많은 연구에서 알레르기 질환이 선천적 면역 활성화의 결과일 뿐만 아니라 2

3. 토론

아토피 피부염(AD)의 발병기전은 완전히 이해되지 않았지만 피부 장벽 기능 장애에서 비정상적인 면역 글로불린 E(IgE) 면역 반응에 의해 매개됩니다. 그 중 비만세포(MC)는 알츠하이머병을 비롯한 IgE 매개 알레르기 질환을 유발할 수 있습니다. 비만 세포가 활성화되면 막에 결합된 세포질 입자를 방출하여 다양한 분자를 방출합니다. 이 분자는 알츠하이머병과 숙주 방어의 발병기전에 중요한 역할을 합니다[27]. 비만 세포 활성화 또는 탈과립을 억제하면 다양한 IgE 매개 과민 반응을 조절하는 데 도움이 되기 때문에 비만 세포는 항알레르기 약물 탐색에 이상적인 표적 중 하나입니다. 우리 연구에서 비만 세포는 화합물 48/80과 칼슘 이온 전달 물질 A23187, 항-DNP/IgE와 DNP/HSA에 반응하여 탈과립화됩니다. 우리는 참조가 비만 세포의 탈과립 효과를 효과적으로 억제하여 항 알레르기 반응을 나타내는 것을 발견했습니다. 또한, 세포 내 칼슘의 증가와 MAPK의 활성화는 참조에 의해 억제되었습니다. 또한, DNCB로 인한 피부 비만세포 침윤과 화합물 48/80으로 인한 긁는 행동도 감소했습니다. 따라서, 네페린의 항아토피성 피부염의 기전은 각질형성세포와 비만세포에 대한 승수 효과를 갖는다.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de unavariadad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel Importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos Ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionó de calcio A23187, y 항 DNP/IgE 및 DNP/HSA. Encontramos que la referencencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencerencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

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조직에서 발견되는 비만 세포의 세포질은 미리 형성된 염증 매개체의 크고 조밀한 입자로 채워져 있습니다[28]. 비만 세포의 분비 과립에서 이러한 매개체를 방출하는 과정을 탈과립이라고 합니다. 비만 세포 탈과립을 억제하면 다양한 IgE 매개 과민 반응을 조절할 수 있으므로 비만 세포는 항알레르기 약물 탐색에 이상적인 표적 중 하나입니다[29,30]. 우리의 결과는 참조가 항원, 수용체 자극제 또는 이온 전달 장치의 사용에 관계없이 비만 세포의 탈과립에 매우 좋은 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이것은 참조가 잠재적인 항알레르기제임을 보여줍니다(그림 2).

미리 저장된 모든 그래뉼, 새로 합성된 매개체, 심지어 그래뉼과 그 구성 요소도 MC 활성화 지표로 사용할 수 있습니다[31]. 또한 표준 방법은 세포 내 Ca4t 농도 측정입니다. 실험실에서 일반적으로 사용되는 대부분의 MC 분비촉진제(예: 항원, 화합물 48/80)는 세포 내 Ca2 플러스 농도를 증가시켰습니다. 사실, 세포 내 Ca2 플러스 농도의 증가는 또한 MC 탈과립을 유발할 수 있습니다. 일반적으로 세포 내 Ca4t의 증가는 thapsigargin(구체적으로 차단 Sarco/endoplasmic Ca2 plus ATPase, SERCA) 펌프 및 ionophores(즉, ionomycin 및 A23187)와 같은 화합물로 MC를 활성화함으로써 유도됩니다[32,33]. 따라서 Ca2t 의존성 MC 활성화에서 Ca2t 유입의 측정은 MC 활성화 조건을 결정하는 방법으로도 간주됩니다. MC 연구에서 Fura{15}}는 세포 내 Ca2 플러스 변화 측정에 널리 사용됩니다. 우리의 실험에서, 우리는 활성화된 비만 세포의 형광 강도가 참조 처리 후 유의하게 억제되었음을 발견했습니다(그림 3). 이전 보고서에서는 세포 내 Ca4t 농도의 증가가 히스타민의 방출에 따른 것으로 나타났습니다[34]. 따라서 우리는 히스타민의 방출도 참조 치료에 의해 억제될 것이라고 추론합니다. 이 가설을 확인하기 위해 추가 실험이 필요합니다.

