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Morus Alba에서 분리된 Kuwanon T 및 Sanggenon A는 BV2 및 RAW264.7 세포에서 NF-κB 및 HO-1/Nrf2 신호 전달 경로를 조절하여 항염 효과를 나타냅니다.

Mar 30, 2022

더 많은 정보를 위해서. 연락하다tina.xiang@wecistanche.com

추상적인: 우리는 이전에 뽕나무 껍질의 메탄올 추출물을 조사하고 추출물에서 11가지 화합물을 특성화했습니다: kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), 물베로푸란 B(7), 물베로푸란 G(8), 모라신 M(9), 모라신 O(10) 및 노르아르토카르파논(11). 여기서 조사한항염증미세아교세포(BV2) 및 대식세포(RAW264.7)에 대한 이들 화합물의 효과. 그 중3과 4는 이들 세포에서 지질다당류(LPS)에 의한 산화질소 생성을 현저하게 억제하여 이 두 화합물의 항염 특성을 시사합니다. 이 화합물은 LPS 자극 후 프로스타글란딘 E2, 인터루킨{8}} 및 종양 괴사 인자-c의 생성과 유도성 산화질소 합성효소 및 시클로옥시게나제{10}}의 발현을 억제했습니다. 3과 4로 전처리하면 두 세포 유형 모두에서 핵 인자 카파 B 신호 전달 경로의 활성화가 억제되었습니다. 이 화합물은 또한 핵인자 적혈구계 관련 인자 2의 활성화를 통해 헴 옥시게나제(H2O){13}}의 발현을 유도했습니다. H2O{16}}의 활성을 억제하여 유발된 항염증 효과를 역전시켰습니다. 3과 4로 전처리하여 항염증 효과가 HO{21}}에 의해 조절되었음을 시사합니다. 종합하면, 3과 4는 다음의 치료제 및 예방제를 개발할 수 있는 잠재적인 후보입니다.염증성 질환.

키워드: 뽕나무 알바; 쿠와논 T; 상게논 A; BV2; RAW264.7 셀; 항염 효과

flavonoids anti-inflammatory

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1. 소개

뽕나무과에 속하는 약용 식물인 뽕나무는 전통 의학에서 폐 염증 상태를 치료하는 데 사용되었습니다[1]. 뿌리 껍질에는 움벨리페론, 스코폴레틴, 뮤신, 탄닌,플라보노이드(morusin, mulberrin, mulberrichromene, cyclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E 및 kuwanon H)[2], 2-아릴벤조퓨란(모라신 D, 모라신 P, 모라신 O 및 뮬베로푸란 O), 및 프레닐화 플라보노이드(licoflavone C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin 및 Kuwana U)[3,4]. M. alba 추출물과 활성 화합물은 최근 연구에서 밝혀진 바와 같이 폐 질환을 완화할 수 있습니다[5-7]. M.alba가 폐에 미치는 약리학적 효과 외에도 이소프레닐화 플라보노이드(sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G, mulberrofuran C)는 t-BHP로 유도된 HepG2 세포에서 간 보호 효과를 나타냅니다[8]. Prenyl-flavonoids(kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T, morusin)와 triterpenoids(betulin acid, avail 및 -sitosterol)는 3T{12}}L1 지방세포의 분화를 실질적으로 억제합니다[9]. M. alba의 주요 플라보노이드 성분인 Morin hydrate는 예측할 수 없는 만성 스트레스 유발 기억 장애를 완화하는데, 이는 이 화합물이 항산화 방어 시스템을 강화하고 신경염증 경로를 억제할 수 있음을 나타냅니다[10]. 이러한 연구는 M.alba에 포함된 성분이 다양한 질병을 치료할 수 있는 잠재적인 후보임을 시사합니다.

