Lipidomics는 급성 신장 손상 동안 시스플라틴으로 유도된 신장 지질 변화와 실라스타틴에 의한 감쇠를 보여줍니다
Feb 21, 2022
추상적인: 신독성은 시스플라틴 기반 화학요법의 주요 합병증으로 급성신장 손상캘리포니아에서 환자의 30%, 임상에 사용할 수 있는 예방적 개입이나 치료가 없습니다. 실라스타틴은 최근 임상 시험에 들어서면서 시험관 내 및 생체 내 모델에서 시스플라틴 요법에 대해 신장 보호 효과를 발휘하는 것으로 입증되었습니다. 시스플라틴으로 유도된 분자 수준의 더 깊은 이해신장 손상잠재적인 보호제의 효과는 성공적인 신장 보호 요법을 개발하고 다음의 새로운 바이오마커를 확립하는 열쇠가 될 수 있습니다.신장 손상그리고신장 보호. LC-MS/MS를 사용한 표적 지질학 접근법은신장시스플라틴 및/또는 실라스타틴으로 처리된 쥐의 피질 및 수질 추출물. 시스플라틴 처리 후 피질과 수질에서 각각 최대 56개 및 63개의 지질 종이 변경된 것으로 밝혀졌습니다. 실라스타틴과의 병용 치료는 대조군 수준과 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 이러한 지질 변화의 많은 부분을 약화시켰습니다. 다변량 분석은 지질 종을 구별하는 데 사용할 수 있음을 보여주었습니다.신장 손상그리고신장 보호, 콜레스테롤 에스테르가 황산염 및 인지질과 함께 가장 구별되는 종입니다. 시스플라틴 유도의 잠재적 진단 바이오마커 신장 손상및 실라스타틴신장 보호도 발견되었습니다.
키워드:지질학; 시스플라틴; 급성 신장 손상; 실라스타틴; 신보호; 바이오마커; 콜레스테롤 에스테르; 스핑고지질; 인지질; 화학 요법
소개 신독성은 시스플라틴 화학요법의 심각한 부작용으로[1], 급성신장 손상(AKI)는 ca. 치료받은 환자의 30%[2]. 이것은 또한 고형암에 대한 가장 적절한 치료법 중 하나인 시스플라틴 기반 치료법의 주요 용량 제한 요인이자 중요한 단점이기도 합니다[2]. 시스플라틴이 축적되어 손상을 유발합니다.신장근위세뇨관 상피세포(RPTECs), 손상은 특히 근위세뇨관의 분절 S3에 위치하며,신장피질 수질 접합부와 외부 수질쪽으로 피질 [3]. 그러나 골수 Henle 루프에 대한 직접적인 손상도 제안되었습니다[4,5]. 관련하여 일련의 세포 이벤트가 발생합니다.신장산화 스트레스, 질산화 스트레스, 혈관 손상, 염증, 미토콘드리아 손상 또는 세포막의 Na + , K + - ATPase 억제 및 소포체 스트레스를 포함한 시스플라틴 섭취 후 세관 세포 손상, 주로 다음과 같은 근위 세뇨관 세포 사멸 세포자멸사(내인성 및 외인성 경로 모두 포함) 또는 괴사,신장 기능[2,6,7]. 이는 혈액 요소 질소(BUN) 및 혈청 크레아티닌 증가와 함께 사구체 여과율(GFR) 및 혈청 마그네슘 및 칼륨 수준의 감소로 나타납니다[2].
에 대한 다양한 접근 방식이 연구되었습니다.신장 보호여러 분자 표적을 기반으로 하는 시험관 내 및 생체 내 시스플라틴 치료 중 [7-9]. 그러나 종양 세포에 대한 시스플라틴의 세포독성 효과의 교란 가능성과 종종 불완전한 보호 효과로 인해 renoprotectors의 개발이 제한되었습니다[9]. 그 결과 시스플라틴으로 유발된 AKI를 성공적으로 예방하거나 치료할 수 있는 임상적 중재가 없다[7]. 시스플라틴 유발 AKI 및 잠재적 표적과 관련된 분자 경로에 대한 더 깊은 이해신장 보호그런 점에서 중요해 보인다.
실라스타틴은 효과적으로 보호하는 것으로 입증되었습니다.신장시스플라틴[10,11], 겐타마이신[12], 반코마이신[13], 사이클로스포린 A, 타크로리무스[14]를 포함한 여러 약제로 인한 손상은 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에서 발생합니다. Cilastatin은 선택적으로 억제하여 보호 효과를 발휘합니다.신장RPTEC의 브러시 경계에 있는 지질 뗏목에 위치한 dehydropeptidase I(DHP-I) [11]. 그 결과, Fas-매개 외인성 세포사멸과 같은 막 외부화를 포함하는 과정은 cilastatin에 의해 손상되고,신장 손상독성 모욕이 구금된 후 [11]. cilastatin에 의한 외인성 아폽토시스 손상을 제외하고, 산화 스트레스, 염증 및 신독성 화합물의 축적이 모두 감소되는 것으로 밝혀졌다[10-13,15,16]. 따라서,신장 기능시스플라틴과 실라스타틴을 함께 치료하면 보존됩니다[11]. 최근 실라스타틴은 신장보호제로서 임상 1상을 성공적으로 완료했고 2상 시험에 돌입할 예정이다. 최근 유망한 연구에 따르면 cilastatin(imipenem과 cilastatin을 함께 투여)이 온열 복강 내 시스플라틴 치료 중 복막 암종증 환자에서 신장 보호 효과를 얻을 수 있음이 밝혀졌습니다[17].
최근 몇 년 동안 omics 기술, 특히 proteomics[18,19]와 metabolomics[20-23]는 혈청 내 BUN 또는 creatinine을 제외하고 AKI의 새로운 조기 진단 바이오마커의 발견에 유용한 것으로 입증되었습니다[18,20]. 또한 대사체학 분석은 시스플라틴의 신독성 기전[5,24]과 잠재적인 신보호제의 치료 효과[25-27]를 이해하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.
특히, lipidomics는 또한 관련 정보를 제공할 수 있습니다.신장병지질은 주요 구조적, 세포 신호 전달 및 대사 역할을 나타내며, 지질은 다음 조건 하에서 세포, 조직 및 생체 유체에서 변경될 수 있음을 고려합니다.신장병리학 적 상태 [29,30]. 이와 관련하여 트리글리세리드 및 비에스테르화 지방산의 수준이 증가된 것으로 나타났습니다.신장시스플라틴 치료 중 [31], 탈 중성 지질 [32]. 세라마이드(Cer) 및 헥소실 세라마이드(HexCer)와 같은 스핑고지질의 수치가 상승한 것도 관찰되었습니다.신장시스플라틴 유도 AKI 동안 피질 [33]. 한편, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 리소포스파티딜콜린(LPC) 종을 포함한 인지질 종도신장 조직또는 시스플라틴 치료 중 세포[26]. 시스플라틴 투여 후 쥐의 혈청에서 다양한 LPC 종의 수준이 변경된 것으로 나타났습니다[23]. 또한, 질량 분석법 이미징 비표적화 반정량적 접근을 통해 쥐의 지질 분포를 비교할 수 있었습니다.신장섹션 및 제안된 시스 플라틴은 다양한 인지질(PC, PE, 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜세린(PS), 포스파티드산(PA)), 설파타이드(설프) 또는 카디오리핀)에 대한 변경을 초래했다고 제안했습니다. (피질과 수질에서 다른 행동을 보임), 실라스타틴과의 병용 치료는 이러한 변화의 일부를 약화시키는 경향이 있었습니다[4].