비만 세포는 상당히 다른 기능적 출력을 가지고 있습니다.cistanche 복용량 레딧여기에는 탈과립, 아라키돈산 전구체의 형성, 주화성, 사이토카인 생성이 포함되며, 자극제와 상관없이 모두 칼슘 신호에 어느 정도 의존합니다. 35]. 활성화된 비만 세포에 의한 사이토카인의 생산은 이들 세포에서 사이토카인 유전자 전사의 유도의 결과입니다. 비만 세포의 자극은 NF-kB 및 AP{3}}의 활성화와 많은 사이토카인의 생성을 유도합니다[36]. MAPK 캐스케이드 신호 전달 경로는 사이토카인의 발현 조절에 필수적인 역할을 합니다. PI에 의한 PKC의 활성화를 통한 이러한 경로의 활성화는 IL{6}}, IL{7}} 및 TNF와 같은 염증성 사이토카인 유전자를 비롯한 다양한 유전자의 활성화를 초래합니다[37]. 우리의 최근 연구는 참조가 각질 세포의 활성화에 의해 방출되는 사이토카인을 억제할 수 있음을 보여주었습니다. 동시에 우리는 MAPK의 경로 활성화도 참조 처리에 의해 억제된다는 것을 발견했습니다[18]. 우리의 현재 연구에서 우리는 참조가 비만 세포에서 MAPK 활성화의 억제를 통해 사이토카인의 발현을 감소시킬 수도 있음을 보여주었습니다(그림 4 및 5). NFkB의 활성화도 MAPK 활성화의 억제로 인해 감소됩니다(그림 6).

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Cistanche 캔 안티 에이징

많은 연구에서 알츠하이머병 환자의 다양한 사이토카인이 상승하여 각질세포에서 분비되는 사이토카인과 Th{0}}유도 사이토카인을 비롯한 피부 장벽 기능 장애를 유발한다고 보고했습니다[38,39]. 또한, 이러한 분비된 사이토카인은 필라그린(FLG), 로리크린(LOR) 및 인볼루크린(IVL)을 포함한 밀착접합(T) 단백질 및 말단 분화 유전자의 발현을 하향 조절하는 것으로 보고되어 있습니다[39,40 ](Pro)필라그린 발현은 알츠하이머병에서 감소하고 MC 트립타제 및 IL-6[41]과 역으로 연관됩니다. IL-1은 피부 장벽이 손상된 마우스에서 만성 염증을 매개합니다[35]. 이전 연구에서 NC/Nga 마우스의 등쪽 피부에 DNCB를 적용한 후 FLG, IVL 및 LOR의 발현이 하향 조절되는 것으로 보고되었습니다[42,43]. 본 연구에서는 대조군의 등쪽 피부에서 FLG, IVL 및 LOR의 발현이 현저히 감소하여 표피 장벽이 손상된 것으로 나타났다. 참조 투여는 DNCB 처리 후 감소된 FLG, IVL 및 LOR의 발현을 유의하게 회복시켰고, 참조 투여는 대조군에 비해 IVL 및 LOR의 발현을 약간 증가시켰다(도 8). 화합물 48/80은 피부 비만 세포의 효과적인 활성화제인 것으로 알려져 있습니다. 화합물 48/80에 의해 자극된 피부 반응은 비만 세포에서 히스타민을 방출하여 긁는 행동을 유발할 수 있습니다[44]. 활성화된 비만 세포에서 방출되는 히스타민은 화합물 48/80으로 인한 혈관 투과성 증가에 중요한 역할을 합니다. 사람의 소양증 중에는 비만세포에서 다양한 자극을 통해 분비되는 히스타민도 고려된다. 중요한 중개자 역할을 한다. 따라서 비만 세포의 탈과립을 억제하는 것은 긁는 행동 동안 히스타민 방출을 조절하는 중요한 단계입니다. 이 연구 화합물에서 48/80은 피부 비만 세포의 효과적인 활성화를 유발했습니다. 그러나 참조 전처리는 비만 세포의 탈과립 수준을 유의하게 감소시켰다(그림 2).시스탄체 추출물의 장점이러한 결과는 참조의 긁힘 방지 행동 효과가 비만 세포 탈과립을 조절함으로써 혈관 투과성의 감소로 인한 것일 수 있음을 나타냅니다(그림 9).

일반적으로 알츠하이머병 환자는 피부 장벽 기능 장애나 피부 염증, 또는 둘 모두를 겪는다고 알려져 있어 적절한 치료 방법을 찾기 어렵다. 따라서 일반적으로 병용 요법이 권장됩니다. 우리의 최근 연구는 면역 조절 기능과 장벽 복구 능력이 결코 없다는 것이 증명되었습니다. 따라서 향후 알츠하이머병 치료에 있어 중요한 참고 사항은 피부 기능의 유지와 피부 수화 및 장벽 회복 개선이다. 참조는 또한 알레르겐 및 자극 물질에 의해 유발되는 긁는 행동을 감소시킬 수 있습니다. 또한 아토피 행진은 단계적으로 발생하고 진행되는 현상 관련 질병입니다. 아토피 피부염은 유아기에 흔히 나타납니다. 음식 알레르기는 종종 1-2세 이후에 발생합니다. 알레르기 비염은 종종 방과 전후에 시작될 수 있습니다. 천식 증상은 다양한 시기에 나타나지만 대부분 알레르기성 비염 후에 나타납니다. 소아기 이후에는 아토피 피부염과 특정 음식 알레르기가 호전되거나 사라질 수 있습니다. 알레르기성 비염과 천식은 치료가 쉽지 않다[45,46]. 따라서 그들은 질병에서 동반되는 현상입니다. 참고 문헌을 포함한 천연물은 동반 질환의 치료 가능성이 있으며 관련 질병에 대한 효과는 향후 연구 가치가 있습니다.

