Haloxylon Ammodendron(Chenopodiaceae)과 초본 뿌리 Holoparasite Cistanche Deserticola(Orobanchaceae) 간의 대규모 mRNA 전달

하이라이트
•할로실론 암모덴드론과 뿌리 기생체 사이에 10,000개의 mRNA 전달Cistanche Deserticola

•RNA 이동성 및 기능 분석은 해바라기-오로반체 쿠마나 시스템에서 수행되었습니다.

•CdNLR1 및 CdNLR2는 뿌리 특정 HR을 유발하고 기생 평형에 영향을 미칩니다.

Cistanche 재배 및 분석

요약
mRNA의 교환은 숙주와 줄기 기생충 사이에서 나타났지만 뿌리 기생충에서는 그렇지 않았습니다.Cistanche Deserticola(Orobanchaceae)은홀로 기생 약초목본 식물 Haloxylon ammodendron(Chenopodiaceae)의 뿌리에 기생한다. 우리는 transcriptome sequencing과 bioinformatic analysis를 사용하여 거의 10,000개의 모바일 mRNA를 식별했습니다. 전사체의 풍부함은 전달 사건의 원동력인 것으로 보이며 mRNA 교환은 haustorial junction을 통해 발생합니다. 선택된 mRNA의 이동성은 in situ 및 해바라기-Orobanche cumana 이종 기생 시스템에서 확인되었습니다. 4C. 데저티콜라→H. ammodendron 모바일 mRNA는 haustorium 개발을 촉진하는 것으로 보입니다. 흥미롭게도 추정 저항성 유전자 CdNLR1 및 CdNLR2의 두 모바일 mRNA는 뿌리 특정 과민 반응을 유발하고 기생 평형에 기여할 수 있는 기생체 발달을 지연시킵니다. 본 연구는 목질 숙주와 뿌리 기생충 사이의 대규모 mRNA 전달 사건에 대한 증거를 제공하고 6가지 기능적 관련성을 입증합니다.C. 데저티콜라숙주-기생충 상호 작용의 유전자.

과목 영역
식물 생물학식물과 유기체의 상호 작용OmicsTranscriptomics
소개
증가하는 증거는 식물의 단거리 및 장거리 통신 모두에서 단백질 및 mRNA와 같은 거대 분자의 중요성을 시사합니다.1 Plasmodesmata는 단거리 수송 채널로 간주되는 반면, 혈관 시스템은 원위 조직 사이에서 장거리 분자 수송을 수행합니다.2 ,3 mRNA는 체관부에서 전달되는 것으로 보고되었습니다.4 최근 연구에 따르면 tRNA 기원의 스템-루프 구조는 mRNA에 장거리 수송 능력을 부여했습니다.5 RNA 엑소좀의 하위 단위인 AtRRP44A는 플라스모데스마타 및 KNOTTED1(KN1) mRNA의 세포 간 트래피킹을 중재합니다.6

기생식물은 현화식물의 약 1%를 차지한다. 기생 식물의 가장 중요한 특징은 기주 식물과 기생 식물 사이의 물리적 및 생리적 연결 채널을 설정하여 대부분의 상호 작용을 지배하는 haustorium이라는 특수 구조입니다.7 기생 식물은 성장을 유지하기 위해 숙주에 의존하고 물을 흡수하고 광합성 산물, 아미노산 및 기타 중간 대사산물과 같은 영양분은 숙주로부터 haustorium을 통해 전달됩니다.8 Haustoria는 또한 초식 동물 신호와 같은 신호 분자를 전달하기 위해 숙주 사이의 연결 다리 역할을 합니다.9 또한 단백질을 포함한 생체 분자와 RNA는 숙주-기생충 연결을 통해 양방향으로 교환됩니다. 숙주와 기생 식물 사이의 RNA 전달의 가장 초기 예는 실새삼을 통해 RNA 바이러스가 감염된 숙주에서 감염되지 않은 식물로 전달되는 것입니다. 숙주-기생충 사이를 이동하여 수용 유기체에서 표적 유전자 발현을 조절합니다.11,12,13 mRNA 전달에 관해서는 숙주 토마토, 호박 및 알팔파에서 Cuscuta chinensis 기생충으로의 이동성 mRNA가 초기에 여러 유전자에 대해 입증되었습니다. test.14 마이크로어레이 분석을 통해 Roney et al. 474개의 mRNA가 토마토에서 실새삼으로 옮겨졌다는 것을 발견했습니다.14 그러나 전달 mRNA의 대규모 식별은 차세대 시퀀싱 기술을 사용해야만 달성되었습니다. Kim et al. 는 기생충 Cuscuta pentagona와 Arabidopsis thaliana 및 토마토와 같은 숙주 사이의 대규모 및 양방향 mRNA 전달을 확인하기 위해 전사체 시퀀싱 기술을 사용했습니다.15 그러나 숙주-기생충 상호 작용에서 전달 mRNA의 기능적 관련성은 명확하지 않았습니다.