이 작업에서 우리는 한 단계 더 나아가서 중요한 구조적 지질을 자세히 살펴보았습니다.신장인지질(PC, LPC 및 PE), 스핑고지질(Sulf, 스핑고미엘린(SM), 디하이드로스핑고미엘린(dhSM), Cer, 디하이드로세라마이드(dhCer), HexCer, 디하이드로헥소실세라마이드(dhHexCer)) 및 유리 콜레스테롤(if) 형태(콜레스테롤 에스테르(CE)), 새로운 지질 클래스 및 종을 다루며 탠덤 질량 분석(LC-MS/MS) 분석과 결합된 액체 크로마토그래피를 기반으로 하는 보다 안정적인 표적 정량 접근 방식을 사용합니다. 총 108개의 지질 종을 모두 정량화했습니다.신장시스플라틴의 신독성 효과와 실라스타틴의 신보호 효과를 더 잘 이해하기 위해 처리된 쥐의 피질과 수질 추출물. AKI 관련 시스플라틴이 시스플라틴에 미치는 영향에 대한 새로운 정보신장지질 종을 얻었고 cilastatin의 보호 효과에 대한 추가 통찰력을 얻었습니다.신장피질 또는 수질. 시스플라틴 유도의 다양한 잠재적 바이오마커신장 손상그리고신장 보호cilastatin과 함께 발견되었습니다.
결과
시스플라틴에 의한 신장 손상에 대한 실라스타틴 보호 효과
평가신장 기능시스플라틴 및/또는 실라스타틴 처리된 쥐에서 혈청 및 소변에서 여러 생화학적 지표를 사용하여 먼저 수행되었습니다. Table 1에서 보는 바와 같이 혈청 크레아티닌, BUN, 요단백, 요량, 나트륨과 칼륨의 분획배설량은 대조군에 비해 시스플라틴 투여군에 비해 유의하게 증가하였고, 실라스타틴과 시스플라틴 병용투여군은 대조군에 비해 감소하였다. 제어 수준. 반면에 cisplatin을 처리한 쥐에서 대조군에 비해 GFR이 감소한 반면, cilastatin을 함께 투여하면 이 효과가 감소했습니다. 이 결과는 확인신장 손상cisplatin에 의해 유도되고 cilastatin에 의해 보호됩니다. 실라스타틴 단독으로는 효과가 없었다.신장 기능매개변수.
조직병리학적 분석은 또한 헤마톡실린/에오신 염색 섹션에서 수행되어 다음과 관련된 형태학적 변화를 연구했습니다.신장 손상. 그림 1은 시스플라틴이 유도한 근위부 손상 징후를 보여줍니다.신장세관 팽창, 세포 파편 분리 또는 브러시 테두리 막의 손실을 포함한 세관(그림 1C,G,I). 단백질 캐스트의 축적은 또한 피질과 수질 세뇨관에서 관찰되었습니다(각각 그림 1C,G). 이것은 피질(각각 그림 1A,B) 및 수질(각각 그림 1E,F)의 대조군 또는 실라스타틴 그룹에서 관찰된 정상적인 형태와 대조적입니다. 시스플라틴과 함께 실라스타틴을 공동 치료하면 피질과 수질에서 이러한 모든 시스플라틴 유도 변경이 명확하게 감소했습니다(그림 1D,H,J).
피질 및 수질에서 전체 신장 지질 클래스의 시스플라틴 변경. 실라스타틴의 보호 효과
스테롤(CE, FC), 인지질(LPC, PC, PE) 및 스핑고지질(Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM)을 포함한 다양한 지질 클래스의 총 수준은신장AKI 동안 지질에 대한 시스플라틴의 전체적인 효과를 평가하기 위해 피질과 수질을 조사했습니다. 지질 분석에 대한 완전한 결과는 표 S1에 나와 있습니다. 그림 2A,B에서 볼 수 있듯이 모든 그룹의 피질과 수질에서 매우 유사한 경향이 관찰되었습니다. CE와 Cer은 대조군에 비해 cisplatin 치료 중 피질과 수질 모두에서 유의하게 증가된 반면 SM, dhSM, PE는 감소하였다. 이 중 Cer와 CE는 관찰된 가장 두드러진 시스플라틴 유도 변화를 겪는다. 또한, cisplatin 처리 중 dhCer와 HexCer는 수질에서 유의하게 증가된 반면, 피질에서는 dhHexCer가 증가하였고 LPC와 Sulf는 감소하였다.
그림 1. 헤마톡실린/에오신 염색의 조직병리학적 분석신장섹션은 시스플라틴 유발 손상에 대한 실라스타틴 보호를 보여줍니다. 이미지는 (A) 대조 피질에 대한 20배 확대로 표시됩니다. (B) 실라스타틴 피질; (C) 시스플라틴 피질; (D) 시스플라틴 + 실라스타틴 피질; (E) 대조군 수질; (F) 실라스타틴 수질; (G) 시스플라틴 수질; 및 (H) 시스플라틴 + 실라스타틴 수질. A에서 H까지의 눈금 막대는 100 μm를 나타냅니다. 의 상세 이미지신장(I) 시스플라틴 및 (J) 시스플라틴 + 실라스타틴에 대해 60배 배율의 세관이 표시됩니다. I 및 J의 스케일 바는 25 μm를 나타냅니다.신장손상 지표는 다음과 같이 표시됩니다. →: 단백질 캐스트의 축적신장세뇨관. & 부위: 세뇨관 부종. *: 브러시 테두리 멤브레인의 손실. #: 세포 파편 분리.
실라스타틴과 시스플라틴의 병용 투여는 이러한 시스플라틴 유도 지질 변화의 일부를 약화시키는 경향이 있어 피질의 Cer 및 dhHexCer 수준 또는 dhCer, HexCer, SM, dhSM 및 PE의 경우 대조군과 차이가 없었습니다. 수질의 수준. 또한, 피질에서 시스플라틴으로 유도된 CE 증가의 경우, 시스플라틴과 시스플라틴을 병용 투여한 실라스타틴은 비록 코이아트롤 그룹에 비해 회복이 부분적이었지만 시스플라틴 그룹에 비해 수치를 유의하게 감소시켰습니다. 시스플라틴에 의해 변경된 나머지 지질 부류는 치료 기간 동안 회복되지 않은 채로 남아 있었습니다. 한편, cilastatin 자체는 피질의 LPC와 dhCer를 제외하고는 피질과 수질에 영향을 미치지 않았으며, 대조군에 비해 각각 감소 및 증가된 것으로 보였다. FC, PC 및 dhHexCer의 총 수치는 cisplatin 치료 후 피질과 수질에서 유의한 변화를 보이지 않았습니다.
그림 2C,D는 유사한 경향을 제공하는 각각 피질 및 수질의 지질 클래스에 대한 상관 히트맵을 표시합니다.
Cisplatin 치료에 의한 개별 신장 지질 종 제거. 실라스타틴 감쇠 효과
콜레스테롤 에스테르5개의 개별 CE 종(CE 18:1, CE 18:2, CE 18:{5}}, CE 20:4 및 CE 22:6)에 대한 분석신장피질과 수질은 시스플라틴이 대조군에 비해 각각을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 3). 다른 한편으로, cilastatin과 cisplatin의 동시 투여는 cisplatin 치료와 관련하여 개별 CE 종의 수준에서 일반적인 감소를 가져왔으며, 이는 다음과 같이 피질의 모든 CE 종 및 수질의 CE 18:2에 대해 통계적으로 유의했습니다. 그림 3에서 볼 수 있습니다. 실라스타틴 공동 투여로 인한 피질 CE 종의 이러한 회복은 대조군 수준과 비교하여 부분적이었지만, 대부분의 메델라 CE 종(CE 18:2 제외)에서 통계적으로 유의한 회복은 실라스타틴 공동 투여에 대해 관찰되지 않았습니다. 시스플라틴에 비해 피질 및 수질 지질 종에 대한 완전한 통계 분석 결과는 각각 표 S2 및 S3에 나와 있습니다.
스핑고지질: Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM 및 Sulf총 43개의 스핑고리피드 종을 정량화했습니다.신장피질과 수질은 그림 4에 표시된 대로 시스플라틴과 실라스타틴 치료가 해당 수준에 미치는 영향을 평가합니다. Cer(그림 4A), dhCer(그림 4B), HexCer(그림 4C) 및 dhHexCer(그림 4D) 종 시스플라틴 처리로 인해 4개 클래스에서 19종이 크게 증가했음을 알 수 있습니다.신장피질과 수질. 다시 말하지만, 시스플라틴과 실라스타틴의 동시 치료는 피질과 수질에서 시스플라틴으로 변경된 지질 수준의 일반적인 감소와 함께 시스플라틴의 효과를 약화시키는 경향을 보여줍니다. 사실, dhCer(그림 4B) 및 dhHexCer(그림 4D) 종의 경우, 시스플라틴과 실라스타틴 처리 그룹과 시스플라틴 변경 종에 대한 대조군 그라우트 간에 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 완전한 회복을 나타냅니다. Cer(그림 4A) 및 HexCer(그림 4C)의 경우 이 recoeery는 HexCer 34:1(피질 및 수질) 및 HexCer 38:1 및 HexCer 42:1(수질 ); 피질에 Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1, Cer 42:2; 그리고 수질에서 Cer 34:1 및 Cer 42:2, 완전히 또는 부분적으로 회복됨. 반대로, 시스플라틴과 실라스타틴 치료는 수질에서 Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 및 HexCer 36:1에 대해 대조군과 관련하여 여전히 유의한 차이를 보여 회복이 없었습니다. Cer 및 HexCer에 대한 수질에서보다 피질에서 실라스타틴이 발휘하는 훨씬 더 나은 회복 효과.
SM(그림 4E) 및 dhSMt(그림 4F) 종의 경우, 시스플라틴은 SM 34:1, dhSM 34에 대해 통계적으로 유의한 가장 짧은 사슬 종과 가장 긴 사슬 종에 대해 피질과 수질을 감소시켰습니다.{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 및 dhSM 42:1. 대조적으로, 피질과 수질에서 중간 사슬 SM 및 dhSM 종에 대한 시스플라틴 치료에 대해 관찰된 효과는 증가였으며, 이는 dhSM 36:{13}}(피질 및 수질 모두에서) 및 dhSM 4{{ 15}}:{36}}, SM 36:1, SM 38:1 및 SM 40:1 수질에서. 시스플라틴과 실라스타틴의 동시 투여는 SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 및 dhSM 42:1은 수질에서 대조군과 차이가 없음을 보여줍니다. 마지막으로, 일부 Sulf 종도 시스플라틴 처리에 의해 변경되었습니다.신장그림 4G와 같이 피질과 수질. Sulf 4{14}}:1은 시스플라틴 처리 후 피질과 수질 모두에서 유의하게 증가된 것으로 밝혀졌지만, Sulf-OH 40:1 또는 장쇄 Sulf-OH 42:2, Sulf-OH와 같은 다른 종 42:2는 피질에서 감소되었으며, Sulf 42:0 및 Sulf-OH 42:1도 피질과 수질 모두에서 감소했습니다. 시스플라틴과 함께 투여된 실라스타틴은 특히 Sulf 40:1(피질 및 수질) 및 Sulf 40:2 및 Sulf-OH 42:1(수질)에 대해 다시 약한 회복 효과를 나타내어 대조군과 비교하여 차이를 보이지 않았습니다.
인지질: PC, PE 및 LPC60종의 인지질 종(28 PC, 20 PE 및 12 LPC)의 정량화를 수행했습니다.신장잠재적인 시스플라틴 유발 변화 및 실라스타틴 재생 보호 효과의 평가를 위한 피질 및 수질. PC 종의 결과는 각각 그림 5A,B에 나와 있습니다. 보시다시피, 시스플라틴은 피질 또는 수질에서 최대 19개의 PC 종을 크게 변경했습니다. 피질에서 증가된 PC 40:2, PC 40:4, PC 34:2를 제외하고 대부분의 PC 종은 cisplatin에 의해 감소되었습니다. 고도로 불포화된 PC 종의 분율은 수질과 피질 모두에서 유의하게 감소한 반면, 2개의 이중 결합을 포함하는 종의 분율은 그림 5C,D에서 볼 수 있듯이 크게 증가했습니다. 시스플라틴과 실라스트 아틴을 모두 사용한 치료는 이전에 관찰된 것과 유사한 효과를 나타냈으며 일부 약화 효과가 관찰되었으며 일부 경우에는 PC 수준의 완전한 회복으로 이어지며 대조군과의 유의미한 차이가 없거나 부분 회복이 나타났습니다. 이 회복은 주로 피질과 수질에서 PE 종 결정에 대한 결과에서 관찰되었으며 각각 그림 6A,B에 나와 있습니다. 총 16종의 PE 종은 피질 또는 수질에서 시스플라틴에 의해 유의하게 변경되었으며, 수질에서 가장 많은 수의 변경된 종을 발견했습니다. 대부분의 경우에서 PE 종은 시스플라틴 처리에 의해 감소되었으며, PE 38:2, PE 40:6 및 PE 40:4를 제외하고는 피질, 수질 또는 피질과 수질 모두에서 증가하였고, 각기. 따라서, 수질 내 PE 종의 지방산 사슬의 총 길이를 고려할 때, 도 6C에 도시된 바와 같이 34, 36 및 38 C의 PE의 총량은 시스플라틴으로 유의하게 감소한 반면, 40 C의 종은 증가하였다 . 시스플라틴과 실라스타틴의 동시 치료는 수질에서 발견되는 개별 PE 종의 시스플라틴 유도 변화의 대부분을 약화시켰으며, 수질에서 15개 중 11개의 시스플라틴 변형 종에서 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없는 수준을 제공했으며 2개 이상의 PE 종을 포함합니다. 부분적으로 회복되었습니다. 그러나 피질에서는 시스플라틴이 변경된 11종 중 2종만이 킬라스타틴으로 회복되어 수준을 조절했으며 2종의 추가 PE 종은 부분적으로 회복되었습니다. PC 종에 대한 관찰과 유사하게, 고도 불포화 PE 종의 분율은 수질에서 유의하게 감소한 반면, 1-3 이중 결합을 포함하는 종의 분율은 그림 6D에 표시된 것처럼 크게 증가했습니다.
LPC 종 분석과 관련하여 관찰된 대부분의 시스플라틴 유도 변화는신장피질, 여기서 LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0 , LPC 20:3, LPC 22:6 및 LPC 22:5는 그림 7A에서 볼 수 있는 것처럼 대조군 샘플과 관련하여. 한편, LPC 17:1 및 LPC 18:2는 시스플라틴 처리 동안 수질에서 증가된 것으로 밝혀졌다(도 7B). 시스플라틴과 실라스타틴을 함께 처리한 경우 피질 LPC 종에 대한 회복 효과가 없었습니다. 반대로 LPC 17:1 및 LPC 18:2는 대조군과 비교하여 유의한 차이 없이 수질에서 회수되었습니다.
분류 변수로서의 신장 지질신장 손상및 보호
피질과 수질에서 측정된 모든 지질 변수를 사용하여 다변수 분석을 수행하여 이러한 종이 그룹 분류 및 시스플라틴 유도 식별에 도움이 될 수 있는지 평가했습니다.신장 손상그리고신장 보호실라스타틴에 의해 주성분 분석(PCA) 및 잠재 구조 식별 분석(OPLS-DA)에 대한 직교 투영은 그림 8에 표시된 대로 피질 또는 수질 지질을 별도로 사용하여 수행되었습니다. 피질(그림 8A) 및 수질(그림 8B)의 PCA 분석 제공된 지질은 대조군 및 실라스타틴 그룹과 관련하여 시스플라틴 그룹의 명확한 분리를 보여주는 기능을 제공하는 모델로, 후자의 두 그룹은 밀접하게 클러스터링되어 있습니다. 반면, cisplatin + cilastatin 처리군은 cisplatin군과 분리되는 경향이 있었고 대조군과 cisplatin군 사이에 위치하여 군간 차이를 시사하였다. 모든 PCA 모델은 0.7보다 높은 R2와 0.5보다 높은 Q2 값을 나타냈습니다.
다중 그룹 OPLS-DA 분석은 또한 피질(그림 8C) 또는 수질(그림 8D) 지질 변수를 사용하여 서로 다른 그룹의 명확하게 분리된 클러스터링을 보여주었습니다. OPLS-DA 모델은 허용 가능한 Q2 값과 0.7보다 높은 R2 값을 제시했으며 그림 8E,F와 같이 100회 반복에 대한 순열 테스트 중에 유효한 것으로 입증되었습니다. 1보다 높은 투영(VIP) 점수에서 변수 중요도가 있는 기능은 그룹의 분리에 더 높은 영향을 미치는 피질 또는 수질 지질을 각각 나타내는 그림 8G,H에서 찾을 수 있습니다. 이들은 CE, 스핑고지질 및 인지질 부류의 다양한 지질 종으로 구성되었습니다. 시스플라틴 치료와 관련된 개별 그룹 간의 특정 지질 차이를 확인하기 위해신장 보호, 추가 OPLS-DA 분석은 각각 도 9 및 10에서 볼 수 있는 바와 같이 피질 및 수질 지질로 별도로 수행되었습니다. OPLS-DA 모델은 대조군과 비교한 시스플라틴, 시스플라틴과 비교한 시스플라틴 + 실라스타틴, 대조군과 비교한 시스플라틴 + 실라스타틴에 대해 구축되었습니다. 가장 차별적인 OPLS-DA 모델은 100주기의 순열 테스트 결과를 기반으로 적절한 검증을 통해 가장 높은 R2 및 Q2 값을 고려하여 대조군과 시스플라틴 또는 시스플라틴 + 실라스타틴 치료 그룹 사이의 모델이었습니다(그림 9A,B,D, E 및 그림 10A,B,D,E).
한편, 피질(그림 9C) 또는 수질(그림 1{12}}C) 지질을 사용하는 시스플라틴과 실라스타틴 및 시스플라틴 그룹에 대한 OPLS-DA 모델도 합리적인 R2 및 Q2 값으로 그룹 구별을 허용했습니다. 및 100-주기 순열 테스트(그림 9F 및 10F)의 적절한 검증 결과, 수질 지질이 더 나은 예측 가능성을 나타내는 것입니다. 다양한 OPLS-DA 모델에 대한 S-플롯은 피질 또는 수질 지질 기능에 대해 그림 9G, H, I 및 그림 10G, H, I에 포함되어 있습니다. |p(corr)| 0.5보다 높고 VIP 점수가 1보다 높으면 S-플롯에서 그룹 차별에 가장 관련성이 높은 기능으로 표시되었습니다. 각 지질 종에 대한 단변량 통계와 함께 OPLS-DA 모델의 p(corr) 및 VIP 값을 포함한 완전한 데이터는 보충 표 S2(피질 지질) 및 S3(수질 지질)에서 찾을 수 있습니다. 그것은 분명한 것 같다신장피질 및 수질 지질은 시스플라틴 유도에 대한 구별 기준으로 작용할 수 있습니다.신장 손상그리고 실라스타틴신장 보호시스플라틴 치료 중
시스플라틴 유발 신장 손상의 잠재적 바이오마커로서의 신장 지질 신장 손상의 잠재적 지질 바이오마커를 선택하기 위해
시스플라틴에 의해 유발된 시스플라틴 대 대조군의 단변량 분석에서 통계적으로 유의한 p-값의 다중 기준 조합뿐만 아니라 해당 OPLS-DA 모델에서 발견된 p(corr) 및 VIP 값이 사용되었습니다. p-값이 < 0인="" 선택된="" 지질.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(수정)|=""> 0.5 및 VIP > 1은 표 2(피질 지질) 및 표 3(수질 지질)에서 찾을 수 있으며, 여기서 수신기 작동 특성(ROC) 곡선에 대한 배수 변화(FC) 및 곡선 아래 면적(AUC)도 포함됩니다.
알 수 있는 바와 같이, CE, 스핑고지질 및 인지질 종을 포함하는 수질로부터의 최대 40 지질 및 피질로부터의 최대 27개의 지질이 각각 표 2 및 3에서 선택됩니다. 각 지질에 대해 얻은 ROC 곡선에 대한 AUC 값은 0.85보다 높았고 대부분의 경우 1에 가까웠으며, 이는 시스플라틴과 대조군 사이의 종의 우수한 구별 능력을 나타냅니다. 놀랍게도, 시스플라틴이 증가된 CE 종(CE 18:1, CE 18:2, CE 18:{19}}, CE 20:4 및 CE 22:6)이 가장 구별되는 것으로 보입니다. 수질과 피질 모두에서 가장 높은 FC, VIP, p(corr) 및 AUC 값을 보여줍니다. dhHexCer 34:0은 높은 FC 및 관련 점수를 가진 피질의 또 다른 증가된 지질입니다. 반면에 Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1 또는 Sulf-OH 42:1과 같은 황산염도 피질과 상당히 관련이 있는 반면 PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 PC 36:5 또는 PC 36:6도 수질에서 매우 중요하며 시스플라틴 치료 중에 모두 감소합니다.
실라스타틴 신장 보호의 잠재적 바이오마커로서의 신장 지질
시스플라틴 신장 독성에 대한 실라스타틴 보호의 잠재적 지질 바이오마커를 선택하기 위해 섹션 2.5에서와 동일한 다중 기준 접근법이 시스플라틴 그룹에 대한 시스플라틴 + 실라스타틴 대 시스플라틴 그룹의 단변량 분석을 사용하여 적용되었으며 해당 OPLS-에서 발견된 p(corr) 및 VIP 값 DA 모델. p-값이 < 0인="" 선택된="" 지질.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(수정)|=""> 0.5 및 VIP > 1은 표 4(피질 지질) 및 표 5(수질 지질)에서 찾을 수 있으며, 여기서 ROC 곡선에 대한 FC 및 AUC도 계산되었습니다.
표 4에서 볼 수 있듯이 모든 CE 종(CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 및 CE 22:6)은 피질은 cilastatin에 의해 발휘되는 보호의 가장 강력한 지표로 간주될 수 있으며, 동시에 cisplatin에 의해 유도된 변경을 상당히 감소시킵니다. 피질의 PE 36:5 및 dhHexCer 34:{33}}는 또한 실라스타틴 보호의 중요한 잠재적 바이오마커이며, 특히 후자는 대조군 수준으로의 실라스타틴으로 인해 완전히 회복됩니다. 수질 지질과 관련하여 표 5에 나타낸 바와 같이 피질에서보다 실라스타틴 보호의 잠재적인 바이오마커의 양이 더 많이 발견되었습니다. 특히, Sulf 40:2는 가장 높은 FC 및 VIP 점수를 고려할 때 수질에서 가장 구별되는 종인 것 같습니다. Cer 외에도 PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3, PC 36:6 등 다양한 PC 및 PE 종도 발견되었습니다. 42:2, dhHexCer 36:0 및 HexCer 34:1은 수질에서 실라스타틴 보호의 중요한 바이오마커입니다. 모든 경우에, 이들 지질은 시스플라틴에 의한 변경된 수준과 비교하여 대조군 수준의 부분적 또는 전체적 실라스타틴 유도 회복과 관련이 있었습니다. 모든 종에 대해 얻은 ROC 곡선에 대한 AUC 값은 0.85보다 높아서 우수한 식별 능력을 입증했습니다.
논의이 연구에서 우리는 인지질, 스핑고지질, 콜레스테롤과 같은 중요한 구조적 지질과 에스테르화된 형태를 포함하는 총 108종의 지질 종을 정량화했습니다.신장시스플라틴 및/또는 실라스타틴으로 처리된 쥐의 피질 및 수질. 이것은 시스플라틴의 신독성 효과와 실라스타틴의 보호 효과를 더 잘 이해하기 위해 수행되었습니다. 시스플라틴 처리에 의해 수질에서 최대 63종의 지질이 유의하게 변경된 것으로 밝혀진 반면, 56종의 지질 종은 피질에서 영향을 받아신장 손상두 지역 모두에서. 전통적으로 대부분의 시스플라틴 유발 AKI 연구는 근위 세뇨관 세포에 초점을 맞추고신장약물 축적이 주로 집중되는 피질 손상에 대한 최근 연구는 TUNEL 세포 사멸 분석에 기초하여 수질의 손상이 피질만큼 심각할 수 있다는 사실을 지적합니다[5]. 이것은 Henle's loop[4]의 잠재적인 직접 및 이차적 손상을 제외하고 외측 수질을 향해 하강하는 근위 세뇨관의 분절 S3에 시스플라틴이 축적되는 것과 관련이 있을 수 있습니다[3,5]. 또한 수질은 가장 민감한 것으로 지적되었습니다.신장피질과 비교하여 시스플라틴 관련 전체 대사체 변화를 관찰하기 위한 영역[5]. 우리의 이전 결과는 또한 다양한 인지질 및 카디오리핀 변경에 반영된 시스플라틴에 의한 수질 세포의 직접적인 손상(2차 손상 제외)을 지적했습니다[4]. 이러한 새로운 결과는 시스플라틴에 의해 변경된 추가 지질 종 및 클래스로 이러한 관찰을 확장하고 시스플라틴 유도 AKI에서 수질 손상의 관련성을 강화합니다.
비록 FC에서신장시스플라틴 치료에 의해 유의하게 변경되지 않았으나, 총 CE 및 측정된 모든 개별 CE 종은 시스플라틴 유도와 관련하여 피질(총 CE에 대해 8배 증가) 및 수질(총 CE에 대해 4배 증가) 모두에서 현저하게 증가했습니다.신장 손상.콜레스테롤은 원형질막의 핵심 성분으로 인지질 사이에 위치하여 유동성, 표면 전하 및 극성 헤드 그룹의 상호 작용에 영향을 줍니다[35,36]. 그것의 존재는 또한 지질 뗏목에서 기본적이며, SM과 소수성 상호작용을 확립하고, 분자 분리에 필수적이며, 막의 다른 구성요소와의 상호작용을 제어하는 데 필수적입니다[37]. 세포는 소포체(ER)에서의 새로운 합성과 LDL 매개 흡수 사이의 콜레스테롤 균형을 유지합니다. 대부분의 콜레스테롤은 원형질막에 위치하지만 FC가 (ACAT 매개 에스테르화를 통해) CE로 전환될 수 있는 ER로 다시 순환할 수 있으며, 이는 콜레스테롤의 세포질 저장 형태로 간주됩니다[36]. CE는 또한 콜레스테롤 에스테르 회로를 구성하는 FC로 다시 가수분해될 수 있습니다[36]. FC는 cisplatin 치료 동안 변경되지 않았지만 CE가 피질과 수질 모두에서 증가했다는 사실은 변경된 것을 시사합니다.신장cisplatin에 의한 AKI와 관련된 콜레스테롤 대사. 이전 연구에서는 급성 허혈성 동안 HK{1}} 인간 근위 세뇨관 세포와 쥐의 신피질 모두에서 매우 유사한 관찰이 나타났습니다.신장 손상, 변경되지 않은 FC 및 증가된 CE 수준 [36]. 이 경우 원형질막 손상으로 인해 막에서 ER로 이동하는 FC 트래픽이 증가하는 것으로 나타났으며, 결과적으로 CE 생성이 증가하는 것으로 나타났습니다. 이와 관련하여, 원형질막보다 콜레스테롤이 풍부한 지질 래프트에 대한 손상이 ER로의 증가된 콜레스테롤 수송에 더 효과적인 것으로 나타났다[36]. CE의 세포 보호 역할은 이러한 이전 연구에서도 암시되었습니다. 쥐에서도 CE 수치의 증가가 보고되었습니다.신장당뇨병성 신증 초기 단계에서 피질 [29]. 결과는 또한 중성 지질의 세계적인 증가와 일치합니다.신장시스플라틴 치료 중 보고된 근위 세뇨관 [32]. 우리의 결과는 처음으로 개별 CE 종과 함께 총 CE의 전 세계적인 증가를 나타냅니다.신장피질 및 수질, 시스플라틴 유도 AKI 동안. 반면에 Cilastatin 자체는 피질에서만 CE 18:{2}} 및 CE 22:6을 약간 증가시키는 것으로 보이지만 FC 또는 CE의 총 수준은 변경되지 않았습니다. 이 약간의 효과는 표적 DHP-I가 근위 세뇨관(주로 피질)의 지질 뗏목에 위치하고 상호 작용 중에 막의 약간의 작은 교란이 암시될 수 있다는 사실 때문일 수 있습니다. 반면에 시스플라틴과 실라스타틴의 병용 투여는 피질에서 모든 시스플라틴 증가 CE 종의 감소로 이어진 반면, 수질에서는 회복 효과가 거의 관찰되지 않고 CE18:2의 부분 회복만 관찰되었습니다. . 이것은 근위 세뇨관 세포에서 실라스타틴의 특정 작용을 가리키며, 원형질막 및 피질의 지질 뗏목에 대한 시스플라틴의 직접적인 손상과 관련된 세포 사멸 확장의 상당한 보호를 발휘하는 반면, 전체 수질의 콜레스테롤 불균형과 관련된 세포 손상은 대부분 보호되지 않은 상태로 유지됩니다.
스핑고지질은 주로 세포막에서 발견되는 활성 지질이며 지질 뗏목에 상당히 풍부합니다[37]. 세라마이드는 스핑고지질 대사의 중심 대사산물로, 세포 성장, 세포자멸사, 분화, 약물 내성 및 노화를 포함한 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 다양한 분자와 효소를 포함합니다[38,39]. 또한, 스핑고지질은 시스플라틴 암 세포 사멸 및 AKI와 관련된 경로에 참여합니다[33]. 세라마이드는 새로운 합성, 스핑고미엘린의 가수분해 또는 복잡한 스핑고지질의 재활용을 포함한 여러 경로에 의해 생성될 수 있습니다[38]. De novo 합성은 주요 경로이며 ER에서 일련의 효소 경로를 통해 팔미토일-CoA 및 세린에서 발생하여 일련의 효소 경로를 통해 스핑가닌을 생성하고, 이는 디히드로세라미드 합성효소(CerS)를 통해 디히드로세라미드로 이어집니다. 마지막으로 dhCer의 불포화는 Cer를 생성한다[40]. SM은 또한 스핑고미엘리나제에 의해 가수분해되어 Cer를 생성할 수 있습니다. Cer는 골지체에서 더 복잡한 스핑고리피드로 변형될 수 있습니다. 인산화되어 신호 분자인 Cer{7}}P를 생성합니다. SM 합성효소의 작용에 의해 SM으로 전환됨; 또는 설파티드의 전구체인 hesoxylceramides(glucosyl- 또는 galactosyl-ceramides)를 생산하기 위해 글리코실화됩니다[38]. Cer는 또한 세포 생존 및 증식, 염증 및 약물 내성에 중요한 역할을 하는 스핑고신 인산염(S1P)의 전구체인 스핑고신으로 분해될 수 있습니다[39]. 마지막으로, S1P가 에탄올아민과 헥사데센알로 분해되는 것이 이 경로의 출구 경로입니다[38].