염증유해 자극에 대한 복잡한 자기 방어 반응은 대식세포, 단핵구, 백혈구, 비만 세포 및 기타 세포 유형을 포함한 여러 면역 세포의 활성화를 통해 면역 방어에서 중요한 역할을 합니다[11]. 대식세포는 체내에서 가장 풍부하고 널리 분포된 면역세포이며, 소교세포는 중추신경계(CNS)에 상주하는 대식세포이다[12]. 대식세포와 소교세포는 염증 반응의 핵심 역할을 합니다. 그들은 지질다당류(LPS), 사이토카인, 케모카인과 같은 자극에 반응하여 활성화될 수 있으며 염증 상태를 유발할 수 있습니다[13]. 염증 조건에서 과도하게 활성화된 대식세포와 소교세포는 염증유발 매개체(산화질소(NO), 프로스타글란딘 E2(PGE,), 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 및 시클로옥시게나제(COX)의 비정상적인 조절을 유발합니다.{6}} ) 및 전염증성 사이토카인(인터류킨(IL)-6 및 종양 괴사 인자(TNF)-a), 핵 인자 카파 B(NF-B) 신호 전달 경로의 활성화를 통해[14,15]. 증가된 염증유발 매개체는 염증성 질환의 진행을 더욱 악화시키고, 이는 염증인자의 활성화를 더욱 증가시켜 악순환을 초래한다[16]. 따라서 염증성 질환의 치료 및 예방을 위해서는 염증 매개체의 조절이 필수적이다.

헴 옥시게나제(H2O)-1는 헴을 빌리베르딘, 제1철 이온(Fe2+) 및 일산화탄소(CO)로 분해하는 것을 촉매하는 속도 제한 효소입니다[17]. HO-1 유도는 핵 인자 적혈구계 2-관련 인자 2(Nrf2)의 활성화에 의해 조절됩니다. HO-1는 조직을 보호하고 신체의 항상성을 유지하기 위해 산화 스트레스와 염증에 반응하여 유도될 수 있습니다[18]. 따라서 H2O 유도를 표적으로 하는 것은 염증성 질환을 치료하기 위한 잠재적인 전략 중 하나입니다.

염증성 질환을 치료하기 위해 천연물로부터 후보물질을 탐색하기 위한 우리의 지속적인 노력에서, 우리는 여기에서항염 효과LPS-유도 BV2 및 RAW264.7 세포에서 M.alba로부터 분리된 11l 화합물의.

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2. 결과

2.1. BV2 및 RAW264.7 세포의 생존율에 대한 M.alba에서 분리된 11개 화합물의 효과

이전 연구에서 M.alba의 뿌리 껍질을 수성 메탄올에서 추출하고 얻은 추출물을 EtOAc, n-BuOH 및 H2O2로 연속적으로 분배했습니다. SiO2, ODS 및 Sephadex LH{4}} 컬럼 크로마토그래피를 반복하여 EtOAc 분획물의 kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon과 같은 11개의 화합물을 얻었다. M(5), 상게놀 A(6), 물베로푸란 B(7), 물베로푸란 G(8), 모라신 M(9), 모라신 O(10) 및 노르아르토카르파논(11)[6,19,20]. M.alba에서 분리된 11개 화합물의 화학 구조는 그림 1에 나와 있습니다. 이러한 화합물의 세포독성 효과를 확인하기 위해 3-(4,{24}}디메틸티아졸-2-일){{ 26}}.{27}}디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 수행하고 BV2 및 RAW264.7 세포를 최대 80μM 농도에서 표시된 농도의 화합물로 48시간 동안 처리했습니다. (그림 2). 화합물 2, 3, 4는 80μM에서 독성 효과가 있었고, 화합물 5는 40μM에서 독성 효과가 있었습니다. 독성 평가 결과에 따라 항염 효과에 대한 후속 연구를 위해 무독성 농도 범위를 선택했습니다(화합물 2, 3,4 at 40 uM, 화합물 5 at 200 μM, 기타 화합물 80 μM) .