4. 재료 및 방법

4.1.쥐 호염기성 백혈병 세포

쥐 호염기성 백혈병 세포(RBL{0}}H3)는 대만 타오위안에 있는 Chang Gung University의 TLHwang에서 기증한 것입니다. RBL-2H3 세포는 항원 또는 칼슘 이온통로 유도된 탈과립, 세포 내 Ca4t 및 신호 전달을 연구하는 데 사용되는 점막 비만 세포입니다[29]. 세포를 37도, 5% CO2에서 페니실린 및 스트렙토마이신과 함께 10% FBS를 함유하는 EMEM에서 배양하였다. Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IM) 및 태아 소 혈청(FBS)은 Thermo Fisher Scientific(GIBCOTM, New York, NY, USA)에서 구입했습니다.

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4.2.MTT 분석

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐{6}}H-테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 사용하여 세포의 대사 활동. RBL-2H3 세포를 {{10}웰 배양 플레이트에 5 × 10 plus /well로 접종했습니다. 24시간의 약물 처리 후, 웰당 30μL MTI를 첨가하고 37도 세포 인큐베이터에{16}} 시간 동안 둔 다음, 보라색 포르마잔 결정을 DMSO로 용해했습니다. ELISA 리더를 사용하여 550 nm 파장에서의 흡광도를 세포생존율 시험으로 측정하였다.

4.3.세포내 Ca2 플러스 수치 측정

[Ca2t] I는 이전에 설명한 대로 fura-2로 측정되었습니다. 30 분. Fura{11}} 로딩 후 각질 세포를 펠릿화하고 신선한 DMEM에 재현탁했습니다. 분취량(2mL)을 1.2mM CaClz.Fura{15}}Ca 형광을 포함하는 교반 큐벳으로 옮겼습니다. PerkinElmer LS{19 }} 분광형광계(PerkinElmer Life and Analytical Sciences). 데이터는 5초 간격으로 기록되었습니다[47].

4.4. 정량적 고분자 연쇄 반응(qPCR)

RBL{0}}H3 세포를 3.5cm 배양 접시에 심었습니다. 세포가 90% 가득 차게 성장한 후, 세포를 24시간 동안 정적 상태에서 성장시켰다. 세포를 20분 동안 참조로 전처리한 후, 각각 1시간 또는 24시간 동안 TNF-α/IFN-γ로 자극하였다. 세포를 긁어내고 원심분리(16,{12}}×g, 10분, 4도)하고 상층액을 추출했습니다. RNA는 total RNA isolation kit(GeneDirex@, Vegas, NV, USA)를 사용하여 정제되었습니다. 스크립트 cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD)의 조작 절차에 따라 시약을 순서대로 첨가하고 지시된 조건에 따라 조작하여 RNA를 cDNA로 전환시켰다. 또한, PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix(Applied Biosystems™)를 사용하였다. 총 7.5 uL의 ddH20, 2 uL의 cDNA, 0.25 μL의 정방향 및 역방향 프라이머, 10 uL의 SYBR GREEN을 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 프라이머 서열은 표 1과 표 2와 같다. 그런 다음 ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System을 이용하여 RNA를 정량하였다.

4.5. 웨스턴 블롯 분석

Western blotting은 세포 내 다양한 단백질의 변화를 분석하는 데 사용됩니다. RBL{0}}H3 세포를 3.5cm 배양 접시에 파종했습니다. 세포가 90% 가득 차고 24시간 동안 기아 상태가 된 후 참조로 20분 동안 전처리한 후 TNF-α 또는 IFN-γ로 각각 30분 또는 1시간 동안 자극하였다. 긁어낸 후 초음파로 분쇄하고 원심분리(13,200 rpm, 10분, 4도)하였다. 원심분리 후, 상층액을 채취하고 Pierce 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)로 단백질을 정량하였다. 10% SDS-polyacrylamide 젤에서 전기영동한 다음 PVDF 멤브레인으로 전기천공하였다. 전사가 완료된 후 PVDF 막을 5% 탈지분유를 함유하는 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% tween 20) 용액에 넣고 1시간 동안 흔들어 비특이적 결합을 방지하였다. 그런 다음 TBS-T를 사용하여 매회 10분씩 3회 세척하였다. 이후 1차 항체(1:1000 희석)를 첨가하고 4도에서 밤새 방치한 후 TBS-T로 10분마다 3회 세척하였다. 1시간 동안 2차 항체(1:1000로 희석)를 첨가한 후, PVDF 막을 매번 10분 동안 TBS-T로 3회 세척하였다. 마지막으로 현상액을 첨가하고 막을 화학 발광 추출 시스템(BIOSTEP Celvin")에 넣어 촬영했습니다.