스핑고지질 종의 정량화 동안 Cer, dhCer, HexCer 및 dhHexCer의 총 수준의 전체적인 증가가 시스플라틴 처리 동안 관찰되었으며, 이는 특히 Cer와 관련이 있습니다. 통제에 대한 차이점신장시스플라틴 처리로 피질(11종) 및/또는 수질(18종)에서 22종 중 19종이 증가하여 개별 아종이 정량화될 때 더 분명했습니다. 이것은 마우스에서 Cer 및 HexCer의 증가를 가리키는 이전 관찰과 일치합니다.신장cisplatin 치료와 관련된 피질 [33], 그러나 여기에서 우리는 수질도 이 효과에 의해 영향을 받는다는 것을 발견했습니다.
이러한 관찰은 Cer/dhCer 및 HexCer/dhHexCer의 대사 생산 증가를 반영할 수 있습니다. 한편으로 이것은 이전의 관찰에 비추어 볼 때 증가된 CerS 활동을 통해 발생할 수 있습니다.신장cisplatin 치료 동안 장쇄 CerS 활성이 측정되었고 CerS의 억제로 관찰된 Cer/HexCer 축적이 감소했습니다[33]. 더욱이, 피질과 수질에서 발견되는 SM/dhSM 수준의 시스플라틴 유도 감소는 스핑고미엘리나제(SMase) 경로를 통한 SM/dhSM의 가수분해에 의한 Cer/dhCer 생성의 추가 증가를 시사하며, 긴 사슬 Cer/dhCer, 모두 AKI 모델에서 해롭다[40]. 이것은 또한 장쇄 Cer 종이 AKI 동안 관련성이 있는 것으로 보인다는 사실과 [40], 이전에 관찰된 SMase 활성 증가에 대한 관찰과도 일치합니다.신장시스플라틴 치료 중 피질 [33]. Cer는 내인성 및 외인성 경로 모두에서 신호 전달을 통해 시스플라틴에 의해 유도된 세포자멸사에 관여합니다[39]. 고유 미토콘드리아 경로에서 시스플라틴은 미토콘드리아 외막 투과성을 유발합니다. 하류 대사산물과 함께 Cer의 증가는 이러한 투과화에 기여할 수 있으며, Cer에 의한 채널의 형성은 미토콘드리아 막에서 세포자멸사를 촉진하여 Bax가 미토콘드리아 외막으로 유입될 수 있게 하고 시토크롬 C [39]. 또한 Fas 매개 외인성 세포 사멸은 지질 뗏목에 위치한 Fas 수용체를 사용하며 클러스터링은 cisplatin에 의한 SMase 활성화 및 Cer 상승에 의해 매개됩니다 [39]. 따라서 Cer는 시스플라틴 유발 AKI에서 세포자멸사를 결정하는 반면, HexCer로의 변환을 통한 레벨링은 보호적인 것으로 보이며[33] 시스플라틴에 대한 내성과 관련이 있습니다[39]. 다량으로 생성된 Cer는 또한 막의 물리적 특성에 영향을 줄 수 있으며 콜레스테롤을 대체하고 에스테르화를 유발할 수 있습니다[35]. 반면에 SM은 주로 원형질막에 존재하며 콜레스테롤 분자와 직접적인 관련이 있으며 지질 뗏목에서 특히 중요합니다[41]. SM 재생의 부족은 적절한 막 기능에 부정적일 수 있습니다[41].
유황이 풍부하다.신장,특히 원위 세뇨관의 정점 막에서 [42]. 정상적인 생활에 필수적인 것은 아니지만신장 기능, Sulf의 결핍은 황산화된 당지질과 콜레스 테롤의 생성 증가에 의해 보상되는 것으로 밝혀졌습니다[42]. Sulfatide는 L-selectin의 핵심 리간드입니다.신장,단핵구 침윤에 중요한 역할을 합니다.신장간질[42]. 반면에 지질 뗏목 관련 미엘린 및 림프구 단백질(MAL)은 황산염 및 글리코스핑고지질과 복합체를 형성합니다.신장막, 글리코스핑고지질이 풍부한 마이크로도메인의 안정화 및 분류에 기여합니다[42]. 피질과 수질의 Sulf 변경에 대한 우리의 결과는 다양한 설파타이드 종도 신장의 시스플라틴에 의해 변경되는 것으로 생각된 이전 연구를 확인합니다[34].
cisplatin에 의해 피질에서 변형된 모든 Cer, dhCer, HexCer 및 dhHexCer 종은 cilastatin 병용 투여에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 회복된 반면, 수질에서는 dhCer의 거의 완전한 회복으로 많은 양의 Cer 종이 회복되지 않았습니다. , HexCer 및 dhHexCer. 근위 세뇨관에서 지질 뗏목에서 DHP-1에 결합하는 cilastatin에 의한 Fas 매개 외인성 세포자멸사와 Cer 종의 차단을 고려할 때 이것은 보호 효과와 Cer 회복이 주로 피질 세포에서 일어나는 것을 설명할 수 있습니다. SM, dhSM 및 Sulf의 경우, cilastatin 회복은 피질보다 수질에서 더 관련이 있는 것으로 보이며, 이는 2차 손상이 외부 수질에 도달하는 근위 세뇨관에서 cilastatin 작용에 의해 손상됨을 시사합니다.신장 손상집중된다[4].
인지질은 세포막에서 가장 풍부한 종으로 PC와 PE가 우세하지만 관강 쪽에는 PC가 더 많이 존재하고 세포질 소엽에는 PE가 더 풍부합니다[35,43]. 한편, 리소인지질은 LPC를 포함한 글리세로인지질의 가수분해로부터 생성될 수 있는 신호종이다[35]. 정량화된 60개 PC, PE 및 LPC 종의 대부분은 피질 또는 수질에서 시스플라틴 처리에 의해 변경된 것으로 밝혀졌으며 PC 및 LPC는 피질에서 더 많은 양의 변화를 나타내는 반면 PE 관련 변화는 더 많았습니다. 그리고 수질에서 두드러진다. 변경신장시스플라틴 처리의 결과로 PC, PE 또는 LPC 종은 이전에 보고된 관찰 결과에 따릅니다.신장AKI 동안 [4,5,26,34,44]. 우리의 결과는 대부분의 변경된 PE, PC 및 LPC 종이 피질과 수질 모두에서 시스플라틴에 의해 감소되었음을 나타냅니다. cilastatin 신장 보호 효과와 관련하여 놀랍게도 cisplatin으로 변경된 지질의 경우 수질에서 피질보다 부분 또는 전체 회복 효과가 더 높은 수준으로 관찰되었습니다. 또 다른 흥미로운 사실은 피질과 수질에서 시스플라틴이 증가된 PC, PE 및 LPC 종은 모두 cilastatin에 의해 회복된 반면, 피질에서 cisplatin이 감소된 종의 대부분은 cilastatin과 함께 공동 치료하는 동안 여전히 변경되었다는 것입니다. 이것은 피질에 시스플라틴이 축적되어 실라스타틴에 의해 보호되지 않고 세포 사멸 및 관련 PC, PE(세포막의 주요 구성 요소) 및 세포 사멸체에서 LPC 방출로 이어지는 더 높은 정도의 직접적인 손상을 나타낼 수 있습니다. 따라서 수준이 감소합니다. 대조적으로, 외인성 세포자멸사 및 근위 세뇨관에서의 단백질 캐스트 축적과 관련된 2차 손상은 실라스타틴에 의해 보호될 수 있습니다. 이것은 PC, PE 및 LPC 종이 수질에서 감소하고 시스플라틴에 의한 이차 세포 손상과 더 관련이 있음을 의미합니다. 반면에 PC, PE 및 LPC 종의 증가는 세포막 재생 또는 신호 전달 과정과 관련이 있을 수 있으며, 이러한 결과에 따르면 실라스타틴에 의해 보호되는 이차적 외인성 세포자멸사 시스플라틴 유발 손상과 더 관련이 있을 수 있습니다.