Chemical structures of compounds 1–11 isolated from M. alba

Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were incubated for 48 h with various concentrations of the compounds, and their viability was determined using MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 ,*** p < 0.001 compared with the control group. Figure 2. Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW

2.2. M. alba에서 분리한 l1 화합물이 BV2 및 RAW264.7 세포에서 염증 인자 및 iNOS 단백질의 발현에 미치는 영향

NO는 심혈관, 신경계 및면역 체계. 세포 내 항상성을 유지하고 신경 전달 물질을 운반하며 항염증 활성과 세포 독성을 조절합니다. 그러나 다량의 NO가 생성되면 혈관 확장, 세포 독성 및 조직 손상을 포함하여 신체에 해로운 영향을 미칩니다[21,22]. 그런 다음 우리는 LPS로 유도된 BV2 및 RAW264.7 세포에서 아질산염 생성에 대한 이러한 화합물의 영향을 조사했습니다. 세포를 24시간 동안 LPS(1ug/mL)로 자극하기 전에 2시간 동안 다른 농도의 화합물로 처리했습니다. 화합물 중 화합물 3(kuwanonT)과 4(sanggenon A)만이 BV2 및 RAW264.7 세포주에서 아질산염 생성을 유의하게 억제했습니다(그림 3). 또한, 화합물 전처리 후 LPS 처리군과 LPS 전처리 후 화합물 처리군 간의 아질산염 생성 억제 효과를 비교하기 위한 추가 실험을 수행하였다. 그 결과, 두 실험군 사이에 아질산염 생성 억제 효과에 차이가 없었습니다(보충 그림 S1). 따라서 본 연구에서는 LPS 처리 전 2~3시간 이내에 화합물을 전처리하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

산화질소 생성은 염증유발 단백질 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)에 의해 증가됩니다. 그러나 iNOS의 과발현은 질병의 병태생리를 심각하게 손상시킨다[23]. 화합물 3 및 4는 농도 의존적 ​​방식으로 iNOS의 발현을 억제하였다(도 4). 우리는 BV2 및 RAW264.7 세포에서 염증 인자의 LPS 유도 발현에 대한 화합물 3 및 4의 효과를 조사했습니다. 세포를 24시간 동안 LPS(1ug/mL)로 자극하기 전에 2시간 동안 상이한 농도의 화합물 3 및 4로 처리하였다. 두 화합물 모두 BV2 및 RAW264.7 세포에서 PGE2, TNF 및 IL{19}}의 LPS 유도 발현을 유의하게 억제했습니다(그림 5). 결과는 화합물 3 및 4로의 전처리가 BV2 및 RAW264.7 세포에서 LPS-유도 염증을 억제하는 것으로 나타났다.

Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Molecules 2021, 26, x FOR PEER REVIEW 5 of 16 Figure 3. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A,D), IL-6 (B,E), and TNF-α (C,F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

effects of cistanche improve immunity (33)

2.3. BV2 및 RAW264.7 세포에서 NF-xB 전위에 대한 화합물 3 및 4의 효과

NF-kB는 iNOS 발현을 조절하는 전사 인자이다[24]. 정상적인 NF-kB는 IKB와 같은 조절 단백질과 복합체를 형성하여 불활성 형태로 남아 있습니다. 그러나 LPS에 의해 활성화되면 IkBa가 인산화에 의해 분해되고 NF-kB(예: p65)가 핵으로 전위되어 염증 매개 유전자를 촉진하고 염증 인자의 발현을 유도한다[26]. LPS로 활성화된 BV2 및 RAW264.7 세포에서 전염증 인자 생성에 대한 화합물 3 및 4의 억제 효과를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 화합물 3 및 4, LPS 또는 둘 다 항-p65 FITC 표지 항체를 사용합니다. DAPI는 핵 염색에 사용되었습니다. 대조군에서는 세포질에서 p65 발현이 검출되었다. 그러나 LPS로 유도된 세포에서는 DAPI와 p65 염색의 병합 이미지에서 볼 수 있듯이 핵에서 p65 축적이 감지되었습니다. 더욱이, LPS-유도 세포와 비교하여, 화합물 3 및 4는 NF-KB(p65) DNA-결합 활성(도 6A, B) 및 핵 전위(도 6C-F)의 LPS 매개 증가를 현저하게 감소시켰다. 이러한 발견은 화합물 3과 4가 LPS에 의해 자극된 NF-kB 핵 전위의 음성 조절자임을 나타냅니다.

Effects of compounds 3 and 4 on and NF-κB DNA-binding activity (A,B) and NF-κB (p65) localization (C–F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated with compounds 3 or 4 for 2 h and stimulated with liposaccharide (LPS; 1 µg/mL) for 1 h. Experiments were performed using a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kit, as described in the Materials and Methods section. ** p and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

2.4. BV2 및 RAW264.7에서 Nrf2/HO{5}} 경로에 대한 화합물 3 및 4의 효과

세포 헴 옥시게나제-1(HO-1)는 핵인자 E2-관련 인자 2(Nrf2)의 표적이며, Nrf2/HO{6}} 경로는 강력한 항산화 신호전달 시스템입니다. 일산화탄소(CO), biliverdin 및 heme에서 유리 철을 촉진하기 위해 [27]. 헴 이화작용의 기체 대사산물인 일산화탄소는 혈관 확장과 염증 유발 반응의 조절 효과를 나타냅니다[28]. 또한, HO-1는 염증과 산화 스트레스로부터 세포를 보호하고 활성화된 대식세포에서 아질산염 생성을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다[29]. 우리는 화합물 3과 4가 H2O{13}}의 발현 수준을 증가시키는지 알아보기 위해 Western blotting을 수행했습니다. 여기서 잘 알려진 H2O{15}} 유도제인 CoPP(Cobalt protoporphyrin)를 양성 대조군으로 사용하여 H2O-1를 증가시켰습니다. 16}} 단백질 발현. [30]. 결과는 화합물 3과 4가 H2O{20}}의 발현도 상향 조절한 것으로 나타났습니다(그림 7). 우리는 화합물 3과 4가 Nrf2의 활성화를 조절하는지 여부를 추가로 조사했습니다. Nrf2의 핵으로의 전위는 시간 의존적 방식으로 증가했으며, 이는 화합물 3과 4가 BV2 및 RAW264.7 세포에서 Nrf2/HO{30}} 경로를 유의하게 상향조절했음을 나타냅니다(그림 8).

ffects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 μM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B and D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group. Figure 7. Effects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 µM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B,D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group.

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

화합물 3과 4의 항신경염증 및 항염증 효과가 BV2 및 RAW264.7 세포에서 H2O{4}} 발현과 관련이 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 주석 프로토포르피린-IX(SNPP)로 일련의 실험을 수행했습니다. 이것은 HO-1의 선택적 활성 억제제입니다. 우리는 HO{10}}의 발현을 하향조절할 수 있는 SNPP를 사용하여 HO{11}}가 LPS에 의해 유도된 염증 반응에 대한 위 화합물의 억제 효과를 매개하는지 확인하려고 했습니다[31]. 세포를 50μM SNPP의 유무에 관계없이 2시간 동안 20μM의 화합물 3 및 4로 처리한 후 24시간 동안 LPS로 처리했습니다. 화합물 3과 4는 LPS로 유도된 BV2 및 RAW264.7 세포에서 아질산염 생성을 감소시켰지만, 이들의 항염증 효과는 SNPP 처리에 의해 역전되었습니다(그림 9). SNPP 단독은 LPS 자극 후 산화질소(NO) 생성에 영향을 미치지 않았으며, 이는 화합물 3 및 4의 항염증 효과가 H2O{29}} 발현에 의해 조절됨을 시사합니다.

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Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on nitrite production through the regulation of HO-1 activity in BV2 (A,C,E) and RAW264.7 (B,D,F) cells. The cells were treated with 50 µM of tin protoporphyrin-IX (SnPP) or compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Data are presented as mean ± standard deviation of three independent experiments. ** p < 0.01 and *** p < 0.001

