관 세포를 박탈할 수 있습니다. BCAA 유전자 발현은 혈청 크레아티닌 또는 PT 손실의 변화 이전에 단일 주사 후 24시간 후에 이미 하향 조절되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 감소된 GFR 및 결과적으로 용질 흡수에 대한 감소된 요구로부터. 이러한 경로는 손상으로부터 보호된 Klf6PTKD 마우스에서 보존되었고 손상이 더 심한 hKLF6OE 마우스에서 더욱 억제되었습니다. 또한, KLF6-OE 세포는 KLF6-Con 세포에 비해 AAI 처리 후 미토콘드리아 ATP 생성이 감소했으며, KLF6-Con 세포에서는 세포 내 BCAA가 감소하여 이화작용과 일치했습니다. , 이 감소는 KLF{6}}OE 세포에서 감지되지 않았습니다. 또한, HK-2 세포에서 BCKDHB의 녹다운은 미토콘드리아 ATP 생산을 감소시켰습니다. 따라서, Klf6PTKD 마우스에서 BCAA 유전자의 보존된 발현은 심각하게 감소된 FA 산화 설정에서 중요한 TCA 주기 중간체를 공급함으로써 손상에 대한 보호를 제공할 수 있습니다. BCAA 이화작용의 유전적 조작 및/또는 BT2 치료가 있는 마우스를 사용한 향후 연구를 통해 BCAA 이화작용과 FAO 사이의 역학을 조사할 수 있을 것입니다.신장 손상.
우리는 BCAA 유전자의 발현 손실이 미토콘드리아 호흡 및 ATP 생산 감소로 이어진다는 것을 보여주었으며, 이는 BCAA 이화작용의 손실이신장 손상. 대안적인 메커니즘은 독성 효과를 가질 수 있는 BCAA의 축적을 통한 것일 수 있습니다. 실제로 이것은 심장 IRI의 설정에서 보여졌습니다. 이화작용의 손실로 인한 BCAA의 축적은 번역 후 피루브산 탈수소효소를 비활성화하여 미토콘드리아 피루브산 이용을 억제하여 추가 세포 에너지원을 제거하고 손상을 악화시키는 것으로 나타났습니다(35). 이것은 생쥐를 BT2로 처리하여 BCAA 이화작용을 증가시키거나 GLUT1의 과발현에 의해 포도당 대사를 증가시킴으로써 역전되었습니다. 최근 연구에서는 당뇨병 생쥐에서 BCAA 이화작용의 손실에 의한 심장 IRI의 악화도 보여주었습니다. 이것은 증가된 산화 스트레스를 동반했으며 BCAA 이화작용의 재활성화로 다시 역전되었습니다(36). BCAA 및 특히 류신은 포유동물의 라파마이신 표적(mTOR) 복합체 1(mTORC1) 신호전달을 활성화하는 것으로 알려져 있습니다. 다낭성 쥐 모델에서신장병,낭종을 둘러싸고 있는 세포가 mTOR를 활성화시키는 경우
신호, BCAA 보충은 mTORC1 신호를 추가로 활성화하여 증식을 증가시킵니다(37). 간세포 암종의 전사 프로파일링은 BCAA 유전자 발현을 감소시켜 종양 조직에 BCAA를 축적시키는 것으로 나타났습니다. 이것은 BCAA를 제한하거나 BT2로 치료함으로써 감소된 mTORC1 신호전달 및 증식 증가와 관련이 있으며 높은 BCAA 식이를 섭취한 마우스에서 악화되었습니다(38). mTORC1 신호전달은 PT 기능에 필요하며 mTOR 억제제를 사용한 연구신장 손상다른 투여 요법, 치료 시기 및 부상 모델로 인해 상충되는 결과를 보여주었습니다(39-42). mTORC1 신호전달은 세포 성장 및 증식, 지질 합성, 미토콘드리아 합성 및 자가포식 억제를 비롯한 다양한 세포 반응을 유도합니다(43). mTORC1 신호전달의 과소 또는 과활성화가 해로울 수 있으며 올바른 세포 기능을 위해서는 균형이 필요합니다. 예를 들어, PT 손상에서 mTORC1 신호의 과활성화는 손상된 미토콘드리아 제거에 필요한 자가포식의 해로운 억제로 이어질 수 있으며 PT 후 회복에 중요한 것으로 나타났습니다.부상 (39, 42, 44, 45). 따라서 류신의 축적은신장 손상mTORC1 신호의 과활성화 및 자가포식 억제. 결론적으로, 우리는 에서 발생하는 Klf6의 강력한 상향 조절을 보여주었습니다.신장 손상PT-특이 Klf6의 손실이 BCAA 유전자 발현을 보존하고 AKI 및 궁극적인 섬유증을 약화시키는 유해합니다. 반대로, 마우스에서 KLF6의 유도는 BCAA 유전자 발현을 억제하고신장~에 민감한신장 손상.또한, 여러 BCAA 효소를 인코딩하는 유전자에는 KLF6 결합 부위가 있어 KLF6이 BCAA 이화작용의 전사 조절자일 수 있음을 시사합니다. KLF6의 과발현 및 AAI 처리 또는 BCKDHB의 녹다운에 의한 시험관내 BCAA 이화작용의 하향 조절미토콘드리아 ATP 생산 감소. 종합적으로 이들데이터는BCAA 이화작용은 대체 미토콘드리아를 제공할 수 있습니다의 설정에서 에너지 소스신장 손상어느 FAO에서줄어들었다.