또한 시스플라틴에 의해 유도된 불포화 지방 사슬이 높은 PC 및 PE 종의 백분율 감소도 관찰되었으며, 이는 지질 과산화 과정과 관련될 수 있으며 cilastatin에 의해 감소될 수 있습니다[4,10,11].
전 세계적으로, 본 명세서에서 정량화된 지질 종 내에서, 실라스타틴의 회복 효과는 피질의 시스플라틴 변경 지질 56개 중 26개, 수질의 시스플라틴 변경 지질 63개 중 50개에서 관찰되었습니다. 아마도 이것은 수질과 비교하여 주로 피질에서 시스플라틴에 의해 가해지는 보호되지 않은 직접적인 미토콘드리아 손상과 관련된 높은 수준의 지질 변화를 반영하며, 전체 수질에서 감지된 2차 손상 보호와 관련된 지질 변화가 더 많이 나타납니다. 또한, 다변수 분석을 통해 시스플라틴 유도 AKI 및 실라스타틴 모두에 대한 잠재적인 새로운 지질 바이오마커를 식별할 수 있었습니다.신장 보호, 섹션 2.5 및 2.6에 설명된 대로 CE, Sulf, PE, PC, Cer 또는 HexCer 종을 포함합니다. 우리의 연구 결과에서 CE 18:2 및 PE 36:5는 시스플라틴 손상과 실라스타틴을 동시에 식별할 수 있는 가능한 후보 바이오마커입니다.신장 보호피질과 수질 모두에서. 그러나 실라스타틴을 사용한 이 두 종의 회복은 부분적이므로 바이오마커로 더 적절한 종은 피질에서 dhHexCer 34:0, 수질에서 Sulf 42:0가 될 것입니다.신장 손상및 보호, cilastatin이 대조군의 수준으로 시스플라틴으로 변경된 수준을 완전히 회복했습니다. 이것은 모든 Fas/Fas 리간드 매개 신장 손상으로 추정될 수 있지만 향후 연구에서 확인되어야 합니다. AKI의 몇 가지 새로운 바이오마커, 주로 단백질(예: KIM-1 [45] 또는 NGAL [46])이 최근에 제안되었습니다. 시스플라틴에 의해 유도된 AKI 및 관련 실라스타틴 보호의 잠재적인 새로운 바이오마커를 발견했다는 사실,신장조직, 기존 지식을 확장하고 더 나은 진단, 예후 및 후속 조치를 위한 보완 옵션을 제공합니다. 사실, 바이오마커의 검출 조합은 특정 신독성 물질(시스플라틴과 같은) 또는 다른 원인에 의해 유발된 특정 AKI의 표시로 잠재적으로 사용될 수 있으며 심지어 질병 상태/진행을 구별할 수도 있습니다. 또 다른 단계는 우리의 결과가 변경되었는지 여부를 결정하는 것입니다.신장지질 패턴은 혈액이나 소변의 순환 지질에도 반영됩니다. 이것은 시스플라틴 유도 AKI 및 실라스타틴에 대한 바이오마커 검출을 가능하게 합니다.신장 보호환자에서 더 실현 가능합니다.
시스플라틴에 의해 유도된 AKI 관련 지질 수준의 변화는 매우 다양하며, 전체에서 중요한 구조적 지질을 포함합니다.신장구조: 피질과 수질. 실라스타틴에 의한 이러한 많은 변화의 감쇠는 개선에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다신장 기능정규화와 관련하여 지질 관련 구조적 변화를 감소시킵니다.신장형태. 다시 말하지만, 실라스타틴은 시스플라틴으로 인한 보호되지 않은 직접적인 세포 손상 및 Fas 매개 세포자멸 경로의 실라스타틴 차단에 의해 근위 세뇨관에서 손상될 수 있는 1차 손상과 관련된 이차적 변화를 식별하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다.
재료 및 방법
시약Cilastatin(Merck Sharp and Dohme SA, Madrid, Spain) 및 cisplatin(Pharmacia Nostrum(스페인 마드리드))을 사용했습니다. {{0}}.9% NaCl 용액(Braun Medical SA, Barcelona, Spain)은 투여용 약물 용액의 제조에 사용되었다. ß-1,{15}}N-도데카노일-D-에리트로-스핑고신[HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-도데카노일 D -에리트로 스핑가닐포스포릴콜린 [dhSM 3{{5{72}}}:0 (d18:0/12:0)], 1,{35}}디미리스톨레오일-sn 글리세로{37}} 포스포콜린 [PC 28:2(14:1/14:1)], 1-헵타데카노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3- 포스포콜린[LPC(17:0)], 1, 2- 디팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[PE 32:2 (16:1/16:1)]은 Avanti Polar Lipids(Alabaster, Alabama, USA)에서 구입했습니다. 중수소화 N-테트라코사노일- D-에리트로-스핑고신[Cer 42:1-d7(d18:1/24:0)], N-스테아로일 D-에리트로-디하이드로스핑고신[dhCer(36:0-d3)] 및 C{79}}설포갈락토실세라마이드[Sulf 34:1(d18:1/16:0)]는 Matreya LLC(State College, PA, USA)에서 구입했습니다. 콜레스테롤-d7(FC-d7) 및 콜레스테릴-d7 팔미테이트[CE(16:{93}}d7)]는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다.
메탄올(MeOH), 아세토니트릴(ACN), 이소프로판올(iPrOH)(VWR International Eurolab, Barcelona, Spain)과 클로로포름, 디클로로메탄, 메이트용 암모늄을 포함한 HPLC 또는 LC-MS 등급 용매 및 시약이 독점적으로 사용되었습니다. (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, Spain). 초순수는 Milli-Q 정제 시스템(Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, Spain)에서 얻었다.
동물 모델성체 수컷 위스타 쥐(WKY, Criffa, Barcelona, Spain)는 Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón(IiSGM, Madrid, Spain)에서 사육되었습니다. 이들은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 통제된 온도, 빛 및 습도 조건에서 보관되었습니다. 치료는 이전에 설명된 대로 [4,11] 4개 그룹의 쥐(그룹당 n=6마리)에 복강 내 투여되었습니다. 그룹 1: 대조군(CNT) - 0.9% NaCl을 그룹 3 및 4에 대한 처리와 동일한 방식으로 래트; 그룹 2: 실라스타틴(CIL)-주사(1일 체중(bw)의 15{16}}mg/kg); 그룹 3: 시스플라틴(CISPL) 주사(0일에 5 mg kg 1 bw의 고유 용량); 및 그룹 4: 시스플라틴 + 실라스타틴(CISCIL) - 0일에 5 mg kg 1 bw 주사 및 실라스타틴 주사(1일 150 mg kg 1 bw). 동물을 치료 시작 5일 후에 희생시켰다. 이에 앞서 24시간 소변을 각 쥐의 대사 우리에 수집했습니다. 혈청도 원심분리에 의해 분리하였다. 4℃에서 0.9% 식염수로 관류 후 신장을 제거한 후 캡슐을 제거하였다. 왼쪽의 피질과 수질신장그리고 가로로 자른 오른쪽 절반신장절제하고, 액체 N2에서 급속 동결하고, 최종적으로 t 80 oC에서 보관했습니다. 오른쪽의 나머지 절반신장4% 파라포름알데히드에 고정되었고 조직학적 연구를 위해 파라핀이 포매되었습니다.