3. 토론

본 연구는 Kuwana T와 sanggenon A가 BV2 및 RAW264.7 세포에서 억제된 LPS 유발 염증을 나타냄을 입증했습니다. 이러한 화합물은 BV2 및 RAW264.7 세포 모두에서 LPS로 유도된 NO, PGE2 및 IL-6 및 TNF-를 포함한 전염증성 사이토카인과 iNOS 및 COX{9}}의 발현을 억제했습니다. 이러한 결과는 Kuwana T와 sanggenon A가 NF-kB 신호 전달 경로를 비활성화하여 항염 효과를 발휘함을 나타냅니다. 또한, 이들 화합물은 Nrf2의 활성화를 통해 HO{15}}의 발현을 유도하였다. 또한 이들 화합물은 Nrf2 활성화를 통해 HO{17}}의 발현을 유도하였으며, 이 효과도 다음과 관련이 있음을 확인하였다. 항염 작용.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), 및 트롬복산 A2(TXA,)[361. 염증 상태에서 iNOS와 COX{2}}의 수치가 증가하여 각각 NO와 PGE2가 과잉 생산되어 염증성 질환을 악화시킵니다[37]. 현재 연구에서 우리는 먼저 LPS로 자극된 BV2 및 RAW264.7 세포에서 NO 생성이 억제되는지 여부를 결정하기 위해 M.alba에서 분리된 11개의 화합물을 평가했습니다. 우리의 결과는 kuwanon T와 sanggenon A가 BV2와 RAW264.7 세포 모두에서 가장 강력한 억제 효과를 나타냄을 보여주었습니다(그림 3). 우리의 이전 연구에서 moracin M은 폐포 대식세포에 항염증 효과가 있었지만 우리의 결과는 다른 것으로 나타났습니다. 무늬. 그러나 각 세포는 특성이 다르기 때문에 동일한 메커니즘에서도 다른 활동이 나타날 수 있습니다 J38]. 따라서 본 논문의 결과와 같이 Moracin M은 처리 농도까지 BV2 및 RAW264.7 세포에서 항염 활성이 없음을 확인하였다. 따라서 추가 실험을 위해 kuwanon T와 sanggenon A를 선택했습니다.

사이토카인은 염증 및 면역 반응에 복잡한 조절 영향을 미칩니다[39]. 대식세포와 미세아교세포의 활성화는 전염증성 사이토카인 J40의 분비를 증가시키며, 이 증가된 분비는 사이토카인의 추가 방출로 이어진다[41]. IL-6은 주요 사이토카인 중 하나이며 염증, 면역 반응 및 조혈을 담당하는 용해성 매개체입니다[42]. IL{6}} 신호전달은 막 결합 IL{8}} 수용체(mblL6R)에 대한 결합과 가용성 IL{10}} 수용체(sIL6R)의 인식을 포함하여 두 가지 다른 메커니즘을 통해 조절됩니다[43]. 두 메커니즘 모두 당단백질(GP)130 활성화와 관련이 있으며, 이는 야누스 키나제(IAK)/신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 키나제, 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K)를 비롯한 다운스트림 신호 분자의 활성화를 초래합니다. ), 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)[44]. IL{18}}은 암, 감염, 자가면역 질환, 췌장 질환 및 심혈관 질환 환자의 염증 수준을 예측하고 평가하는 데 사용됩니다.

또 다른 주요 사이토카인인 TNF-는 또한 면역 세포 증식, 세포 사멸, 괴사 및 생존과 같은 많은 면역 및 염증 과정에서 중요한 역할을 합니다. TNF-의 생물학적 효과는 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor, TNFR)1 및 TNFR2의 두 가지 다른 수용체에 결합함으로써 조절됩니다. TNFR1은 대부분의 세포에서 TNF-활성의 주요 매개체인데, 그 이유는 TNFR2는 TNF-에 대한 결합 친화도가 낮기 때문에 TNF-R1이 TNFR1보다 TNFR2로부터 더 쉽게 해리되기 때문입니다. TNF 신호의 이상과 TNF-의 과잉 생산은 류마티스 관절염, 건선, 크론병, 죽상동맥경화증, 패혈증, 당뇨병 및 비만을 비롯한 많은 질병의 발병으로 이어진다[45,46. 따라서 염증 반응 및 염증성 질환의 발병을 억제 및 예방하기 위해서는 전염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것이 중요하다. 본 연구에서 kuwanon T와 sanggenon A는 BV2 및 RAW264.7 세포 모두에서 LPS로 유도된 IL{17}} 및 TNF- 생성을 억제했습니다.