오로반치과(Orobanchaceae)는 가장 큰 기생 피자식물 과로서 많은 수가 조건성 또는 의무적 뿌리기생자입니다. C. deserticola는 목본류인 Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae)의 뿌리에 기생하는 전기생체이다.17 엽록체 rpoC2 유전자가 H. ammodendron에서 C. deserticola로 수평 유전자 전달에 의해 전달된 것으로 나타났다.18 여기에서 우리는 차세대 전사체 시퀀싱 및 생물정보학 분석을 통해 C. deserticola와 H. ammodendron 사이의 거의 10,000개의 모바일 mRNA. 모바일 mRNA는 다중 서열 정렬, PCR 검증, 특히 해바라기-Orobanche cumana 기생 시스템의 활용으로 확인되었습니다. 모바일 mRNA의 기능은 또한 이 이종 기생 시스템에 의해 여러 유전자에 대해 입증되었습니다. 현재까지 숙주와 기생충 간의 기능적 mRNA 교환에 대한 보고는 매우 제한적이었습니다. 따라서 우리의 연구는 모바일 mRNA의 관점에서 기생 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

결과
C. deserticola와 H. ammodendron 사이의 이동성 mRNA 식별
숙주 H. ammodendron 뿌리와 기생충 C. deserticola의 긴밀한 물리적 연결로 인해 haustorium에서 분리하는 것이 불가능합니다. 따라서 우리는 고처리량 RNA 시퀀싱(RNA-seq)과 단계적 생물정보학적 분류를 결합하여 숙주와 기생충 사이의 이동성 전사체를 식별했습니다. Illumina HiSeq2500 플랫폼에서 RNA-seq 분석을 위해 4가지 샘플 세트를 수집했습니다. 여기에는 기생충이 없는 숙주인 H. ammodendron(HA)의 뿌리 조직,C. 데저티콜라(CD), 숙주 H. 암모덴드론의 뿌리 조직C. 데저티콜라(HC) 및 하우스토리얼 인터페이스(HI). HC 및 CD 샘플의 경우, 각각의 숙주 뿌리 및 기생충 줄기가 1cm 떨어진 곳에서 수집되었습니다.기생 접합(그림 1A).

그림 1. RNA-seq 분석 및 mobile RNA 확인

(A) RNA-seq 분석을 위한 선택 조직의 그림. CD, haustorial junction 근처의 C. deserticola의 신선한 즙이 많은 줄기; CD에 감염된 H. ammodendron의 뿌리 인 HC; HI, 하우스토리얼 인터페이스. 눈금 막대가 표시됩니다.

(B) 이동 RNA의 서열 조립 및 확인을 위한 전략의 개요. RNA-seq, 차세대 RNA 시퀀싱. ISO-Seq, 전장 전사체 시퀀싱. 기생하지 않은 H. ammodendron의 뿌리인 HA. HA.FL_NR, H. 암모덴드론의 전장 전사체 서열. CD.FL_NR, C. deserticola의 전장 전사체 서열.

(C) ORF 예측 및 조립 결과 추가 확인. ORF 파인더(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)는 ORF 예측에 적용되었으며, (FPKM 0보다 크거나 같음.3 ) 크로스 체크했다. 중첩된 unigene은 Cis 및 HAC unigene에 대해 이중 BLASTN(E 값=1e-10)으로 추가로 필터링되었습니다.

(D) CD, HA 및 HC 샘플 간의 공통 및 상이한 전사 세트를 보여주는 벤 다이어그램.

상호작용하는 유기체로부터 주어진 전사체에 대한 소스 조직의 신뢰할 수 있는 식별은 어려운 문제입니다. 그러므로 Ikeue et al. 숙주와 기생충 전사체를 구별하는 유용한 생물정보학적 방법을 개발했습니다.¹⁹여기에서 우리는 사이의 모바일 mRNA를 식별하는 방법을 기반으로 하는 수정된 생물 정보학 접근 방식을 사용했습니다.C. 데저티콜라 그리고H. 암모덴드론(그림 1B). 총 723,382,940개의 클린 읽기가 위의 라이브러리에서 생성되었으며(표 S2), 이러한 읽기는 다양한 전략을 통해 조립되었습니다(그림 1B). 그 결과, 10개의 샘플 모두가 222,899개의 unigene으로 하이브리드 어셈블링되었다(이하 "결합"이라 함, 표 S3).C. 데저티콜라그리고H. 암모덴드론샘플은 또한 각각 107,752 및 194,720 unigene으로 어셈블링되었습니다(이후 "Cis" 및 "HAC"로 지칭됨, 표 S3). 모든 샘플에 대한 변이와 유사성을 시각화하기 위해 "Combined unigenes"에서 검출된 모든 유전자의 정규화된 FPKM 값에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행했습니다. PCA 플롯은 3개의 생물학적 복제물에 대한 데이터가 밀접하게 클러스터링되고 서로 다른 샘플, 특히H. 암모덴드론그리고C. 데저티콜라(그림 S1). 한편, ORF 예측은 "결합된" 단일 유전자의 149,825개(67.23%)가 추정 단백질을 암호화하는 것으로 가정되었음을 보여주었습니다(그림 1C). 4개의 다른 샘플에서 0.3보다 크거나 같은 FPKM의 발현 임계값을 갖는 개별적으로 조립된 unigene을 ORF 예측 결과와 교차 확인했습니다(표 S4–S6). 이 분석은 4개의 샘플 CD, HC, HA 및 HI의 unigenes의 69.01-75.90%가 추정 ORF를 가지고 있음을 확인했습니다(그림 1C). 전체 길이 트랜스크립톰 시퀀싱이 수행되었고 데이터, CD_FL forC. 데저티콜라및 HA_FLH. 암모덴드론, 두 호스트 모두에 대한 어셈블리 오류 수정에 사용되었습니다.H. 암모덴드론그리고 기생충C. 데저티콜라두 종 모두 게놈 데이터가 부족하기 때문입니다(표 S8–S11). 위의 4개 샘플에서 할당된 unigene이 이중 BLASTN(E 값=1e⁻¹⁰) Cis, HAC, CD_FL 및 HA_FL, 94.78–99.00%에 대해 신뢰할 수 있는 합의 시퀀스가 ​​있었습니다(그림 1C 및 표 S7). 위의 분석을 바탕으로 17,379개(HA 전용 14,810개 및 HA 포함 2,569개)의 공통 unigene이 CD, HC 및 HA의 unigene에 대한 Venn 다이어그램 분석에서 HC 및 CD에서 최종적으로 검색되었습니다(그림 1D). 그 중 앞의 14,810개의 unigene은 HA에 없기 때문에 기생 CD 기원일 가능성이 높지만, 그 중 일부는 HC에만 존재하지만 상향 조절로 인해 HA에는 없는 HC→CD 이동성 mRNA를 나타낼 수도 있습니다. 기생충 부착에. 후자의 2,569개의 unigene은 아마도 HA에도 존재하기 때문에 단방향 HC→CD 전달 mRNA를 나타낼 것입니다. 다른 unigene은 HC와 CD 간에 공유되지 않았기 때문에 후보 이동성 mRNA에서 제외되었습니다. 또한 [HC, CD]의 14,810개의 공통 unigene이 [HA, CD]의 166개의 공통 unigene보다 89배 더 많았다는 점에 유의해야 합니다. 조립 또는 생물정보학적 분석(그림 1D).

