말라리아 포자소체에 대한 Fc 수용체 매개 면역의 기전 및 표적

방어력이 높은 백신은 말라리아 제거를 달성하고 유지하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 항체 매개 면역의 메커니즘을 이해하는 것은 효능이 높은 백신을 개발하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 Fc-수용체(Fc R) 상호작용 및 스포로조이트의 옵소닌 식균작용에 대한 체액성 면역의 주요 역할을 식별합니다.

우리는 단핵구가 작은 역할을 기여하는 반면 말초 혈액에서 sporozoites의 식세포 제거를 매개하는 호중구에 대한 중요한 역할을 식별합니다. 항체는 또한 자연 살해 세포 활동을 촉진합니다. 기계적으로, Fc RIII와의 항체 상호작용은 필수적인 것으로 보이며, Fc RIIa 또한 최대 활성을 위해 필요합니다. circumsporozoite 단백질의 모든 영역은 sporozoite에 대한 기능적 항체의 표적이며 N-말단 항체는 일부 분석에서 더 많은 활성을 가집니다. 기능적 항체는 말라리아에 자연적으로 노출된 후 서서히 획득되며 일부 노출된 성인에게는 존재하지만 어린이에게는 흔하지 않습니다. 우리의 연구 결과는 효능을 극대화하기 위해 백신 설계에서 악용될 수 있는 면역의 표적과 메커니즘을 밝혀줍니다.

말라리아는 P. falciparum 말라리아로 인해 연간 약 2억 1,900만 건의 임상 사례와 435000명이 사망하는 등 전 세계적으로 주요 건강 문제로 남아 있습니다1. 국제적인 통제 노력에도 불구하고 말라리아 부담은 최근 몇 년 동안 일정하게 유지되었습니다1. 말라리아 통제 및 제거를 위한 매우 효과적인 백신에 대한 강력한 필요성이 있으며, 항말라리아제 내성 및 살충제 내성에 대한 보고가 증가함에 따라 더욱 강조되고 있습니다1. 세계보건기구(WHO)와 자금 지원 파트너는 2030년까지 75% 이상의 효능을 가진 백신을 개발한다는 목표를 세웠으며2 이는 달성하기 어려운 것으로 입증되었습니다3,4. 보다 강력한 보호 면역 반응을 생성하는 전략을 개발하려면 면역을 매개하는 메커니즘에 대한 더 많은 이해가 필요합니다.

일상생활에서 면역력을 높이려면 좋은 생활습관을 유지하는 것이 필요합니다. 잠자리에 들고 일어나는 시간표를 만들고 유지하면 일주기 리듬의 정상적인 작동을 촉진할 수 있습니다. 칼로리가 높은 명절 식사를 피하고, 소화를 어렵게 만드는 산성 음식이나 매운 음식을 피하십시오. 신선한 농산물로 가벼운 저녁 식사를 선택하십시오. 전자기기 사용을 제한합니다. 화면 조명은 수면 주기와 수면의 질을 변경하여 밤에 여러 번 깨도록 속일 수 있습니다. 이른 저녁에 격렬한 운동을 피하십시오. 최소 2시간을 권장합니다. 운동은 아드레날린의 방출을 자극하고 심박수를 증가시켜 수면을 활성화합니다. 또한 Cistanche deserticola도 섭취할 수 있습니다. Cistanche deserticola의 다당류와 verbascoside는 면역력을 향상시킬 수 있습니다. Cistanche deserticola의 다당류 및 verbascoside는 심장 및 뇌 조직의 효소 활동을 증가시키고 복막 세포의 식세포 기능과 림프구의 증식 반응을 향상시킬 수 있습니다.

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말라리아 감염은 감염된 아노펠레스 모기에 물린 것에서 시작되며, 그 동안 스포로조이트가 진피에 접종됩니다5. 그런 다음 Sporozoites는 혈관으로 이동하고 혈류에서 간으로 순환하여 간세포에 감염됩니다. Sporozoites는 말라리아 백신의 우선 대상이 됩니다. 왜냐하면 sporozoites를 제거하면 임상 말라리아가 발병하기 전에 감염이 중단되기 때문입니다3. 동물 모델 및 백신 시험에 대한 연구는 항체가 포자소체에 대한 면역의 핵심 매개체라는 것을 입증했습니다(참고 문헌 3에서 검토). 그러나 항체가 포자소체를 제거하고 감염을 예방하기 위해 기계적으로 기능하는 방법과 기능적 항체의 특정 표적은 잘 알려져 있지 않습니다. 보다 효과적인 백신 개발을 촉진하려면 이러한 질문에 대한 새로운 통찰력이 필요합니다.

CSP(circumsporozoite protein)는 포자소체6 표면에 가장 풍부한 단백질이며 인간 항체6의 주요 표적입니다. CSP 기반 백신은 현재까지 다른 백신 항원을 능가했지만 효능은 차선책으로 남아 있습니다3. 가장 발전된 말라리아 백신인 RTS, S는 절단형 CSP(중앙 반복 영역과 C-말단 영역만 포함)를 기반으로 하며 3상 임상 시험에서 임상 말라리아에 대한 중간 정도의 효능(29-36%)을 달성했습니다7. CSP의 중앙 반복 영역은 중요한 항체 표적으로 간주되며, 결과적으로 비반복 영역에 대한 항체의 잠재적 중요성은 크게 과소 연구되었지만 중요할 수 있습니다. C-말단 영역에 대한 항체는 어린이의 RTS 및 S 백신 시험에서 보호와 관련이 있었습니다9.

항체 기능 기전의 관점에서, 발표된 연구의 대부분은 CSP의 중앙 반복 영역에 대한 항체의 직접적인 억제 활성에 초점을 맞추었으며, 이는 체외에서 포자소체 운동성과 간세포 침입을 억제할 수 있습니다. 다른 잠재적으로 중요한 메커니즘과 면역의 표적에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

바이러스 및 세균성 병원체18-21에 대한 면역에서 점점 더 인식되고 있는 주요 면역학적 메커니즘은 항체가 다양한 세포 유형의 Fc 수용체(Fc R)와 상호 작용하여 옵소닌 식균 작용 또는 직접적인 세포 독성을 유발하는 능력입니다. 스포로조이트 항원에 대한 항체는 일반적으로 Fc Rs22와 상호 작용할 가능성이 강한 IgG1 및 IgG3 하위 클래스13에 의해 지배됩니다. 그러나 현재 sporozoites에 대한 면역의 이러한 잠재적 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 주요 식세포 유형에는 단핵구와 호중구(각각 말초 백혈구의 2–10% 및 45–70%)가 포함됩니다.

식균 작용 외에도 호중구 및 자연 살해(NK) 세포는 항체 의존성 세포 독성(ADCC)23,24을 통해 세포를 죽일 수 있으며 단핵구와 호중구 모두 활성화 마커, 사이토카인, 및 케모카인(참고문헌 25-27에서 검토).

Fc R 발현 패턴은 단핵구와 호중구 간에 다르며, 이는 면역 기능에 영향을 미칩니다. sporozoites는 말라리아 감염을 시작하는 첫 번째 단계를 나타내기 때문에 sporozoites는 일반적으로 활성화된 상태가 아닌 휴식 또는 항상성 상태에서 잠재적인 식세포를 만날 것입니다.

휴지기 단핵구는 주로 Fc RIIIa28을 발현하는 작은 하위 집합과 함께 Fc RI 및 Fc RIIa를 발현하는 반면, 휴지기 호중구는 Fc RIIa 및 Fc RIIIb29 및 낮은 수준의 Fc RIIIa30(기능적으로 중요함)을 발현합니다. 따라서 항체와 다른 Fc R 사이의 특정 상호 작용을 평가하는 것은 면역에서 다른 식세포의 잠재적인 역할을 이해하는 데 중요합니다. IgG 서브클래스, 글리코실화 및 에피토프 특이성은 각각 다른 Fc Rs22와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있습니다.

스포로조이트를 표적으로 하는 Fc R 매개 메커니즘을 정의하면 스포로조이트 기반 백신의 보호 효능을 향상시키기 위해 활용할 수 있는 통찰력을 밝힐 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 면역 세포의 특정 Fc Rs에 의해 매개되는 sporozoites에 대한 면역의 중요한 메커니즘과 표적을 밝힙니다. 우리는 항체와 특정 Fc R 사이의 상호 작용을 측정하고 최적의 기능적 활동에 중요한 특정 항체 특성, 항원 표적 및 Fc R을 식별하는 기술을 개발합니다. 또한, 우리는 자연적으로 말라리아에 노출된 어린이와 성인의 기능적 Fc R 의존성 항체 반응 획득을 정량화합니다. 우리의 연구 결과는 sporozoites에 대한 중요한 면역 메커니즘을 밝히고 매우 효과적인 말라리아 백신을 개발하기 위한 전략과 항원 표적을 제안합니다.

결과

스포로조이트의 옵소닌 식세포작용은 주로 말초 혈액의 호중구에 의해 매개됩니다.

sporozoites에 대한 Fc R 매개 메커니즘의 관련성을 조사하기 위해 표준 조건 에서 미분화 THP -1 세포주 (pro-monocytic 세포)를 사용하여 opsonic phagocytosis assay를 먼저 확립했습니다 (보충 그림 1A). 스포로조이트를 옵소닌화하기 위해 우리는 말라리아 전파 강도가 높은 지역에 거주하는 케냐 성인의 혈청 항체를 사용했으며 말라리아에 대한 상당한 임상 면역과 CSP33에 대한 항체를 가지고 있습니다. Opsonized P. falciparum sporozoites는 말라리아 순진한 기증자 (멜버른 거주자)의 항체를 사용하여 식균 작용이 거의없는 농도 의존적 ​​방식으로 THP -1 세포에 의해 효과적으로 식균되었습니다 (보충 그림 1B). 개별 혈청에 의해 매개되는 옵소닌 식균 작용은 매우 재현 가능했습니다 (r=0.925, P < 0.001; 보충 그림 1C).