NF-KB는 가장 보편적인 전사 인자이며[47], NF-kB 신호전달은 iNOS, COX{3}} 및 전염증성 사이토카인을 코딩하는 유전자를 포함하여 염증 반응과 관련된 유전자의 발현에 중요한 역할을 합니다. 48]. 비활성화된 상태에서 NF-kB 서브유닛은 저해제 단백질인 저해제 카파 B(kB)-에 결합된 세포질에 존재합니다. LPS 및 사이토카인을 포함한 여러 자극은 IkB-의 인산화 및 분해를 유도하여 NF-kB 소단위의 핵 내로의 유리 및 전위를 허용합니다. 전위된 소단위는 DNA의 표적 유전자의 kB 부위에 결합하여 염증 유발 매개체를 코딩하는 유전자의 전사를 유도한다[49]. 따라서 NF-kB 경로의 비활성화는 염증성 질환의 치료 표적이 될 수 있다. 본 연구에서 kuwanon T와 sanggenon A 전처리는 NF-kB 소단위체의 DNA 결합 활성과 핵 전위를 억제함으로써 LPS에 의한 NF-kB 신호전달의 활성화를 억제하였다(그림 6). 이러한 결과는 쿠와논 T와 상게논 A의 항염 효과가 NF-kB 신호전달 경로의 조절을 통해 발휘됨을 시사한다.

정상적인 조건에서 Nrf2는 세포질의 Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)에 결합합니다. 그러나 Keapl에서 해리되어 핵으로 전위되고 DNA의 항산화 반응 요소(ARE) 부위에 결합하여 HO-1, NAD(P)H를 암호화하는 유전자를 비롯한 다양한 항산화 유전자의 발현을 유도합니다. : 퀴논 산화환원효소 1(NQO1), 퍼옥시레독신(Prx), 티오레독신(Trx)[50]. 특히, HO-1는 항염증 효과와 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 그 활성은 HO{{12 }} [51]. 본 연구에서는 kuwanon T와 sanggenon A가 Nrf2를 활성화하여 HO{15}} 발현을 유도함을 발견했습니다(그림 7 및 8). 또한 HO{21}} 활성의 선택적 억제제인 ​​SNPP를 사용하여 kuwanon T와 sanggenon A의 항염증 효과와 HO{20}} 발현 사이의 상관관계를 확인했습니다. kuwanon T와 sanggenon A가 NO와 TNF-생산 및 NF-kB 활성화에 대한 억제 효과는 SNPP와의 병용 처리에 의해 부분적으로 역전되었다(그림 9). 이러한 결과는 쿠와논 T와 상게논 A의 항염 효과가 HO{27}} 발현에 의해 조절됨을 시사한다.

effects of cistanche improve immunity (11)

4. 재료 및 방법

4.1. 재료

Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640) 및 태아 소 혈청은 Gibco BRL Co.(Grand Island, NY, USA)에서 구입했습니다. 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 1차 항체인 항-iNOS, 항{4}}액틴, 항-p65 및 항-HO{8}}는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했습니다. Millipore의 항토끼 및 항마우스 2차 항체

(미국 매사추세츠주 빌레리카). PGE, IL{1}} 및 TNF-에 대한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트는 R&DSystems Inc.(Minneapolis, MN, USA)에서 구입했습니다. Morus alba에서 11가지 화합물의 분리 및 구조적 결정은 다른 곳에서 설명되었습니다[19-21].

4.2. 세포 배양 및 생존력 분석

BV2 및 RAW264.7 세포를 1% 항생제(페니실린-스트렙토마이신) 및 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 RPMI 1640에 5 x 105 cells/mL의 밀도로 시딩하였다. 세포는 이전에 기술된 방법에 따라 95% 공기 분위기와 함께 가습된 5% CO에서 37도에서 배양되었습니다[52].