조직학적 연구Hematoxilin/eosin(Sigma-Aldrich, Steinhem, Germany) 염색은 5 µm 시상 쥐에서 수행되었습니다.신장섹션. 도립된 IX70 현미경(Olympus, Hamburg, Germany)은 조직학적 검사를 위해 20배 및 60배 배율로 현미경 사진을 찍는 데 사용되었습니다.
신장 기능 지표AutoAnalyzer Cobas 711(Roche, Basel, Switzerland)은 혈청 샘플의 BUN, 크레아티닌, 나트륨 및 칼륨 측정에 사용되었습니다. GFR 계산에는 크레아티닌 청소율을 사용했습니다. 총 단백질은 sulfosalicylic acid 방법을 사용하여 소변에서 측정되었습니다[47].
조직 균질화 신장피질 및 수질 조직(각각 약 50mg)을 800μL의 용해 완충액이 들어 있는 1.5mL 스크류 캡 플라스틱 튜브에 추가했습니다. 및 프로테아제 억제제(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA), 및 1.5mm 지르코늄 비드. 조직을 BeadBug{19}} Homogenizer(Benchmark D{20}}E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, USA)에서 4500rpm에서 90초의 3주기로 분해했습니다. 균질물을 10% 진폭에서 40초 동안 추가로 초음파 처리하고 4℃에서 1분 동안 600×g에서 원심분리했습니다. 생성된 상청액의 분취량은 비신코닌산(BCA) 단백질 분석(Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA)에 의한 총 단백질 측정을 위해 1:10으로 희석되었습니다. 나머지 단백질 추출물은 지질 분석까지 t 80 °C에서 보관되었습니다.
LC-MS/MS에 의한 지질 분석Folch의 방법[48]에 따라 조직에서 지질을 추출했습니다(총 단백질 25{15}} µg에 해당). 10 마이크로리터의 내부 표준물질(IS) 혼합물을 지질 추출 전에 첨가하여 이전에 설명한 바와 같이 지질 종의 상대 몰 정량화를 획득했습니다[49]. IS-혼합물은 CE(16:{5}}d7), FC-d7, Cer(42:{{1{23}}}} d7), HexCer(30 :1), LPC(17:0), PC(28:2), PE(32:2), SM(30:1), dhSM(30:0), dhCer(35:0), Sulf(34) :1), 표 S4에 주어진 농도에서. 지질 추출물을 질소 기류 하에서 건조하고 250 μL의 아세토니트릴/이소프로판올(1:1, vol:vol)로 재구성하고 10분 동안 초음파 처리한 다음 주사 바이알로 옮겼습니다.
지질 추출물 5마이크로리터를 LC 시스템 Eksigent UltraLC{0}}(AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA)에 주입했습니다. 종은 55℃에서 작동하는 Kinetex C18 컬럼(100 × 2.1 mm, 1.7 µm; Phenomenex, Macclesfifield, UK)에서 분리되었습니다. 용출은 용매 A(물 중 60% 아세토니트릴, 10mM NH4COOH) 및 용매 B(아세토니트릴 중 90% 이소프로필 알코올, 10mM NH4COOH)의 이원 혼합물 및 12에서 60% A에서 100% B로의 선형 구배를 사용하여 적용되었습니다. min 및 100% B에서 60% A까지 0.4mL min悆 1의 유량으로 8분 내에. QTrap 4000 기기(AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA)는 Analyst 1.6.2 소프트웨어와 함께 지질 검출에 사용되었습니다. 질소는 건조 가스(T: 500℃, 압력: 30psi)와 분무 가스(50psi)로 사용되었습니다. 검출은 ESI 음성 모드에서 분석된 Sulf를 제외한 모든 지질 클래스에 대해 전자분무(ESI) 양성 모드로 설정되었습니다. CE 및 FC는 양이온 모드에서 APCI(대기압 화학 이온화) 소스를 사용하여 분석되었습니다. 유지 시간에 각 지질 종에 대한 다중 반응 모니터링(MRM) 전환을 설정하는 지질 검출을 위해 표적화된 접근 방식이 사용되었습니다(표 S5). LC-MS/MS 피크 크로마토그램은 Skyline 소프트웨어 버전 4.1(MacCoss Lab, Seattle, WA, USA)을 사용하여 처리되었습니다[50]. 지질 종은 이전에 설명된 바와 같이 각 종의 면적을 지질 등급에 대한 IS 면적과 직접 비교하여 정량화했습니다[49]. 결과는 nmol/mg 단백질로 표시되었습니다. 총 지질 부류 수준은 정량화된 개별 지질 부류 종의 합으로 결정하였다. 지질 종은 권장 표기법에 따라 지정되었습니다[51].
통계 분석값은 평균 ± 표준 편차로 표시되었습니다. SPSS 11.5(SPSS, Chicago, IL, USA)는 기술 통계 및 분산 분석에 의한 그룹 간 변수의 통계적 차이를 평가하는 데 사용되었습니다. 지질 변수의 2개 짝을 이루지 않은 그룹 비교를 위해 정규성 테스트(Shapiro-Wilk) 후에 모수(양쪽 꼬리 짝이 없는 스튜던트 t) 또는 비모수(Mann-Whitney) 테스트가 수행되었습니다. Benjamini–Hochberg 방법은 여러 지질 개별 종을 비교할 때 p-값의 FDR(false discovery rate) 수정에 사용되었습니다. 양측 p-값 < 0.{11}}5="" 및="" fdr="">< 0.1은="" 잠재적="" 바이오마커="" 후보가="" 누락되는="" 것을="" 방지하기="" 위해="" 통계적으로="" 유의미한="" 차이를="" 식별하는="" 데="" 고려되었습니다.="" 그룹="" x="" 대="" 그룹="" y의="" 배수="" 변화는="" 각="" 그룹="" x:y의="" 변수에="" 대한="" 평균값의="" 비율로="">
다변수 데이터 분석(MVDA)은 SIMCA 버전 14.1(MKS Umetrics, 스웨덴 웁살라 소재) 및 MetaboAnalyst 5를 사용하여 수행되었습니다.0(https://www.metaboanalyst.ca(액세스: 9월 3일{17}}) {{20}}21)) [52], 감독되지 않은 PCA 및 감독되는 OPLSDA 포함. k-최근접 이웃 방법을 사용하여 결측값을 대체했습니다. 변수는 MVDA 이전에 로그 변환 및 파레토 스케일링되었습니다. 모델은 R2 및 Q2 값에 따라 평가되었습니다. OPLS-DA는 순열 테스트(100주기)로 검증되었습니다. OPLS-DA 모델의 VIP 점수 및 S-플롯은 CISPL 대 CNT, CISCIL 대 CNT, CISCIL 대 CISPL 그룹 차별에서 관련 변수를 식별하는 데 사용되었습니다. VIP > 1의 동시 준수, 상관 계수로 스케일링된 부하 |p(corr)| > 0.5, 그리고 두 그룹 비교를 위한 양측 p-값 < 0.05="" 및="" fdr="">< 0.1은="" 잠재적="" 바이오마커="" 선택에="" 사용된="" 기준이었습니다.="" auc="" 값은="" roc="" 곡선="" 플롯에서="">
특허다음 특허는 이 원고에 제시된 작업과 부분적으로 관련되어 있습니다. "다양한 화합물의 신독성을 감소시키기 위한 실라스타틴의 사용"(특허 번호 EP2,143,429 B1; US 9,216,185 B2; US 9,522,128 B2; 및 US9,757,349 B2). 이들은 Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón(FIBHGM)에 할당되고 FIBHGM이 Telara Pharma SL에 라이선스를 부여했습니다. Telara Pharma SL은 현재 Arch Biopartners와 라이선스 계약을 체결했습니다.