옵소닉 식균 작용 분석을 위한 많은 수의 생존 가능한 스포로조이트를 생성하는 문제를 극복하기 위해, 우리는 스포로조이트의 옵소닉 식균 작용의 대리 측정으로서 스포로조이트에서 발현되는 주요 항원인 전장 CSP로 코팅된 형광 비드의 사용을 확립했습니다. 다양한 케냐 성인의 항체 샘플로 옵소닌화된 CSP 코팅된 비드는 THP-1 세포에 의해 효과적으로 식균작용을 받았고, CSP 코팅된 비드의 옵소닌 식세포작용은 P. falciparum sporozoites의 옵소닌 식균작용과 강한 상관관계가 있었습니다(r {{4 }}.831, P=0.0015, 보충 그림 1D). 따라서 CSP 비드는 항체 매개 옵소닌 식균 작용의 메커니즘과 표적을 연구하기 위한 효율적인 플랫폼을 제공했습니다.

그 후, 처음에는 CSP에 대한 다클론 토끼 항체로 옵소닌화된 CSP 비드를 사용하여 신선한 혈액을 사용한 전체 백혈구 분석에서 옵소닌 식균 작용을 매개하는 세포 유형을 조사했습니다. 흥미롭게도 식균 작용의 비율(세포당 식균 작용을 하는 비드의 수)은 단핵구보다 호중구에서 훨씬 더 높았습니다(그림 1A, B). 우리는 식균 작용 속도를 정량화했기 때문에 호중구의 더 높은 활성은 단핵구에 비해 더 많은 양으로 단순히 설명되지 않습니다. 옵소닌 식세포작용은 항체 농도가 증가함에 따라 증가했고, 단핵구에 비해 호중구의 더 높은 상대 활성이 항체 농도와 다양한 비드: 세포 비율에 걸쳐 나타났습니다. 호중구의 더 큰 식균작용 활성은 갓 분리된 살아있는 포자소체를 사용하여 확인되었습니다(우리는 P. falciparum CSP를 발현하는 형질전환 P. berghei sporozoites를 사용했으며, 이는 PfCSP-P. berghei라고 하는 내인성 P. berghei CSP 유전자12를 대체합니다. 케냐 말라리아에 노출된 공여자의 항체로 옵소닌화된 스포로조이트의 옵소닌 식세포작용은 단핵구에 의한 식균작용 수준이 낮고 호중구가 더 높은 식균작용 비율을 보이는 호중구에 의해 주로 매개되었습니다(그림 1C). 우리는 또한 식균작용을 위한 연장된 시간(최대 60분)을 허용하기 위해 분석을 수행했지만, 여전히 단핵구에 비해 호중구에 의한 훨씬 더 큰 식균작용을 관찰했습니다(보충 그림 2A).

단핵구 집단에 대한 추가 분석은 대부분의 식균 작용이 고전적인 하위 집합에 의한 것임을 나타냅니다 (CD14high CD16-; 그림 1D 및 보충 그림 2B-D). 우리의 연구 결과를 뒷받침하기 위해 우리는 정제된 호중구가 항체 옵소닌화된 P. falciparum sporozoites를 효과적으로 식균할 수 있음을 추가로 보여주었습니다(그림 1E). 재조합 CSP와의 사전 배양에 의한 CSP 특이 항체의 고갈은 고갈되지 않은 샘플과 비교하여 포자소체의 식세포 작용을 70%까지 감소시켰습니다(그림 1F 및 보충 그림 3). 우리는 반복적인 포자소체 감염에 노출된 개인으로부터 분리된 mAb(MGG4)를 테스트하여 인간 면역에서 획득된 기능적 항체의 표적으로서 CSP의 중요성에 대한 증거를 얻기 위해 추가 접근법을 사용했습니다34. mAb는 스포로조이트의 실질적인 식균작용을 유도한 반면, 비면역 인간 항체 또는 Fc R 상호작용을 억제하기 위해 Fc 영역에서 돌연변이된 항-CSP MAb(2A10)를 사용한 식균작용은 거의 없었습니다(그림 1G).

스포로조이트의 옵소닌 식균 작용에 관여하는 Fc 수용체를 정의합니다.

우리는 케냐 성인의 항체로 전체 P. falciparum sporozoites 및 CSP 비드를 옵소닌화하고 특정 Fc R 차단 항체가 있는 상태에서 호중구에 의한 옵소닌 식균작용을 측정했습니다. 호중구는 Fc RIIa 또는 Fc RIII 차단제(그림 2A, B 및 보충 그림 4A)의 존재 하에서 CSP 비드와 P. falciparum sporozoites 모두의 옵소닌 식균작용이 상당히 낮았으며, 이는 두 수용체가 모두 중요하다는 것을 시사합니다.

특히, Fc RIII 차단은 P. falciparum sporozoites 또는 CSP 비드의 식균 작용을 억제하는 데 가장 효과적이었으며 Fc RIIa 차단의 효과는 약했습니다. 호중구에 의한 옵소닌 식균 작용은 Fc RI 차단에 의해 영향을 받지 않았습니다. 차단 항체의 농도를 적정하면 각 Fc R의 차단에 대한 최대 효과를 달성했음을 알 수 있습니다(보충 그림 4B).

따라서 우리는 Fc RIIa와 Fc RIII 차단 항체를 조합하여 차단 항체를 사용하는 것보다 더 큰 식균 작용 억제를 제공한다는 사실을 발견했으며, 최적의 식균 작용을 위한 두 Fc R 유형의 중요성을 추가로 제안합니다(그림 2B). 이러한 결과는 주로 Fc RIIa 및 Fc RIIIa/b를 발현하지만 Fc RI35가 결여된 휴식 호중구에서 Fc Rs의 발현과 일치합니다(보충 그림 2C). CSP 비드 및 스포로조이트의 옵소닌 식균작용을 매개하는 Fc RIII의 중요성은 주요 단핵구 하위 집합이 비활성 상태의 표면에서 Fc RIIIa를 거의 발현하지 않고 Fc RIIIb35를 발현하지 않기 때문에 단핵구의 상대적으로 낮은 활성을 부분적으로 설명할 수 있습니다. THP-1 세포는 단핵구 식균 작용의 모델로 널리 사용되며 단량체 IgG에 의해 결합되는 Fc RI36을 고도로 발현합니다(반면 호중구에 의해 발현되는 Fc RIIa 및 Fc RIII는 면역 복합체에만 결합함).

따라서 우리는 표준 조건(10% FCS만 포함하고 인간 혈청 없음)에서 THP-1 세포에 의한 옵소닌 식세포작용이 Fc RI 차단제에 의해 강력하게 억제되고 Fc RIIa 차단제에 의한 제한된 억제와 함께 Fc에서는 전혀 억제되지 않음을 발견했습니다. RIII 차단(그림 2C). 이는 IgG와 Fc RI 사이의 상호작용이 THP-1 세포에 특히 중요하다는 것을 시사하며, 호중구에서 관찰되는 결과와 대조됩니다. 따라서 표준 THP-1 분석을 수정하여 분석 매체에 인간 혈청을 포함시켜 생리학적 관련성을 더 높였습니다.

추가 2.5% 인간 혈청(전체 백혈구 및 호중구 분석에서 사용됨)이 있는 경우 옵소닌 식균작용이 훨씬 적었습니다(그림 2D). 아마도 인간 혈청에 존재하는 비면역 단량체 인간 IgG의 결합 때문일 것입니다. Fc RI에. 이러한 발견은 인간 혈청의 존재 하에서 전체 백혈구 분석에서 관찰된 일차 단핵구의 낮은 식세포 활성을 추가로 설명할 수 있습니다. 소 IgG(FCS에 있음)는 인간 Fc RI37에 결합하지 않습니다.

Fc RIII의 명백한 중요성을 감안할 때 Fc RIII 상호 작용이 NK 세포를 통해 ADCC를 매개하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 우리는 ADCC 분석에서 케냐 성인들 사이에서 CSP에 대한 항체의 기능을 추가로 측정했습니다. 우리는 Fc RIIIa만을 발현하는 ADCC 리포터 세포주를 사용하는 검정에서 고반응자, 중간반응자, 저반응자(n=31)를 나타내기 위해 케냐 성인 코호트(Kanyawegi 코호트)에서 선택된 샘플을 테스트했습니다. 케냐 성인들 사이에서 자연적으로 얻은 항체는 상당한 활성을 보인 반면 멜버른 말라리아에 순진한 기증자의 항체는 그렇지 않았습니다(그림 2E, F). 이러한 결과는 CSP에 대한 항체가 Fc RIIIa를 참여시킴으로써 ADCC 활동을 촉진할 수도 있음을 시사합니다. 그 후, 확립된 탈과립 분석을 사용하여 신선한 혈액에서 일차 NK 세포의 활성을 테스트했습니다38. 케냐 성체 항체에 의해 옵소닌화된 CSP 비드와 함께 NK 세포를 배양하면 일차 NK 세포의 탈과립이 발생합니다(그림 2G, H). 활성은 시험된 샘플에 따라 다양하고 Fc RIII 결합(r= 0.538, P= 0.002, 그림 2H)과 상당한 상관관계가 있지만, CSP에 대한 IgG(r{{10} }.127, P=0.489, n=31).

항체-항원 복합체에 의한 Fc RIII 및 Fc RIIa의 직접 결합.

Fc RIIa 및 Fc RIII를 사용하여 Fc R-결합 분석법을 개발했습니다. Fc RIIa 및 Fc RIII는 항원-항체 복합체와 상호 작용할 수 있도록 이합체로 발현 및 정제되었습니다. 케냐 성인은 Fc RIIa 및 Fc RIII 이량체와 상호작용할 수 있는 CSP에 대한 항체의 유병률 및 크기가 높았습니다(그림 3A). 전반적으로 샘플(n=104)의 67.3% 및 61.5%가 Fc RIIa 및 Fc RIII 결합에 대해 양성인 것으로 간주되었습니다. 두 Fc Rs의 결합이 샘플들 사이에서 강한 양의 상관관계를 갖는 반면(r=0.71, P< 0.0001, n = 104) (Fig. 3B), some individual samples demonstrated high binding to one FcγR and low binding to the other. Furthermore, the ability of antibodies to CSP to promote direct binding of FcγRIII was significantly correlated with ADCC tested by the ADCC reporter cell line (r = 0.405, P = 0.022, Fig. 2F) and primary NK cells (r = 0.538, P = 0.002, Fig. 2H). FcγRs occur in populations as different alleles40. 

따라서 Fc RIIa(R131, H131) 및 Fc RIII(F158, V158)의 서로 다른 대립 유전자에 대해 IgG 매개 결합을 테스트했습니다39. 게시된 데이터는 이러한 대립유전자가 연구 집단에서 널리 퍼져 있음을 나타냅니다41. CSP에 대한 항체는 Fc RIIa 및 Fc RIII의 대립유전자 모두의 결합을 효과적으로 촉진했습니다. 상이한 대립형질 사이에 Fc R 결합의 높은 상관관계가 있었다; Fc RIIa의 경우 rho=0.8371, Fc RIII의 경우 rho=0.78(그림 3C, D).

기능적 항체에 의해 표적화된 CSP 영역.

우리의 이전 데이터는 CSP가 식균 작용을 촉진하는 인간 항체의 중요한 표적임을 나타냅니다 (그림 1F, G). 따라서 우리는 CSP의 세 가지 구조를 사용하여 말라리아에 노출된 개인의 기능적 항체의 표적으로서 CSP의 다른 영역을 조사했습니다. (i) NT 영역을 나타내는 합성 펩타이드(RTS, S 백신에 포함되지 않음), (ii ) 반복 영역을 나타내는 합성 펩타이드(NANP 반복), (iii) CT 영역을 나타내는 재조합 단백질. 각각의 구축물을 형광 비드(포화 농도에서)에 개별적으로 코팅하고 케냐 혈청 풀로 옵소닌화하였다. 항체는 각 구조로 코팅된 비드의 호중구 식균 작용을 효과적으로 촉진했습니다(그림 4A).

이어서 Fc RIIa 및 Fc RIII의 결합을 촉진하는 능력에 대해 CSP 영역에 대해 자연적으로 획득한 항체를 평가했습니다. 인간 항체는 Fc RIIa 및 Fc RIII의 결합을 촉진하기에 충분한 밀도로 각각의 CSP 영역에 결합하였다(도 4B). IgG 결합의 총 수준이 상이한 CSP 구축물 간에 다양하기 때문에(보충 그림 5), Fc RIIa 및 Fc RIII 결합을 IgG 반응성 수준(Fc R 결합 효율이라고 함)과 비교하여 표준화했습니다. 우리의 데이터는 NT 영역에 대한 항체가 중앙 반복부 및 CT 영역보다 Fc Rs와 결합할 가능성이 더 높다는 것을 시사했습니다(활성은 NT 대 CT 또는 NANP 영역에서 상당히 더 높았으며, 각 비교에서 P < 0.001). .

우리는 식균 작용 분석에서 특정 영역 및 전체 sporozoites에 대해 생성된 항체를 사용하여 기능적 항체의 표적으로서 다른 영역의 중요성을 평가했습니다. 우리는 먼저 토끼 항-CSP 항체가 포자소체의 식균 작용을 촉진할 수 있음을 확인했습니다. 이들 항체로 옵소닌화된 P. falciparum sporozoites는 대조군과 비교하여 높은 식세포 작용 지수(40.5%)를 나타냈다(도 4C). 이어서 P. falciparum CSP(mAb 2H8, 마우스 IgG2a 서브클래스)33의 중앙 NANPrepeat 영역에 대한 알려진 mAb가 음성 대조군 mAb 3D11에서 볼 수 있는 것보다 더 큰 상당한 식균 작용(17.4%, 그림 4D)을 촉진한다는 것을 확인했습니다. NANPrepeat 에피토프가 없는 P. berghei의 CSP를 표적으로 합니다(그림 4D). NANP 반복 영역은 면역우성 에피토프를 암호화하는 반면 항체의 표적으로서 NT 및 CT 영역의 중요성에 대해서는 알려진 바가 훨씬 적습니다.

CT 및 NT 영역에서 항체의 역할을 정의하고 인간 항체를 사용하여 데이터를 보완하기 위해 각 영역에 대한 토끼 다클론 항체를 생성하고(보충 그림 6) 이 항체를 사용하여 형질전환 PfCSPP를 옵소닌화했습니다. 호중구에 의한 식균 작용을 위한 berghei sporozoites. CT 및 NT 영역 모두에 대한 토끼 다클론 항체는 PfCSP-P의 식균 작용을 효과적으로 촉진했습니다. berghei sporozoites (그림 4E). 백신 접종 된 토끼 혈청의 CT 및 NT에 대한 IgG의 농도가 다르기 때문에 (보충 그림 6), 우리는 IgG 수준 (식균 작용 활성을 ELISA로 결정한 IgG 반응성으로 나눈 값으로 계산)과 관련하여 식균 작용 효율과 항체를 평가했습니다. 이는 N-말단 영역에 대한 항체가 CT 항체에 비해 식균작용 효율이 상당히 높다는 것을 보여주었다.

NT 영역에 대한 항체는 Fc Rs를 활성화하고 옵소닌 식균작용을 촉진하는 데 매우 효과적이었기 때문에 중첩 펩타이드 어레이를 사용하여 NT 영역에 대한 토끼 다클론 항체의 에피토프 매핑을 수행했습니다(그림 4F 및 보충 그림 6D). NT 영역이 구조화되지 않은 것으로 예측되고 시스테인을 포함하지 않기 때문에 펩티드 배열이 에피토프 매핑에 적합했습니다(PlasmoDB, https://plasmodb.org/plasmo/app/record/gene/PF3D7_0304600). 항체는 N-말단 영역과 NANP/NVPD 반복 영역 사이의 접합부에 가까운 21-aa 영역(DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ)을 덮고 있는 펩티드와 반응했습니다.

자연 노출을 통해 Fc R 상호작용 및 옵소닌 식균 작용을 촉진하는 항체 획득.

우리는 말라리아 전파 강도가 높은 지역(출라임보 지역, 보충 표 1)에서 케냐 서부에 거주하는 말라리아에 노출된 어린 아동 및 성인 집단에서 수집한 혈청 샘플을 분석했습니다. 이 환경에서 말라리아 이환율과 사망률의 대부분은 나이가 많은 어린이에게서 발생합니다.<5 years. 

대조적으로, 성인은 무증상 기생충혈증이 발생할 수 있지만 증상이 있는 말라리아 에피소드의 발달 부족으로 입증되는 상당한 면역성을 가지고 있습니다42. 호중구에 의한 CSP 비드의 옵소닌 식세포작용을 촉진할 뿐만 아니라 Fc RIIa 및 Fc RIII와 상호작용하는 CSP 특이적 항체의 능력을 측정했습니다(그림 5A-D). 각 기능적 활성을 가진 항체의 전체 유병률은 호중구 식균작용 16%(95% CI, 9.19, 26.38%), Fc RIIa 결합 20%(95% CI, 12.28, 30.84%), Fc RIII 결합 14.7%였다. (95% CI, 8.19, 24.85%). CSP, Fc R 결합 및 호중구에 의한 옵소닌 식균 작용에 대한 IgG 반응성 수준은 어린 아이들에서 낮았고 나이가 들면서 상당히 증가했습니다.

대조적으로 평생 노출된 성인은 어린이에 비해 상당히 높은 기능적 항체를 획득했습니다. 우리는 또한 CSP에 대한 기능적 항체와 비교하여 어린 아이들 사이에서 상당히 높은 유병률과 수준을 가진 혈액 단계 메로조이트의 식균작용을 촉진하는 항체를 평가했습니다(그림 5B, E, F). 이것은 포자소체에 대한 자연 획득 면역이 훨씬 더 느리게 획득되며 혈액 단계 면역과 비교하여 발달하기 위해 훨씬 더 많은 노출이 필요하다는 개념을 뒷받침합니다. 우리는 성인들 사이에서 더 높은 기능적 활성이 CSP-특이성 IgG의 더 높은 농도로부터만 발생하는지 또는 성인들 사이에서 더 높은 항체 기능 잠재력을 반영하는지 여부를 조사했습니다. 우리는 CSP에 대한 IgG 반응성과 관련된 항체 기능 활성을 분석했습니다. 이를 위해 CSP에 대한 IgG가 매우 낮은 개인(0.140의 중간 OD 미만)을 제외하고 각 개인의 IgG 수준과 관련된 기능적 활동을 계산했습니다.

흥미롭게도 이것은 상대적인 식균 작용 효율이 어린이에 비해 성인에서 상당히 높다는 것을 보여주었습니다(그림 5G)(Mann-Whitney 테스트, P=0.022). 또한, 나이와 Fc R 결합 효율(r= 0.354, Fc RIIa 결합의 경우 P= 0.031 및 Fc RIII 결합의 경우 r= 0.572) 사이에 상당한 상관관계가 있었습니다. P < 0.001).

Fc R 결합 및 세포친화성 IgG 서브클래스와 상관관계가 있는 호중구에 의한 옵소닌 식세포작용

우리는 분석을 말라리아 전파 강도가 높은 지역에서 평생 말라리아에 노출된 서부 케냐의 더 큰 면역 성인 코호트(Kanyawegi 코호트, n=104)로 확장했습니다. 우리는 이러한 성인의 상당 부분이 CSP에 대한 기능적 항체를 가질 가능성이 있다고 추론하여 기능적 옵소닌 식균 작용 활성을 결정하는 항체 요인 및 특이성의 분석을 용이하게 합니다. 실제로, 많은 샘플이 실질적인 식균 작용 및 Fc R 결합 활성을 입증했습니다. 기능별 항체 유병률은 호중구 식균작용 47.1%(95% CI, 37.6, 56.9%), Fc RIIa 결합 67.3%(95% CI, 57.6, 75.8%), Fc RIII 결합 61.5%(95% CI)였다. , 51.7, 70.5%).

호중구에 의한 옵소닌 식세포작용은 Fc RIIa 결합과 유의한 상관관계가 있었다(r {{0}}.50, P < 0.001). 및 Fc RIII 결합(r=0.43, P < 0.001)(도 6A). 다변량 회귀 분석은 Fc RIII가 호중구 옵소닌 식균 작용과 관련된 주요 요인인 반면(회귀 계수=10.15, P < 0.001, 표 1) Fc RIIa는 덜 중요하다고 제안했습니다. 이전에 우리는 이 성인 코호트에서 CSP에 대한 항체가 주로 IgG1 및 IgG3이며, 낮은 수준의 IgG2 및 매우 적은 IgG433임을 보고했습니다. IgG1 및 IgG3은 Fc RIIa 및 Fc RIII와 상호작용하여 식균작용을 촉진하는 주요 서브클래스이고, IgG2는 활성이 약하다. 케냐 성인 중 호중구 식균작용은 IgG1(r=0.32, P < 0.001), IgG2(r=0.26, P=0.007) 등과 유의한 양의 상관관계가 있었습니다. IgG3 (r=0.50, P < 0.001)로 강하게 나타납니다 (그림 6B, C, 보충 그림 7 및 보충 표 2).

IgG4(r= 0.09, P= 0.365)에서는 상관관계가 보이지 않았지만, IgG4 수치는 낮았습니다. 다변량 회귀 분석에서 IgG3는 호중구 식균 작용과 유의미하게 연관되어 있어 이 활동의 ​​주요 매개체임을 시사합니다(보충 표 3). 또한, Fc RIIa 및 Fc RIII 결합은 모두 IgG 및 IgG 서브클래스, 주로 IgG1 및 IgG3의 총 수준과 유의미한 상관관계가 있었습니다(보충 표 2 및 3). 전반적으로, 높은 식균작용 활성을 갖는 것으로 분류된 샘플(중앙값 이상으로 정의됨)은 Fc RIIa 및 Fc RIII 결합 및 IgG3의 수준이 상당히 더 높았고, 식균작용이 낮은 샘플에 비해 CSP의 모든 영역에 대해 상당히 높은 수준의 IgG를 가졌습니다. 활동(그림 6D, E).

어린이와 성인의 Chulaimbo 코호트에서도 유사한 관찰이 발견되었습니다. 옵소닌 식세포작용은 Fc R 결합, IgG1 및 IgG3과 유의한 상관관계가 있었고, Fc RIII 및 IgG3에 대한 상관관계가 더 강했습니다(보충 표 4 및 5). 우리는 RTS, S 백신의 1/2a상 임상 시험에서 이러한 분석법을 적용했습니다. 이는 호중구에 의한 옵소닌 식세포 작용과 Fc RIII 및 Fc RIIa의 결합을 촉진하는 항체가 보호되지 않은 피험자보다 보호된 피험자에서 더 높다는 것을 보여주었습니다43.

논의

우리는 면역 세포에서 발현되는 특정 Fc Rs와의 상호 작용을 통해 sporozoites에 대한 항체 매개 면역의 메커니즘과 대상을 정의하는 결과를 제공합니다. 우리의 연구 결과는 주요 포자소체 항원인 CSP를 표적으로 하는 IgG1 및 IgG3과의 Fc RIIa 및 Fc RIII 상호작용에 의해 매개되는 혈액 내 포자소체 제거에서 호중구의 핵심 역할을 뒷받침하며, 단핵구(고전적 하위 집합) 및 NK 세포의 추가 기여도를 제공합니다. 온전한 스포로조이트와 항원 코팅된 비드를 사용하여 우리는 전혈에서 식균 작용이 주로 호중구에 의해 이루어지며 단핵구에서 관찰되는 낮은 수준의 활동과 대조된다는 것을 확립했습니다. 우리는 세포 표면의 특정 Fc R을 차단하고 Fc R 이량체를 프로브로 사용하여 항원-항체 복합체에 결합하는 것과 관련된 주요 메커니즘을 정의했습니다.

이것은 Fc RIIa 및 Fc RIII의 중요성을 확인했으며, 데이터는 특히 Fc RIII의 중요성을 지적합니다. 우리는 CSP의 다른 영역, 비드에 코팅된 다른 CSP 영역 및 P. falciparum CSP를 발현하는 키메라 P. berghei sporozoites에 대한 항체를 사용하여 이 기능적 메커니즘의 항체 표적을 정의했습니다. 우리는 CSP가 이러한 기능적 항체의 주요 표적이며 CSP의 세 영역 모두 Fc R과 결합하고 식균 작용을 촉진하는 항체에 의해 표적이 될 수 있음을 확립했습니다.

특히 NT 영역에 대한 항체는 다양한 분석에서 상당한 활성을 보였고 NT 영역이 CSP 기반 백신인 RTS, S(현재 구현 연구 중) 또는 R21에 포함되지 않았기 때문에 백신 개발의 잠재적인 리드를 제공했습니다. (2상 시험에서). 또한, 우리는 자연적으로 획득한 항체가 포자소체의 옵소닌 식균 작용을 촉진할 수 있음을 확립했습니다. 기능적 항체의 획득은 연령에 따라 다르며 더 높은 수준의 옵소닌 식균 작용 활성 및 Fc RIIa 및 Fc RIII의 결합은 성인 샘플에서만 관찰되었지만 어린 아동에서는 관찰되지 않았습니다. 기능적 활성은 IgG1 및 IgG3 서브클래스와 상관관계가 있습니다.

호중구의 높은 식균 작용 활성과 단핵구의 매우 낮은 수준의 활성은 다른 Fc R의 존재 및 사용과 관련될 수 있습니다. 호중구는 식균작용의 비율이 더 높았는데, 이는 단핵구에 비해 호중구가 더 많다는 것만으로는 단순히 설명되지 않았습니다. 흥미롭게도, Fc RIIa 또는 Fc RIIIa/b 중 하나를 차단하면 호중구에 의한 식균 작용 활성이 억제되었으며, 이는 두 수용체가 식균 작용에 필요함을 시사하며, Fc RIIa 및 Fc RIII 조합에 대한 차단 항체로 더 큰 억제를 달성함으로써 뒷받침되었습니다. 차단 Fc RI는 호중구에 의한 식균 작용에 영향을 미치지 않았습니다. 몇몇 관찰은 Fc RIII의 더 높은 중요성을 제시하였다; 일반적으로 Fc RIII 차단에 의한 포자소체 식균 작용의 더 큰 억제가 있었고, 항체에 의한 Fc RIII 결합은 다변량 분석에서 Fc RIIa보다 식균 작용과 더 높은 상관관계가 있었습니다.

GPI 고정된 Fc RIIIb는 호중구에서 발현되는 가장 풍부한 Fc RIII 유형이지만, 최근 연구에 따르면 호중구는 또한 세포내 신호전달을 위한 막관통 및 세포질 도메인을 갖는 Fc RIIIa30을 발현한다고 보고되었습니다. 식균 작용의 경우 Fc RIIIa 또는 Fc RIIa를 통해 세포 내 신호 전달이 발생할 수 있으며 Fc RIIIb에 대한 결합도 중요합니다. Fc RIII와 Fc RIIa가 식균작용에서 협력적으로 작용한다면, 이는 단핵구에 의한 식균작용에서 Fc RIIa의 활성이 제한된 이유를 설명할 수 있습니다. NK 세포는 Fc RIIIa를 발현하며, 우리는 CSP에 대한 항체가 Fc RIIIa와의 상호작용을 통해 NK 활성화를 촉진할 수 있음을 확립했습니다. 이것은 전 염증성 사이토 카인의 방출뿐만 아니라 sporozoites의 살해로 이어질 수 있습니다 44.

그러나 NK 세포는 혈액 내 백혈구의 1~5%만을 차지하므로 백혈구의 50~70%를 차지하는 호중구보다 스포로조이트에 대한 면역에서 덜 두드러진 역할을 합니다. 포자소체는 또한 피부 대식세포와 간 쿠퍼 세포에 노출되며, 이는 Fc R 매개 클리어런스의 추가 메커니즘을 포함할 수 있으며 향후 연구에서 조사를 보증하지만 이러한 세포의 상대적 빈도와 Fc Rs의 발현은 혈액 내 식세포와 다릅니다. .

말라리아에서 항체 매개 옵소닌 식균 작용에 대한 기존 연구는 FCS(인간 혈청 제외)와 함께 표준 조건을 사용하여 THP-1 세포주를 모델로 주로 사용했습니다. 이러한 조건에서 우리는 Fc RI의 차단에 의해 식균 작용이 효과적으로 억제되지만 Fc RIIa 또는 Fc RIII의 차단으로 최소한의 억제가 관찰됨을 발견했습니다. 최근 연구에 따르면 THP-1 세포에 의한 옵소닌 식세포작용은 말라리아에 감염되지 않은 성인을 대상으로 한 RTS, S상 I/IIa 시험에서 보호와 상관관계가 없다고 보고되었습니다45. 우리는 Fc RI 상호작용이 인간 혈장에 제시된 단량체 IgG에 의해 억제되는 반면, 단량체 소 IgG는 인간 Fc RI에 결합하지 않기 때문에 인간 혈청의 비특이적 IgG가 THP-1 세포 식균 작용 활성을 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다. 함께, 이러한 결과는 THP-1 세포가 포자소체에 대한 옵소닌 식세포 작용을 연구하기 위한 이상적인 모델이 아님을 시사합니다.

우리는 호중구에 의한 포자소체의 식세포작용을 촉진하기 위해 Fc RIIa 및 Fc RIII와 결합하는 항체에 의해 CSP의 세 영역 모두가 표적이 될 수 있음을 확립했습니다. 주목할 점은 항원 코팅된 비드가 있는 인간 항체를 사용한 식균 작용 분석, 다른 영역으로 생성된 토끼 항체에 의한 포자소체의 식균 작용 및 인간 항체에 의한 Fc R 결합에서 볼 수 있듯이 NT 영역에 대한 항체의 상당한 활성이 있었습니다. 이러한 결과는 중앙 반복 및 CT 영역을 포함하는 것 외에도 백신 설계에서 NT 영역에 더 중점을 두는 것이 중요할 수 있음을 시사합니다. 현재 주요 백신에는 NT 영역3,46이 포함되어 있지 않습니다. 우리는 항체 에피토프를 NT와 중앙 반복 영역 사이의 접합부에 가까운 21-aa 영역에 매핑했지만 최근에 기술된 접합부 에피토프34를 포함하지 않으며 영역 I 에피토프와 구별됩니다. 간세포 침입 시 N-말단 절단47,48.

말라리아에 대한 노출을 통해 획득한 항체가 호중구에 의한 Fc R 매개 식균 작용을 촉진할 수 있다는 우리의 관찰은 이것이 높은 수준의 면역을 개발하는 개인들 사이에서 생체 내에서 발생하는 메커니즘이라는 개념을 뒷받침합니다. 케냐의 말라리아 전염률이 높은 환경에서 이러한 기능적 항체는 감염 및 중증 말라리아의 위험이 가장 높지만 성인에게 발생하는 어린 아이들 사이에서 매우 낮습니다. 이 집단에 대한 이전 연구에서는 성인 중 CSP에 대한 높은 수준의 항체가 성인 중 감염 위험 감소와 관련이 있음을 발견했습니다49. 대조적으로, 주로 어린이 집단은 말라리아 전파 강도가 우리 연구 인구보다 낮은 말리에서 연관성을 발견하지 못했습니다50. 흥미롭게도, 각각의 Fc R과의 결합 활성의 상대적인 수준은 식균 작용 활성에 영향을 미칠 가능성이 있는 개인 간에 상당히 다양했습니다. 특정 Fc R 결합의 변이는 IgG 서브클래스 프로필, 항체가 표적으로 하는 에피토프 및 IgG 글리코실화에 의해 영향을 받습니다22. IgG1 및 IgG3은 획득된 IgG 서브클래스 중에서 우세하며 Fc R-결합 활성과 상관관계가 있습니다.

이 연구에서 우리는 P. falciparum sporozoites의 주요 면역 표적인 CSP에 대한 항체의 옵소닌 식균작용 활성을 연구하기 위해 항원 코팅된 마이크로스피어의 사용을 조정했습니다. 이 접근법의 장점은 대규모 인구 연구 및 임상 시험에서 달성하기 어려운 면역학적 분석을 위해 많은 양의 스포로조이트를 생성하는 문제를 극복한다는 것입니다. CSP 코팅된 비드를 사용하여 측정된 옵소닌 식세포작용의 수준은 온전한 포자소체를 사용하여 측정된 것과 높은 상관관계가 있었습니다. 또한 이 플랫폼을 통해 CSP의 각 영역에 대한 기능적 항체 반응을 분석할 수 있었습니다. 우리는 또한 동결보존된 포자소체(생존도 > 85% 51)와 갓 해부된 포자소체를 사용하여 식균 작용을 확인했습니다.

이전 연구에서는 포자소체에 대한 항체가 잠재적인 면역 메커니즘으로서 포자소체 운동성, 세포 순회 및 간세포 침입을 억제할 수 있음을 입증했습니다. 그러나 현재 이러한 메커니즘이 임상 연구에서 Plasmodium 감염에 대한 보호와 관련이 있음을 보여주는 일관된 증거는 없습니다3. 동물의 수동 면역화 모델에서 CSP에 대한 높은 수준의 IgG는 실험적 감염으로부터 보호할 수 있습니다3,4. 그러나 시간이 지남에 따라 유사한 높은 수준의 보호가 임상 시험에서 백신 유도 항체에 의해 아직 달성되지 않았습니다. RTS, S는 매우 높은 CSP IgG 수준을 유도하지만 약간의 보호만 제공합니다53,56, 이는 더 높은 기능적 보호 활성을 갖는 항체를 생성하기 위해 다른 전략이 필요함을 시사합니다3,4. 우리의 데이터는 sporozoites의 식세포 제거에서 항체의 크게 과소 연구된 면역 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 Fc R 매개 메커니즘을 활용하는 것이 더 높은 수준의 보호를 위해 더 강력한 면역을 생성하는 전략이 될 수 있음을 시사합니다. 이는 IgG 서브클래스 반응을 최적화하고, Fc R 상호작용을 억제할 수 있는 IgM을 감소시키고, 특정 기능적 에피토프의 표적화를 개선하는 백신 전략에 의해 달성될 수 있습니다. 이러한 발전은 특정 백신 보조제 및 면역원 디자인을 사용하여 달성할 수 있습니다. 항원에 결합된 IgG와의 Fc R 상호작용은 또한 에피토프 밀도와 에피토프의 공간적 방향 및 위치에 의해 영향을 받을 수 있습니다57,58. 구조적 생물학 접근법은 이를 이해하고 백신 설계에 정보를 제공하는 데 유용할 수 있습니다. CSP의 다른 영역이 다른 면역 메커니즘을 통해 면역을 중재하는 것도 가능합니다.

이것은 Fc R 매개 메커니즘이 보존된 줄기 영역에 대한 항체에 중요하지만 헤드 영역에 대한 균주 특이적 항체에 대해서는 덜 중요하다는 인플루엔자 헤마글루티닌에 대해 나타났습니다18,21.

이러한 기능적 항체의 유도와 보호와의 상관관계를 조사하는 향후 연구는 RTS, S 및 기타 CSP 기반 백신의 2상 및 3상 시험에서 보증됩니다. 우리는 RTS, S56의 I/IIa상 시험에서 초기 연구를 수행했습니다. 이는 RTS, S 백신접종이 Fc RIIa 및 Fc RIII의 결합뿐만 아니라 호중구에 의한 식균 작용을 촉진하는 CSP에 대한 항체를 실제로 유도한다는 것을 확립했습니다. 중요하게도, 이러한 기능적 활동은 말라리아 감염으로부터 보호받은 피험자에서 감염이 발생한 피험자보다 훨씬 더 높았습니다43. CSP는 기능적 항체를 포함하여 후천적 인간 면역의 표적이지만, 현재 포자소체에 대한 자연적으로 획득된 면역과 백신 유도 면역의 잠재적 차이에 대한 이해가 제한적입니다. 이러한 차이점에 대한 추가 연구는 백신 개발에 정보를 제공하는 중요한 통찰력을 밝힐 수 있습니다.

요약하면, 우리의 연구는 혈액 내 포자소체에 대한 Fc R 매개 면역의 핵심 메커니즘과 표적을 정의했습니다. 우리의 연구 결과는 포자소체의 식세포 제거에서 호중구의 주요 역할을 지적하고, Fc RIIa 및 Fc RIII에 대한 중요한 역할을 정의하고, 이 기능적 활동의 핵심 표적으로 CSP를 확립했습니다. 단핵구는 또한 식균 작용에 기여하지만 낮은 활성을 가지며 항체는 또한 Fc RIIIa의 참여를 통해 NK 세포 ADCC 활성을 촉진할 수 있습니다. 면역을 매개하는 메커니즘을 이해하고 정의하는 것은 보다 효과적인 백신 개발을 가능하게 하는 데 중요합니다. 향후 연구는 임상 시험에서 현재 백신이 이러한 기능적 활동을 가진 항체를 얼마나 효과적으로 생성하는지 조사해야 합니다. 백신 개발에서 이 지식을 활용하는 것은 말라리아에 대한 더 높은 수준의 보호를 제공하는 강력한 면역 반응을 생성하기 위한 효과적인 전략일 수 있습니다.

행동 양식

인구 및 윤리 성명을 연구하십시오.

케냐 Kisumu County의 Kanyawegi 하위 지구에 거주하는 말라리아에 노출된 건강한 무증상 성인(n=104, 18~79세, 26.9% 남성)의 혈장이 8월 2일에 수집되었습니다.007 (칸야웨기 코호트)59; 어떤 참가자도 말라리아 증상이 없었고 46.15%는 무증상 P. falciparum parasitemia(현미경으로 감지됨)가 있었습니다. 케냐 Kisumu County의 Chulaimbo subdistrict에 거주하는 건강하고 무증상의 어린 아동 및 성인(n=75, 어린이의 경우 0.3–5.9세, 성인의 경우 19.6–69.2세, 55% 여성)의 혈장은 2007년 2월~3월에 수집됨(출라임보 코호트)42; 코호트 세부 사항은 보충 표 1에 요약되어 있습니다. 혈액 채취 당시 전파 강도는 상대적으로 높았습니다(10세 이하 어린이의 무증상 기생충 유병률은 70-80%)60. 전체 백혈구, 호중구, 단핵구 및 NK 분석에 사용하기 위해 건강한 남성 및 여성 성인으로부터 혈액을 수집했습니다.

Alfred Hospital Human Research and Ethics Committee(프로토콜 385-18), 미국 Case Western Reserve University의 Cleveland 대학 병원 인간 조사를 위한 기관 검토 위원회(프로토콜 02-04-04) 및 케냐 케냐 의료 연구소의 윤리 검토 위원회(프로토콜 SSC867). 모든 연구 참가자 또는 부모 또는 법적 보호자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.

항원.

이 연구에 사용된 항원은 모두 P. falciparum CSP(Gene ID PF3D7_0304600; www.plasmodb.org)의 3D7 참조 서열을 기반으로 했습니다. 재조합 전체 길이 CSP는 Sanaria(Sanaria, Rockville, USA)에서 구입했습니다.

단백질은 아미노산 잔기 50에서 시작하는 Pichia pastoris에서 발현되었으며 (NANP)22 반복 및 (NVPD)4 반복을 포함합니다. CSP의 C-말단 영역(CT) 및 CSP의 N-말단 영역과 C-말단 영역의 융합(N + C)을 HEK293F 세포(호주 Invitrogen에서 구입)를 사용하여 재조합 단백질로 생성하였다. LifeTein(LifeTein, 미국 뉴저지).

다른 CSP 단백질에 대한 항체 생성.

Walter Eliza Hall Institute 항체 시설에서 수행; Walter and Eliza Hall Institute의 동물 윤리 위원회에서 승인을 받았습니다(참조: 2020.019, 2014.009). 간략하게, 토끼(n=2)는 다음 항원 중 하나로 예방접종되었습니다: 전장 CSP, N + C 재조합 단백질 및 NT 펩티드. 각 토끼는 0일, 28일 및 56일에 프로이트 보조제와 함께 3회 용량의 항원(200μg/용량)을 투여 받았습니다. 68일에 세 번째 백신 접종 후 토끼 혈청을 수집하고 토끼 IgG를 단백질 A로 정제했습니다. -긍정적인 선택. 토끼 항-N + C IgG는 처음에 테스트되었으며 N-말단 영역이 아닌 CSP의 C-말단 영역을 주로 인식하는 것으로 나타났습니다(보충 그림 6A). 토끼 항-NT IgG는 CSP의 N-말단 영역을 인식하는 것으로 확인되었다(보충 그림 6B). NT 및 CT 항체 모두 전장 CSP와 반응했습니다(보충 그림 6C). 단클론 항체(mAb) MGG434는 감쇠된 스포로조이트로 반복 감염시킨 후 개체로부터 분리하여 확립된 접근법을 사용하여 HEK293 세포에서 재조합 IgG1 항체로 발현 및 정제했습니다. mAb는 특이성을 확인하기 위해 재조합 CSP에 대해 테스트되었습니다. Anti-CSP mAb 2A1061은 대조군 항체로서 Fc R 상호작용을 억제하기 위해 Fc 영역62에서 LALA 돌연변이로 발현되었습니다.

말초 혈액에서 PBMC, 호중구 및 전체 백혈구 분리.

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 호중구는 이전에 확립된 방법63,64을 사용하여 말초 혈액에서 분리되었습니다. 간략하게, 건강한 공여자의 말초 혈액을 Ficoll 구배 원심분리를 사용하여 분리했습니다. PBMC를 포함하는 Buffy 층과 호중구를 포함하는 RBC 펠릿을 별도로 수집했습니다. PBMC 분리를 위해 Buffy 층에서 채취한 세포를 PBS-1% NCS로 4도에서 4회 세척했습니다. 이어서 PBMC를 RPMI1640-10% 태아 소 혈청(FCS)에 재현탁하고 얼음에 보관했습니다. 호중구는 Ficoll 구배 원심분리 후 RBC 펠렛으로부터의 덱스트란 분할에 의해 강화되었고, 저장성 용해63가 뒤따랐습니다.

전체 백혈구는 덱스트란 분할을 통한 초기 농축에 이어 저장성 용해에 의해 전혈로부터 분리되었습니다. 분리된 호중구 및 전체 백혈구를 5 x 105 neutrophils/ml 또는 5 x 106 식세포(단핵구 및 호중구)/ml로 조정한 다음 10% FCS 및 2.5% 열 불활성화 인간 혈청이 보충된 RPMI1640에 재현탁하고 얼음에 보관했습니다. 세포는 Fc RI(Clone 10.1 BD Bioscience, 1:50), Fc RIIa(Clone 8.26, BD Bioscience, 1:25) 및 Fc RIII(Clone 3G8 BD Bioscience, 1:50)에 대한 항체를 사용하여 Fc R 발현에 대해 표현형을 결정했습니다. . CD14에 대한 항체(Clone M5E2, BD Bioscience, 1:20)도 단핵구 하위 집합을 결정하는 데 사용되었습니다.

THP-1 셀 유지 관리.

THP{0}} promonocytic 세포주(ATCC에서 공급)의 세포는 0.002 mol/L L-글루타민, 0.01 mol/L HEPES와 함께 RPMI-1640에서 유지되었습니다. , 및 10% 태아 송아지 혈청(FCS). 세포 밀도를 면밀히 모니터링하고 1 x 105 ~ 1 x 106 세포/ml로 유지했습니다. 세포는 6일마다 또는 세포 밀도가 1 x 106개 세포/ml에 도달할 때 통과되었습니다.

P. berghei sporozoites의 배양 및 분리.

Anopheles stephensi 모기는 P. berghei ANKA 기생충 계통을 발현하는 키메라 CSP에 감염된 Swiss Webster 마우스에 먹이를 주었습니다. 감염성 혈액 식사 후 18-22일에 침샘을 해부하고 PBS에서 균질화했습니다. 스포로조이트를 70-μm 조직 여과기(Falcon)에 통과시키고 혈구계산기를 사용하여 계수했습니다.

P. falciparum merozoites의 배양 및 분리.

P. falciparum의 D10 계통은 0.5% Albumax(Life Technologies) 및 0.18% NaHCO3가 보충된 RPMI-HEPES에서 유지되었습니다. 배양은 10% 기생충혈증 이하로 유지되었고 소르비톨 처리에 의해 동기화되었습니다. merozoites는 이전에 발표된 방법을 사용하여 분리되었습니다 32. 간략하게, 감염된 적혈구의 schizont 단계는 자기 정제에 의해 강화되었고 transepoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino) butane (E64, Sigma -Aldrich) 8시간 동안 성숙한 분열체를 1.2-μm 필터를 통해 통과시켜 메로조이트를 방출합니다. 메로조이트는 옵소닌 식균 작용 분석을 위해 5 x 107/ml로 조정하거나 Fc R-결합 분석을 위해 ELISA 플레이트에 코팅하기 위해 1 x 107/ml로 조정했습니다.

형광 라텍스 비드에 대한 항원의 공유 결합.

2.0-μm 크기의 아민 변형 형광 라텍스 비드(Sigma-Aldrich)를 400 μl의 PBS로 2회 세척하고 2000 × g에서 3분 동안 원심분리하였다. PBS 중 8%의 글루타르알데히드를 비드에 첨가하고 4도에서 밤새 롤러에서 배양하였다. PBS로 세척한 후, 1 mg/ml의 재조합 CSP를 비드에 첨가하고 6시간 동안 볼텍스에서 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 원심분리하고 200 μl의 에탄올아민에 재현탁하고 와류에서 30분 동안 인큐베이션하여 나머지 아민 그룹을 모두 소멸시켰다. 이어서 비드를 PBS로 세척하고 1% BSA로 밤새 4도에서 차단했습니다. 항원 코팅된 비드는 응집을 줄이기 위해 4도에서 20분 동안 초음파 처리 수조에 보관한 후 5 × 107 비드/ml로 조정했습니다. 비드를 0.1% SDS 및 0.02% NaN3의 존재 하에 4도에서 저장하였다.

옵소닉 식균작용 검정.

옵소닉 식균 작용 분석은 아래 및 보충 표 6에 설명된 대로 다양한 목적을 위해 다양한 설정에서 수행되었습니다.

분리된 세포를 이용한 P. falciparum 및 P. berghei sporozoites의 옵소닌 식균작용을 위해, 냉동보존된 P. falciparum sporozoites는 PATHMVI(Samaria, Rockville, USA)에서 제공되어 액체 질소에 보관되었으며, 37도에서 40초 동안 해동되었습니다. 제조업체의 사용 설명서. PfCSP12를 발현하도록 형질감염된 갓 해부된 P. berghei sporozoites도 이 연구에 사용되었습니다. 실험에서 P. falciparum 및 P. berghei sporozoites에 대해 동일한 접근 방식을 사용했습니다. 스포로조이트를 얼음 위에서 1시간 동안 10 μg/ml 브롬화 에티듐으로 염색한 다음 RPMI-HEPES로 3회 세척했습니다. 옵소닌화를 위해 50000 sporozoites를 1 ul의 시험 혈청과 함께 얼음에서 1시간 동안 배양한 다음 RPMI-1640에서 5 × 105 cells/ml의 농도로 5000개의 호중구와 공동 배양했습니다. 말라리아에 순진한 멜버른 기증자의 FCS 10% 및 열 불활성화 인간 혈청 2.5%로 보충되었습니다. 호중구 추가로 인한 부피 변화를 설명하고 식균 작용 동안 동일한 테스트 항체 농도를 유지하기 위해 추가 1ul의 테스트 혈청도 추가되었습니다.

식균작용이 일어나도록 5% CO2 인큐베이터에서 37도에서 15분 동안 공동 배양하였다. 세포를 4도에서 원심분리하고 차가운 PBS-1퍼센트 NCS–0.04퍼센트 NaN3(FACS 버퍼)로 세척하여 식균작용 활성을 중지했습니다. 식균 작용의 수준은 유동 세포 계측법(FACS CantoII, BD Biosciences)으로 정량화하고 FlowJo 소프트웨어(버전 10)를 사용하여 분석했습니다. 데이터는 식세포 작용 지수(PI)로 제시되었으며, 이는 포자소체를 포식한 호중구(보충 그림 4A) 또는 THP-1 세포(보충 그림 1A)의 비율로 정의되었습니다. Kanyawegi 및 Chulaimbo 코호트에 대한 실험의 경우, PI는 양성 대조군에 대한 각 샘플에 대한 PI의 백분율로 정의되는 상대 식균 작용 지수(RPI)로 추가로 표준화되었습니다. Unopsonized sporozoites는 모든 분석에서 음성 대조군으로 포함되었습니다. 표준 호중구 식균 작용 분석에는 말라리아에 노출되지 않은 기증자의 2.5% 인간 혈청이 포함되었습니다. 표준 THP-1 식균 작용 분석은 10% FCS를 포함하는 확립된 방법을 사용하여 수행되었습니다.

분리된 세포를 사용하는 항원 코팅 비드 또는 메로조이트의 식균 작용을 위해, 식균 작용 분석은 수정 32로 이전에 발표된 방법에서 채택되었습니다. 간략하게, 1 x 106 항원 코팅 형광 라텍스 비드 또는 메로조이트는 1시간 동안 혈청 샘플로 옵소닌화되었습니다. 식균 작용을 위해 1 × 10 5 호중구와 함께 배양하기 전에 비드 또는 메로조이트를 RPMI-1640로 세 번 세척했습니다. 37도에서 비드의 경우 20분, 메로조이트의 경우 10분 동안 식균작용이 일어나도록 한 후 세포를 300 x g 및 4도에서 4분 동안 FACS 완충액으로 세척했습니다. 형광 비드 또는 메로조이트를 포함하는 호중구의 비율을 유동 세포 계측법(FACS CantoII, BD Biosciences)으로 평가하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석했습니다(보충 그림 4A). 일부 분석에서는 THP-1 세포주를 10% FCS를 포함하는 표준 조건과 함께 사용했습니다. 다른 분석에서는 말라리아에 감염되지 않은 멜버른 기증자의 추가 2.5% 인간 혈청을 비교에 사용했습니다.

전혈 백혈구 제제를 사용하는 항원 코팅 비드 또는 P. berghei sporozoites의 식균 작용을 위해 CSP 코팅 비드는 CSP에 대해 생성된 토끼 다클론 항체로 옵소닌화되었습니다. 식균작용은 5% CO2 인큐베이터에서 37도에서 20분 동안 1 x 106 식세포(단핵구 및 호중구)를 포함하는 전혈의 총 백혈구 분획과 옵소닌 처리된 비드를 동시 배양하여 수행되었습니다. 이러한 실험은 옵소닌화를 위한 가변 항체 농도 또는 가변 비드-대-식세포 비율을 사용하여 수행되었습니다. 전체 백혈구 제제에 의한 P. berghei sporozoites의 옵소닌 식세포 작용을 테스트하기 위해, 5 × 105 sporozoites를 1:100 희석으로 말라리아에 노출된 케냐 성인 혈청 풀로 옵소닌화한 다음 5 × 105를 포함하는 전체 백혈구와 공동 배양했습니다. 104개의 식세포. 세포를 4도에서 4분 동안 원심분리하여 식세포 활성을 중지시키고 다른 식세포(단핵구 및 호중구)를 추가 분석을 위해 형광 결합 항체로 표지했습니다. 단핵구는 항-CD14-Alexa647(MφP9 BD Bioscience, 1:33) 및 항-CD16- BV421(3G8 BD Bioscience, 1:20)로 표지되었고, 호중구는 항-CD66bAPC로 표지되었습니다. -H7(G10F5 BD 바이오사이언스, 1:33).

FACS 분석을 위해 포식된 비드를 PEhigh 및 FSChigh 집단으로 선택했습니다. 단핵구 및 호중구에 의해 포식된 비드는 CD14 및 CD66b 염색을 사용하여 추가로 구별되었습니다. 단핵구와 호중구에 의해 포식된 비드의 수는 형광 강도를 기준으로 계산되었습니다(보충 그림 8). 이 숫자는 식세포(단핵구 및 호중구)의 총 수를 사용하여 추가로 표준화되었으며 100개의 식세포당 비드로 표현되어 다양한 세포 유형의 식균 작용 속도를 나타냅니다.

Fc 수용체를 차단하거나 CSP 항체를 고갈시켜 옵소닌 식균 작용을 억제하기 위해 특정 차단 항체를 사용하여 다른 Fc R을 차단했습니다. Fc RI는 50µg/ml 차단 항체(mAb 10.1 Merck)로 차단되었고, Fc RIIa는 50µg/ml 차단 항체(mAb IV.3)로 차단되었으며, Fc RIII는 50µg/ml 차단 항체(mAb 3G8)로 차단되었습니다. . THP-1 세포와 호중구를 각 Fc R 차단제로 각각 4도에서 30분 동안 처리한 후 면역성 성인의 혈청으로 옵소닌화된 CSP 코팅 라텍스 비드와 공동 배양했습니다. 식균 작용 분석은 위에서 언급한 대로 수행되었습니다. 획득한 인간 항체에 의해 매개되는 식균 작용을 촉진하는 CSP에 대한 항체의 역할을 평가하기 위해 케냐 성인 혈청 풀을 20ug/ml 농도의 재조합 CSP 및 NT 영역 펩티드와 함께 30분 동안 사전 배양하여 CSP 특이적 식균 작용 분석에 사용하기 전에 항체.

ELISA로 총 IgG 및 IgG 서브클래스를 측정합니다.

재조합 단백질에 대한 총 IgG 및 IgG 하위 클래스는 이전에 설명한 대로 ELISA로 측정했습니다. 간략히 설명하면, CSP를 96-웰 Maxisorp 마이크로타이터 플레이트(NUNC, Roskilde, Denmark)에 1μg/ml로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양했습니다. 플레이트를 0.05% Tween20(PBS-Tween)을 포함하는 PBS로 세척하고 PBS-1% BSA로 37도에서 2시간 동안 차단했습니다. 인간 혈청 또는 토끼 IgG를 원하는 농도로 희석하고 이중으로 플레이트에 첨가했습니다. 전체 IgG 검출을 위해, HRP-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG를 1:2500 희석으로 사용하고 이어서 발색을 위한 ABTS 기질을 사용하였다. 1% SDS로 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. IgG 서브클래스 검출을 위해 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대한 mAb를 1:1000 희석으로 사용한 다음 HRP 접합 염소 항-마우스 IgG를 1:2500 희석으로 사용했습니다. 마지막으로 발색을 위해 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB, Life Technologies) 기질을 사용하고 1M H2SO4로 반응을 정지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하였다. CSP에 대한 IgG 반응성이 높은 케냐 성인 혈청 풀을 양성 대조군으로 사용했습니다.

NT 영역의 항체 에피토프 매핑.

CSP(3D7/NF54 균주)의 선형 서열을 나타내는 70 비오티닐화된 15-mer 펩타이드를 포함하는 어레이가 합성되었습니다(Mimotopes, Australia). 각 펩타이드는 CSP 펩타이드 서열과 비오틴 태그(고정화를 돕기 위해 추가됨) 사이에 짧은 SGSG 스페이서가 있고 펩타이드 사이에 12aa 오버랩이 있습니다. 항체 분석은 이전에 확립된 접근법65,66을 사용하여 수행되었습니다. 웰당 50 ul의 펩티드를 1 ug/ml 스트렙타비딘(Sigma-Aldrich)으로 사전 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가했습니다. 비오틴-HRP를 사용하여 스트렙타비딘 상의 잔류 비오틴 결합 부위를 정량화하여 펩티드 결합의 포화를 달성하고 확인했습니다. 그 다음 10% 우유로 차단하고 Tween 0.05%가 포함된 PBS로 세척했습니다. CSP의 NT 영역에 대해 생성된 토끼 다클론성 IgG를 1:500의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 토끼 IgG 결합의 수준은 HRP접합 염소 항-토끼 IgG(Millipore, 1:2500)에 의해 검출되었고 TMB 기질을 사용하여 정량화되었다.

Fc 수용체 결합 검정.

Fc 수용체 결합 분석은 약간의 수정을 통해 이전에 발표된 방법에서 채택되었습니다. 요약하면, 1ug/ml 농도의 재조합 CSP 5{{20}}ul를 Maxisorp™ 플레이트에 코팅하고 4℃에서 밤새 배양한 다음 PBS-Tween으로 3회 세척했습니다. 그런 다음 플레이트를 200ul의 1% BSA-PBS로 37도에서 2시간 동안 차단한 다음 PBS-Tween으로 3회 세척했습니다. 혈청 샘플을 PBS-BSA에서 1:50으로 희석하고 각 샘플 50ul를 이중으로 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 PBS-Tween에서 3회 세척했습니다. 비오틴 결합 재조합 가용성 Fc RIIa H131 엑토도메인 이량체(0.2 ug/ml) 또는 Fc RIII V158 엑토도메인 이량체(0.1 ug/ml) 50 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 37도에서 1시간 동안 배양한 다음 PBS로 3회 세척했습니다. -트윈. 일부 검정의 경우, Fc RIIa의 R131 대립유전자와 Fc RIII의 F158 대립유전자가 동일한 농도로 사용되었습니다. 그 다음 PBS-BSA에서 37도에서 1시간 동안 2차 HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘(Thermo Fisher Scientific, 1:10,000)에 이어 PBS-Tween으로 3회 세척했습니다.

마지막으로 50 ul의 TMB 액체 기질을 20분 동안 첨가하여 효소 반응성을 측정하였다. 50ul의 1M H2SO4 용액으로 반응을 중단시켰다. 결합 수준은 450 nm에서 광학 밀도로 측정되었습니다. 말라리아에 노출된 케냐 성인(1:100)의 풀링된 인간 IgG와 CSP에 대한 토끼 다클론성 IgG(1:500)를 양성 대조군으로 사용했습니다. 순진한 멜버른 성인(1:50)의 개별 혈청을 음성 대조군으로 사용했습니다.