4.3. NO 생산 측정

NO 산화의 안정적인 최종 생성물인 아질산염의 생산은 세포에서 NO 생산의 지표로 측정되었습니다. 간단히 말해서, 조절된 배지에서 아질산염의 농도는 Griess 반응에 기초한 방법을 사용하여 결정되었습니다[53]. 분석의 세부 사항은 이전에 설명되었습니다[54].

4.4. PGE2 Ass4y/

각 샘플의 PGEz 농도는 앞서 설명한 방법에 따라 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 측정되었습니다[55].

4.5.IL-6 및 TNF-a 수준 측정

상업적으로 이용 가능한 키트(BioLegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여 IL{0}} 및 TNF-의 수준을 결정하기 위해 배양 배지를 수집했습니다. 제조자의 지시에 따라 검정을 수행하였다. 간단히 말해서, BV2 및 RAW264.7 세포를 20×10 세포/웰의 밀도로 {{5}웰 배양 플레이트에 접종했습니다. 인큐베이션 후 상층액을 수집하고 ELISA 키트로 IL{8}} 및 TNF-의 농도를 측정하는 데 사용했습니다.

4.6. 웨스턴 블롯 분석

펠렛화된 BV2 및 RAW264.7 세포를 PBS로 세척하고 RIPA 완충액에 용해시켰다. Bio-Rad Laboratories(#5000006; Hercules, CA, USA)에서 얻은 단백질 분석 염료 시약 농축액을 사용하여 동일한 양의 단백질을 정량하고, 샘플 로딩 완충액에 혼합하고, SDS-PAGE를 사용하여 분리했습니다. 그런 다음 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼습니다. 멤브레인에 대한 비특이적 결합은 탈지유 용액에서 배양에 의해 차단되었습니다. 막을 4도에서 1차 항체(모두 1:1000 사용)와 밤새 인큐베이션한 후 양고추냉이 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체(모두 1:5000 사용)(Millipore)와 반응시켰다. 31].

4.7.NF-xB 국소화 및 면역형광 분석

NF-kB의 위치를 ​​연구하기 위해 BV2 및 RAW264.7 세포를 Lab-Tek II 챔버 슬라이드에서 배양하고 1시간 동안 LPS 자극(0.5 ug/mL) 전 2시간 동안 다른 농도의 화합물로 처리했습니다. 시간. 그런 다음 세포를 포르말린에 고정하고 차가운 아세톤으로 투과화하고 항-p65 항체(1:200)로 프로브한 다음 플루오레세인 이소티오시아네이트 표지된 이차 항체(1:1000)(Alexa Fluor 488, Invitrogen)와 함께 인큐베이션했습니다. 핵을 시각화하기 위해 세포를 1ug/mL의 4'{19}}디아미디노{20}}페닐인돌(30분 동안 DAPI, PBS로 5분 동안 세척, 50μL VectaShield(Vector Laboratories, 벌링게임, 캘리포니아, 미국). 염색된 세포를 시각화하고 Zeiss 형광 현미경(Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 획득했습니다. [31].

4.8. 통계 분석

데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 세 그룹 간의 차이를 비교했습니다. GraphPad Prism 소프트웨어(버전 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.

5. 결론

Kuwanon T와 sanggenon A는 NO, PGE2, IL{6}}, TNF-의 생성을 억제하고 iNOS와 COX{8} }. 우리의 결과는 이러한 억제 효과가 kuwanon T와 sanggenon A 처리에 의한 NF-KB 경로의 비활성화를 통해 매개됨을 보여주었습니다. 또한 이러한 화합물은 Nrf2의 핵 내로의 전위를 활성화하여 HO{10}}의 발현을 유도했습니다. . 우리의 연구 결과는 kuwanon T와 sanggenon A에 의해 유도된 HO{12}} 발현이 LPS 유도 염증에 대한 억제 효과와 관련이 있음을 보여주었습니다. 종합하면, 우리의 결과는 M. Albu에서 분리된 Kuwana T와 sanggenon A가 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경염증성 질환의 치료제 및 예방제의 개발 후보가 될 수 있다는 증거를 제공합니다.


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