추정 이동 mRNA의 기원은 그들의 서열 기원을 지정하기 위해 이중 BLAST 분석을 통해 추가로 확인되었습니다(그림 1B 및 표 S12). 숙주와 기생충 모두에 대한 게놈 데이터가 부족하기 때문에 우리는 Chenopodiaceae 및 Orobanchaceae 과 유기체에 대한 가용한 서열 데이터를 활용했습니다.H. 암모덴드론그리고C. 데저티콜라각각 속합니다. 우리의 가설은 모바일 mRNA가H. 암모덴드론기원은 아마도 Orobanchaceae 종보다 다른 Chenopodiaceae 종의 ortholog와 더 높은 상동성을 가지고 있는 반면,C. 데저티콜라기원이며, 보존된 ortholog는 아마도 Orobanchaceae 및 Chenopodiaceae 모두와 높은 유사성을 가질 것입니다. 이 분석은 상동성 검색을 통해 가족 수준에 할당될 수 있으므로 이동성 mRNA의 기원을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 가설을 증명하기 위해 OrthoFinder를 사용하여 Orobanchaceae 6종과 Chenopodiaceae 4종을 포함한 37종의 계통수를 구축했습니다. Orobanchaceae와 Chenopodiaceae 종 사이의 먼 진화적 거리는 우리 가설의 신뢰성을 확인했습니다(그림 2A 및 표 S13). 유전자 손실 분석은 많은 orthogroup 및 광합성 관련 유전자에 대한 전사가C. 데저티콜라(그림 2B 및 2C, 표 S14, 데이터 S2 및 S3). 또한 벤다이어그램 분석은C. 데저티콜라그리고 다른 3개의 기생 식물도 누락된 오르소그룹의 53.84%(926/1,720)가C. 데저티콜라50.81%(755/1486), 48.09%(377/784) 및 50.00%(260/520)의C. 오스트레일리아, 스트리가 아시아티카그리고Phtheirospermum 자포니쿰각각 (그림 S2). 이러한 결과는 이 종의 기생 특성뿐만 아니라 우리의 분석에서 단일 유전자 어셈블리의 신뢰성을 나타냈으며, 서열 기원 확인을 위해 상대적인 식물 종을 사용한다는 우리의 가설을 뒷받침했습니다. 따라서 위의 분석에서 후보 전달 unigenes는 이중 BLASTN(E 값=1e⁻¹⁰) Orobanchaceae(의 전사체Triphysaria versicolor, Striga hermonthica 및 Phelipanche aegyptiaca; NCBI의 EST 및 mRNA 서열) 및 Chenopodiaceae(차세대 및 전장 전사체H. 암모덴드론; NCBI의 EST 및 mRNA 서열)(그림 1B 및 표 S12). 그 결과 7,496개의 unigene이 기생충에서 유래한 것으로 확인되었다.C. 데저티콜라, 대상 HC 샘플 및 원본 CD에서 각각 9.66%(7,496/77,615) 및 13.70%(7,496/54,721)를 차지하는 unigene; 2,370개의 unigene이 숙주에 할당되었습니다.H. 암모덴드론, 소스 HC 및 대상 CD 샘플에서 각각 unigene의 3.38%(2,370/70,119) 및 4.15%(2,370/57,091)를 차지합니다(그림 2D 및 2E, 표 S7, S12 및 S15). 일반적인 2,931개의 unigene은 너무 상동적이어서 정확한 출처 유기체에 할당할 수 없었습니다. 이러한 결과는 거의 10,000개(7,496 + 2,370 = 9,866)의 단일 유전자가 뿌리 기생 식물 사이에서 이동할 수 있음을 나타냅니다.C. 데저티콜라목본 식물 숙주H. 암모덴드론. 훨씬 더 많은(7,496/2,370 = 3.16-접힘) 모바일 RNA는 기생충이었습니다.C. 데저티콜라숙주보다 기원H. 암모덴드론기생충 → 숙주 방향으로 mRNA 전달 편향을 보여주는 기원.

그림 2. 다중 정렬을 통한 유전자 손실 분석 및 이동 RNA 추가 확인

(A) 꽃 피는 식물 게놈의 계통 발생. OrthoFinder를 이용하여 37종의 모든 단백질 염기서열의 진화를 분석하고 종간 직접상동유전자와 부수상동유전자를 포함하는 직교군을 찾았다.

(B) 잃어버린 orthogroup의 백분율. 반기생 식물 및 전체 기생 식물의 직교군 결실 수.

(C) 잃어버린 unigenes의 백분율. 광합성 및 대사와 관련된 유전자의 비율을 나타내었다.

(D) 다중 정렬에서 CD 및 HC 샘플 간의 공통 및 상이한 전사 세트를 보여주는 벤 다이어그램. CD_트랜스, CD→HC 모바일 RNA. HC_트랜스, HC→CD 모바일 RNA.

(E) 원형 차트는 CD(외부 원) 및 HC(내부 원) 전사체에 매핑된 모바일 읽기의 비율을 보여줍니다.