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4.6.Dinitrochlorobenzene(2,4-Dinitrochloroben2ene, DNCB)쥐의 아토피 피부염 유사 피부 염증 유발

먼저, 마우스를 대조군, DNCB 그룹(음성 그룹), DNCB 그룹이 있는 기준(3 mg/kg 및 1{2}} mg/kg) 및 덱사메타손(0.2 mg/kg)의 4개 그룹으로 나누었습니다. DNCB 그룹(포지티브 그룹). Dexamethasone은 부종과 알레르기 반응을 줄일 수 있는 코르티코스테로이드 호르몬입니다. 이 생체 내 실험에서 기준 및 덱사메타손은 모두 DMSO에 용해되었고 DNCB는 초음파 충격에 의해 75% 에탄올에 용해되었습니다. 전자는 복강내 주사하고 후자는 등 피부에 100 uL, 오른쪽 귀에 20 uL를 도포하였다. 실험 3일 전 쥐를 마취시키고 뒷머리를 제거하고 쥐의 뒷발에 작은 측정자석(SCT-MAG-TF)을 박았다.시스탄체 징기스칸3일 동안 휴식을 취한 후 마우스의 컨디션이 양호하고 등쪽 제모 부위의 피부가 정상임을 확인하고 실험을 시작하였다. 실험 중 피부의 외양 변화를 기록하기 위해 사진을 촬영하였다. 1기({{0}}일)는 알레르기성 아토피 피부염 기간이었다. DNCB군, 기준(3 및 10mg/kg) 및 DNCB 실험군, 덱사메타손 0.2mg/kg 및 DNCB 실험군 마우스의 기본값을 측정한 후, 1% DNCB를 등 피부에 골고루 도포하고, 오른쪽 귀. 5일째에는 기준약물과 덱사메타손을 복강내 주사하였다. 두 번째 단계(5일~14일)는 아토피 피부염의 재유도였다.시스탄체 수명 연장3개의 실험 그룹에서00.5% DNCB가 마우스의 등 피부와 오른쪽 귀에 고르게 도포되었습니다. 다음날 피부의 생리학적 수치와 사진을 촬영하여 기록하였다. 15일째에 과도한 이산화탄소(CO2)로 마우스를 안락사시킨 후, 후속 실험 분석을 위해 등쪽 피부 조직을 제거하였다.

4.7.화합물 48/80-BALB/c 마우스에서 유도된 긁힘 행동

마우스 등의 털을 자르고 20 uL의 화합물 48/80 용액을 피내 주사했습니다. 대조군 마우스는 대신 식염수 주사를 받았습니다. 주사 직후 동물을 관찰 케이지(직경 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Japan)에 넣고 마우스의 긁는 행동을 자동으로 객관적으로 감지하여 평가하였다. 스크래치 동작은 60분 동안 측정되었습니다. MicroAct는 다음 분석 매개변수를 사용하여 마우스의 지속적인 긁는 동작에 해당하는 파동을 감지합니다. 임계값, 0.05V; 이벤트 간격, 0.05초; 최소 지속 시간, 0.25초; 최대 주파수, 30Hz; 최소 주파수, 5Hz. 4.8.통계분석

통계분석은 Sigma-Plot 소프트웨어(Version 10.0)를 사용하였다.시스탄체 NZ데이터는 (*) 및(#)를 참고로 사용하여 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 데이터의 통계적 유의성은 쌍을 이루지 않은 양측 Student t-tests.p 값이 0 미만으로 분석되었습니다.05 및 0.01은 유의한 것으로 간주되었습니다.

5. 결론

이 연구에서 우리는 참조가 비만 세포의 탈과립을 효과적으로 억제하고 전 염증성 사이토 카인의 발현을 감소시켜 아토피 성 피부염 유사 증상을 줄이고 피부 장벽을 회복하며 피부 긁힘을 줄일 수 있음을 확인했습니다. 우리는 참조가 피부의 각질 세포에 작용할뿐만 아니라 비만 세포의 활성화에도 영향을 줄 수 있음을 추가로 증명했습니다. 알레르기 및 염증성 피부 질환에 적용할 가능성이 더 큽니다.

이 기사는 Int에서 발췌했습니다. J. 몰. 과학. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms