MiR-103a-3p 침묵은 UMOD/TRPV5 축을 활성화하여 쥐 신장의 옥살산칼슘 침착을 개선합니다.
Jul 19, 2024
균형 유지칼슘(Ca2+) 대사신장에서 중요한 것은신장 결석 형성 방지. 기능적으로는 이 과정에 참여하는 마이크로RNA(miRNA)가 공개되어야 한다. 우리는 다음을 통해 NRK-52E 세포 손상을 유발했습니다.옥살산염 처리. 옥살레이트 유발 세포에서 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널 서브패밀리 V 멤버 5(TRPV5)의 역할은 TRPV5 과발현 형질감염, qRT-PCR, 웨스턴 블롯, MTT 및 결정 접착 검출을 통해 연구되었습니다. 손상된 세포에서 유로모듈린(UMOD) 발현을 확인한 후, 공동면역침전(CoIP) 및 세포 표면 비오티닐화 분석을 통해 TRPV5와 UMOD 사이의 상호작용을 확인했습니다. 옥살산염 유발 세포의 생존력, 결정 부착 및 Ca{9}} 농도에서 UMOD 조절 TRPV5의 검증이 수행되었습니다. miRNA 표적화 UMOD를 확인하기 위해 생물정보학 분석과 루시퍼라제 분석이 사용되었습니다. miR-103a-3p 조절 UMOD/TRPV5 축의 역할은 구조 실험을 통해 감지되었습니다. 우리는 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학을 통해 생체 내에서 miR-103a-3p/ UMOD/TRPV5 축을 조사하기 위해 에틸렌 글리콜(EG)을 처리한 쥐 모델을 구축했습니다. (IHC). TRPV5의 상향 조절은 세포 생존력을 향상시키고 CaOx 접착을 억제함으로써 옥살산염으로 인한 손상으로부터 NRK-52E 세포를 보호했습니다. UMOD는 옥살산염 유발 세포에서 고갈되었으며 TRPV5와 긍정적으로 상호 작용했습니다. UMOD 침묵은 옥살산염 유발 세포에 대한 TRPV 과발현의 효과를 역전시켰습니다. miR-103a-3p는 UMOD를 표적으로 삼았고 옥살산염 유도 세포에서 UMOD/TRPV5 축의 조절을 매개했습니다. miR-103a-3를 하향 조절하면 EG로 유발된 CaOx가 완화됩니다.신장 조직에 침착UMOD/TRPV5 축을 활성화하여 생체 내에서. miR-103a-3p는 UMOD/TRPV5 축을 활성화하여 쥐 신장의 CaOx 침착을 개선합니다.
1. 소개
요로결석은 가장 흔한 질병 중 하나입니다.비뇨기과의 흔한 질병, 신장의 소변에서 과포화 결정이 침전되어 발생합니다 [1]. 요로결석은 악성 종양만큼 공격적이지는 않지만 높은 발병률과 재발률로 인해 오랫동안 인간의 건강에 심각한 영향을 미쳐 왔습니다[2]. 연구에 따르면 요로 결석의 발병은 다인성이며 유전학, 신진 대사, 환경 기후 및 생활 습관과 관련이 있음이 확인되었습니다 [3, 4]. 수산칼슘(CaOx) 결석이 이 질병의 대부분을 차지하며, Ca{4}}함유 결석이 있는 대부분의 환자는 고칼슘뇨증을 동반합니다[5]. 물리화학적 연구에 따르면 소변 내 CaOx 포화도는 Ca2+ 농도와 관련이 있으며, 소변 내 칼슘 증가는 Ca2+-함유 신결석증 형성을 유발하거나 촉진한다는 사실이 확인되었습니다[6]. 신장 결석은 고혈압, 만성 신장 질환, 말기 신장 질환으로 이어질 수 있습니다. 연구에 따르면 특정 약리학적 개입과 생활 방식 및 영양 변화에 대한 권장 사항을 포함한 예방 조치는 포괄적인 대사 평가 후에 추구될 수 있다고 보고되었습니다[7, 8]. 다양한 인간 연구에 따르면 야채와 과일 섭취량이 많은 식단이 신장 결석 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다[9-11]. 현재 신장결석 형성 과정에서 비정상적인 칼슘 대사로 인한 고칼슘뇨증의 분자적 메커니즘에 대한 심층적인 연구가 이루어져야 한다.
TRPV5는 세포막을 통한 Ca{1}}의 수송을 조절하는 중요한 단백질입니다[12]. 신장 조직에서 TRPV5는 요중 Ca{4}} 재흡수를 조절하고 체내 Ca{5}} 항상성을 유지하는 역할을 하는 원위곡세관(DCT)과 수집세뇨관(CNT)에서 주로 발견됩니다. . 이용 가능한 증거는 하향 조절된 TRPV5 발현이 고칼슘뇨증 및 Ca{8}}함유 신결석증의 형성에 중요한 병원성 요인일 수 있음을 시사합니다[14].
표 1: qRT-PCR에 사용되는 프라이머 서열.
Tamm-Horsfall 단백질로도 알려져 있는 유로모듈린(UMOD)은 소변에서 가장 풍부한 당단백질입니다[15]. 이는 주로 신세뇨관 상피 세포에서 발현되며 물-전해질 대사 균형, 면역 조절과 같은 다양한 생리적 기능을 수행합니다. , 신장 결석 예방 및 요로 감염으로부터 보호합니다 [16-18]. 현재 신장 결석 형성에 있어 UMOD의 특정 분자 메커니즘에 대한 보고는 거의 없습니다.
MicroRNA(miRNA)는 약 20~22개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 작은 비암호화 단일 가닥 RNA 분자의 한 종류로, 포유동물에 널리 존재합니다[19]. 성숙한 miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR에 완전히 또는 부분적으로 상보적으로 결합하여 표적 유전자의 전사 후 발현을 조절할 수 있으며, 그 결과 단백질 번역 합성이 분해되거나 억제됩니다[20]. miRNA는 성장과 발달, 세포 사멸, 대사 등 인간의 생리적 활동에 극적으로 영향을 미치기 때문에 질병의 예방과 치료에 큰 가능성을 지닌 것으로 간주됩니다 [21]. 최근 몇 년 동안 신장 결석의 발병 및 발달에서 miRNA의 역할에 관한 연구가 뜨거운 주제가 되었습니다[22, 23].
따라서 본 연구에서는 신장 결석 예방에 있어 UMOD와 TRPV5의 관계를 조사하고, UMOD를 표적으로 삼고 조절하는 miR-103a-3p의 역할을 밝혀 신장 결석에 대한 더 깊은 이해에 기여했습니다. 신장결석의 발병기전을 연구하고 질병의 예방과 관리를 위한 새로운 아이디어를 제공합니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 세포 배양 및 옥살산염 처리.
상피성 쥐 신장 세포주 NRK{0}}E(GNR 8)는 중국 유형 배양 센터(CCTCC)(중국 상하이)에서 입수했습니다. DMEM(12800017, Gibco, USA)을 증류수, 7.5% NaHCO3 용액(25080094, Gibco, USA), 5% 태아소혈청(FBS)(BC-SE-FBS02, Biochannel, 중국)과 혼합하여 배양하기 위해 제조하였다. 인큐베이터(37℃, 5% CO2)의 세포. 계대 배양 후, 이전에 설명한 대로 세포를 희석된 옥살산염(0.75mmol/L, 135623, Sigma Aldrich, USA)으로 48시간(h) 동안 유도했습니다[24]. 2.2. 세포 형질감염. 분자 메커니즘 연구를 위해 TRPV5-과발현 플라스미드(Bes-mR-001007572, Ber sinBio, 광저우, 중국), UMOD 과발현 플라스미드(Bes-mR-001278605, BersinBio, 광저우, 중국), UMOD에 대한 소형 간섭 RNA(siUMOD)(5'-CTCTTT TATCACACTTGATATGA-3', GenePharma, Shanghai, China), miR-103a-3p 억제제(GenePharma, Shanghai, 중국) 및 miR{32}}a-3p 모방체(BersinBio, 중국 광저우 소재)를 NRK- 52E 세포에서 서로 다른 형질감염에 적용하고 해당 컨트롤을 설정했습니다. 형질감염 전, NRK{35}}E 세포를 6-웰 플레이트(2 × 106개 세포/웰)에서 배양했습니다. 약 80% 세포 합류에 도달할 때까지 TRPV5-과발현 플라스미드, UMOD 과발현 플라스미드, siUMOD, miR-103a-3p 억제제 또는 모방물을 NRK-52E에 형질감염시켰습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 리포익 타임 2000(11668019, Invitrogen, USA)을 사용하여 세포를 배양하였다. 그 후, 형질감염된 NRK- 52E 세포에 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 및 품질 평가를 위한 웨스턴 블롯을 실시한 후 옥살산염으로 처리하였다.
2.3. RNA 추출 및 qRT-PCR.
Cell RNA Kit(19231ES50, Yeasen, China) 및 MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit(19331ES50, Yeasen, China)를 사용하여 NRK-52E 세포의 총 RNA 및 miRNA를 추출했습니다. 그런 다음 HiScript II One-Step RT-PCR Kit(P612-01, Vazyme, China)를 사용하여 작동 지침에 따라 추출물과 반응시켰습니다. 증폭 조건은 50℃ 30분, 94℃ 3분, 30사이클(94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 40초)로 설정하였고, 72℃에서 5분간. qRT-PCR은 ABI 7500 시스템(Applied Biosystems, USA)에서 수행되었습니다. 상대 mRNA 발현은 2-ΔΔCt 방법으로 분석되었으며[25], 정규화에는 -actin 또는 U6이 사용되었습니다. 모든 프라이머 서열은 표 1에 나와 있습니다.
2.4. 웨스턴 블롯.
샘플(NRK-52E 세포 및 쥐 신장 조직)의 전체 단백질을 RIPA Lysis Buffer(R0010, Solarbio, China)를 사용하여 용해시키고 BCA Protein Assay Kit(BI-WB005, Sbjbio, China)로 정량화했습니다. 동일한 양의 단백질을 10% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(P0690, Beyotime, 중국)으로 분리하고 PVDF 막(AR0136- 02, Boster, 중국)으로 옮겼습니다. 차단 완충액(P0252, Beyotime, China)으로 처리한 후, 막을 항-TRPV5(ab137028, 83 kDa, 1/10000), 항-UMOD(ab207170, 110 kDa, 1/1000) 및 항{ {20}}액틴(ab8226, 42 kDa, 1/1000) 항체를 4°C에서 밤새 보관합니다. 그런 다음 항토끼 IgG(ab97051, 1/2000) 및 항마우스 IgG(ab205719, 1/2000)를 포함한 2차 항체를 사용하여 막을 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 상대 단백질 블롯 검출은 시각화를 위해 ECL 완충액(WBK1S0100, Millipore, USA)을 사용하여 iBright Imaging System(CL750, Invitrogen, USA)에서 실행되었습니다. - 액틴이 내부 대조물질로 사용되었습니다.
2.5. 세포 생존력 분석.
세포 현탁액은 본 연구에 설명된 대로 준비되었습니다[24]. NRK-52E 세포를 5000 세포/웰의 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 접종하고 10 μL 메틸 티아졸릴 디페닐- MTT(tetrazolium bromide) 용액(40201ES72, Yeasen, China)을 사용하여 각 웰의 세포를 37℃에서 4시간 동안 처리한 후 SDS-HCL 처리했습니다. 세포 생존율 평가를 위해 마이크로플레이트 리더기(VL0L00D0, Thermo Fisher, USA)를 이용하여 파장 570nm에서의 광학밀도(OD) 값을 측정하였다.