Fc 수용체 결합 분석은 약간의 수정을 통해 이전에 발표된 방법에서 채택되었습니다. 요약하면, 1ug/ml 농도의 재조합 CSP 5{{20}}ul를 Maxisorp™ 플레이트에 코팅하고 4℃에서 밤새 배양한 다음 PBS-Tween으로 3회 세척했습니다. 그런 다음 플레이트를 200ul의 1% BSA-PBS로 37도에서 2시간 동안 차단한 다음 PBS-Tween으로 3회 세척했습니다. 혈청 샘플을 PBS-BSA에서 1:50으로 희석하고 각 샘플 50ul를 이중으로 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 PBS-Tween에서 3회 세척했습니다. 비오틴 결합 재조합 가용성 Fc RIIa H131 엑토도메인 이량체(0.2 ug/ml) 또는 Fc RIII V158 엑토도메인 이량체(0.1 ug/ml) 50 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 37도에서 1시간 동안 배양한 다음 PBS로 3회 세척했습니다. -트윈. 일부 검정의 경우, Fc RIIa의 R131 대립유전자와 Fc RIII의 F158 대립유전자가 동일한 농도로 사용되었습니다. 그 다음 PBS-BSA에서 37도에서 1시간 동안 2차 HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘(Thermo Fisher Scientific, 1:10,000)에 이어 PBS-Tween으로 3회 세척했습니다. 마지막으로 50 ul의 TMB 액체 기질을 20분 동안 첨가하여 효소 반응성을 측정하였다. 50ul의 1M H2SO4 용액으로 반응을 중단시켰다. 결합 수준은 450 nm에서 광학 밀도로 측정되었습니다. 말라리아에 노출된 케냐 성인(1:100)의 풀링된 인간 IgG와 CSP에 대한 토끼 다클론성 IgG(1:500)를 양성 대조군으로 사용했습니다. 순진한 멜버른 성인(1:50)의 개별 혈청을 음성 대조군으로 사용했습니다.

항체 의존성 세포 매개 세포 독성 분석.

선택된 혈청 샘플의 ADCC-유도 활성은 제조업체의 지침에 따라 ADCC Reporter Bioassay 키트(Promega, Cat. No. G7010)를 사용하여 다음과 같이 수정하여 평가했습니다. CSP-코팅된 비드를 1:50 희석에서 인간 혈청으로 옵소닌화하였다. 리포터 세포는 10:1 비율로 CSP 코팅된 형광 비드와 함께 웰당 72000 세포로 도금되었습니다. 6시간 배양 후, 화학발광 기질을 첨가하고 발광을 검출하고 40분 동안 약 5분마다 정량화했습니다(CLARIOstar, BMG LabTech). 제시된 데이터는 화학발광 기질을 첨가한 후 약 30분 후에 기록되었습니다.

ADCC의 수준은 이전에 발표된 방법38을 사용하여 일차 NK 세포에서도 확인되었습니다. 간단히 말해서, NK 세포를 포함하는 PBMC는 10% FCS 및 100 IU/ml의 인터루킨-2(IL{{5 }}) 하룻밤. CSP-코팅된 비드를 1:50 희석에서 인간 혈청으로 옵소닌화한 다음, 항-CD107a-AF647(H4A3, BD Bioscience)의 존재 하에 프라이밍된 PBMC와 함께 1시간 동안 공동 배양하였다. 이어서, 브레펠딘 A(Sigma-Aldrich) 및 단백질 수송 억제제(BD Bioscience)를 각각 5 ug/ml 및 1/1500의 농도로 공동 배양물에 첨가하고, 3시간 동안 계속 배양하였다. 배양 후, 세포를 4도에서 4분 동안 300 × g에서 원심분리하고 항-CD3-APC-H7(SK7, BD Bioscience, 1:33), 항-CD56-로 염색했습니다. PE-Cy7(B159, BD Bioscience, 1:33) 및 항-CD16-BV421(3G8, BD Bioscience, 1:20). NK 세포는 CD3-, CD56 + 림프구로 정의되었고 ADCC 수준은 유세포 분석법(LSR Fortessa X-20, BD Bioscience)에 의해 CD107a 염색이 있는 NK 세포의 백분율로 정량화되었습니다(보충 그림 9).

데이터 분석.

통계 분석은 Prism 버전 7(GraphPad Software Inc) 및 STATA 버전 13.1(StataCorp)을 사용하여 수행되었습니다. 통계 테스트 및 P 값은 그림 범례에 표시됩니다. 식균 작용, Fc R 결합 및 IgG 수준 간의 상관 관계는 Spearman의 상관 계수 및 다중 선형 회귀 모델을 사용하여 평가되었습니다. 식균 작용, Fc R 결합 및 연령 그룹에 걸친 IgG 수준 및 상이한 옵소닌화 조건의 수준의 차이는 다중 비교를 통한 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었습니다.

CSP에 대한 총 IgG 역가와 무관하게 항체 기능 활성을 평가하기 위해, Fc R 결합 및 식균 작용 효율을 CSP에 대한 IgG 반응성에 상대적인 Fc R 결합 수준 또는 옵소닌 식균 작용 수준으로 계산하였다. Spearman의 상관 관계 및 Mann-Whitney 테스트는 어린이와 성인의 항체 기능 효율성을 분석하는 데 사용되었습니다. 양방향 ANOVA는 전체 백혈구 분석에서 호중구와 단핵구에 의한 옵소닌 식균 작용을 비교하는 데 사용되었습니다. Kruskal–Wallis 테스트와 Mann–Whitney 테스트는 정규 분포가 아닌 데이터에 대해 수행되었습니다. 모든 통계 분석은 양면 테스트로 수행되었습니다. 반응성이 말라리아 비노출 대조군 값의 평균 + 3 표준 편차보다 큰 경우 샘플을 항체 양성으로 분류했습니다.

보고 요약.

연구 설계에 대한 추가 정보는 이 문서에 링크된 Nature Research Reporting Summary에서 확인할 수 있습니다.

데이터 가용성.

그림을 생성하는 데 사용되는 데이터는 요청 시 작성자에게 제공됩니다. 이 논문의 준비 과정에서 분석되고 그림과 표로 제시된 데이터베이스는 합당한 요청과 관련 윤리 위원회(임상 데이터의 경우)의 동의가 있는 경우 해당 저자가 사용할 수 있습니다. P. falciparum 시퀀스는 PlasmoDB.org의 공개 데이터베이스에서 얻었습니다.

수신: 2019년 9월 2일; 수락: 2021년 2월 24일.

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감사의 말

Chulaimbo 코호트와 Kanyawegi 코호트의 샘플을 제공한 케냐 의학 연구소의 연구 참가자와 직원에게 감사드립니다. P. falciparum sporozoites 및 mAb 2H8은 PATH Malaria Vaccine Initiative(MVI)에서 친절하게 제공했습니다. mAb 3D11 및 하이브리도마는 Instituto de Medicina Molecular의 Miguel Prudêncio가 친절하게 제공했습니다. P. falciparum CSP를 발현하는 P. berghei 기생충은 Leiden University Medical Center의 Chris Janse, Shahid Khan 및 Hans Kroeze가 제공했습니다. 항원과 형광 비드의 공유 결합은 RMIT의 Paul Ramsland, Burnet Institute의 Paul Sanders, Baker Heart and Diabetes Institute의 Geoffrey Pietersz에 의해 크게 뒷받침되었습니다.

또한 유용한 피드백과 조언을 주신 Burnet Institute의 Michelle Wong과 정맥 분석가인 Emily Locke에게도 감사드립니다. 이 연구는 또한 AMREP 유세포분석 핵심 시설에 의해 지원되었습니다. 이 작업은 호주 국립 보건 의료 연구 위원회(NHMRC)(JG Beeson에 대한 프로그램 보조금 및 선임 연구 펠로우십, JGB, GI McFadden 및 PM Hogarth에 대한 프로젝트 보조금, MJB에 대한 경력 개발 펠로우십), PATH-MVI의 지원을 받았습니다. (JGB에 부여), CASS 재단(GF에 부여), GI McFadden에 대한 호주 연구 위원회 수상자 펠로우십, 말라리아 연구 우수성을 위한 NIH 국제 센터(U19AI129326). Burnet 연구소는 NHMRC for Independent Research Institutes Infrastructure Support Scheme 및 Victorian State Government Operational Infrastructure Support의 지원을 받습니다. JGB, GF, MJB, JAC, SC 및 LK는 NHMRC Australian Centre for Research Excellence in Malaria Elimination의 회원입니다.

저자 기여

JGB, GF 및 BDW는 PMH, GIM, LK, JAC 및 기타 저자의 의견을 바탕으로 연구 설계를 주도했습니다. GF, BDW, LK, PB, DML, SC, VM 및 AC는 실험을 수행하고 결과를 해석했습니다. GF, PB 및 JAC는 JGB, LK 및 MJB의 입력으로 데이터 분석을 수행했습니다. JGB, BDW, PMH, JWK, AED, KC, GIM, AC, VM, DRD 및 RJC는 주요 시약, 데이터 및/또는 리소스를 제공하거나 생성했습니다. GF, JGB, LK, JAC 및 DRD는 다른 모든 공동 저자의 의견을 받아 논문 준비에 기여했습니다.

경쟁 관심

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

피어 리뷰 정보

Nature Communications는 Katie Ewer, Photini Sinnis 및 다른 익명의 리뷰어에게 이 작업의 피어 리뷰에 기여한 것에 감사드립니다. 피어 리뷰어 보고서를 사용할 수 있습니다.

게시자 주

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오픈 액세스

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