MiR‑214는 PTEN/AKT/mTOR 조절 자가포식을 통해 패혈증 유발 급성 신장 손상을 개선합니다.
Feb 28, 2022
추상적인. 이전 연구에서는 산화 스트레스와 자가포식이 급성신장 손상 (AKI) 패혈증 중 및 microRNA(miR)-214는 패혈증 보호에 중요한 역할을 합니다.신장산화 스트레스를 받습니다. 본 연구는 miR-214의 renoprotection이 패혈증에서 autophagy와 관련이 있는지 여부를 테스트하는 것을 목표로 합니다. 자가포식의 역할은 맹장 결찰 및 천자(CLP)의 마우스 모델에서 조사되었습니다. 역전사-정량적 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)을 이용하여 miR-214의 발현을 분석하였다. 의 구조와 기능신장마우스에서 수확한 것을 평가했습니다.신장자가포식 수준은 면역조직화학, 면역형광 및 웨스턴 블롯팅으로 검출되었다. miR-214는 패혈증 쥐의신장자가포식. 또한 miR-214는 PTEN 발현을 억제하여 자가포식을 억제했습니다.신장패혈증 쥐의 조직. 이러한 결과는 miR-214가 PTEN/AKT/mTOR 경로의 조절을 통해 산화 스트레스를 줄이고 자가포식을 억제함으로써 CLP 유도 AKI를 개선했음을 나타냅니다.
키워드:microRNA‑214, 패혈증, 급성 신장 손상, 자가포식, 신장
소개 심각한신장 손상(AKI)는 패혈증의 가장 흔한 합병증 중 하나이며 패혈증 환자의 40~50%에서 발생하며 사망률은 60%에 이릅니다(1). 그러나 패혈증 유발 AKI의 발병기전은 아직 명확하지 않다. Autophagy는 패혈증 유발 AKI에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었으며 autophagy의 억제는 패혈증 동안 AKI의 발병을 초래합니다(2,3). 이전 연구(4,5)는 패혈증이 다음을 포함한 여러 기관에서 자가포식을 유발한다는 것을 확인했습니다.신장(6) 및 autophagic 과정은 손상된 미토콘드리아와 산화 스트레스의 제거에 관여합니다 (7). 그러나 과도한 자가포식은 원치 않는 유해한 세포 사멸을 유발할 수 있습니다(8). 따라서 적당한 수준의 자가포식(autophagy)이 패혈증 유발 AKI를 줄이는 열쇠입니다. 이전 연구에 따르면 miR-214는 세포자멸사를 억제하여 허혈 재관류 유발 AKI를 개선하고(9) miR-214는 반응성 산소종(ROS)/AKT/mTOR 신호 전달 경로를 통해 당뇨병성 신병증의 산화 스트레스를 억제합니다(10). 본 연구는 miR-214가 자가포식을 억제함으로써 쥐의 패혈증 유발 심근 기능 장애를 약화시킬 수 있음을 발견했습니다(11). 그러나 miR-214가 패혈증 유발 AKI를 개선할 수 있는지 여부는 아직 밝혀지지 않았습니다. 현재 연구에서 miR-214는 PTEN/AKT/mTOR 경로의 조절을 통해 산화 스트레스를 감소시키고 자가포식을 억제함으로써 CLP-유도 AKI를 약화시키는 것으로 가정했습니다.
CISTANCHE는 신장/신장 질환을 개선할 것입니다
재료 및 방법
동물.Hebei Medical University의 Medical Laboratory Animal Center(Shijiazhuang, China)에서 제공한 총 100마리의 Kunming 수컷 마우스(체중, 20.40±2.92g; 연령, 6-8주)가 본 연구에 사용되었습니다. 모든 마우스는 50% 습도, 24˚C에서 12시간 명암 주기에 적응했으며 실험 1주일 이상 전에 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 모든 실험 절차는 국립 보건원 지침(NIH 간행물 번호 85-23, 1996년 개정)과 창저우 중앙 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인(승인 번호 2017-020-)에 따라 수행되었습니다. 01). 모든 수술은 마취하에 시행되었으며 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
맹장 결찰 및 천자(CLP).CLP는 이전에 설명한 대로 쥐 패혈증 모델을 만들기 위해 마우스에서 수행되었습니다(12). 이소플루란 흡입(3%에서 유도되고 0.5%로 유지)에 의한 마취 후, 1cm 정중선 절개가 절단되었습니다. 노출된 맹장(끝에서 1cm 거리)을 23 게이지 바늘을 사용하여 2개의 천자로 결찰했습니다. 맹장은 소량의 대변을 부드럽게 밀어내고 해부학적 위치로 되돌려 놓았습니다. 복벽은 3‑0 실크 브레이드로 겹겹이 봉합되었습니다. 절차 후 00.9% 식염수 1ml를 피하 주사했습니다. 생쥐에게는 물만 무료로 제공되었습니다. 가짜 모델 마우스는 CLP가 없는 CLP 모델과 동일한 방식으로 작동되었습니다.
실험적 설계. 마우스(가짜 수술 및 CLP의 경우 n=6)는 무작위로 7개 그룹으로 할당되었습니다. 가짜 그룹, CLP 그룹, 아데노바이러스(Ad)-녹색 형광 단백질(GFP) + CLP 그룹, Ad‑miR-214 + CLP 그룹 , anti‑miR‑214 + CLP 그룹, PTEN 억제제 + CLP 그룹 및 Ad‑miR-214 + PTEN 억제제 + CLP 그룹. Sham 그룹 마우스는 결찰 및 맹장의 천자 없이 동일한 절차에 노출되었습니다. 다른 그룹의 마우스는 맹장 결찰 및 천공을 받았습니다. 모든 마우스를 이소플루란 흡입으로 신속하게 마취시켜 혈액, 소변 및신장마지막 처리 24시간 후 샘플.
아데노바이러스 매개 Ad‑miR‑214, anti‑miR‑214 또는 Ad‑GFP생체 내 유전자 전달 및 PTEN 억제제 주입. Ad‑miR‑214, anti‑miR‑214 또는 Ad‑GFP(Shanghai GenePharma Co., Ltd.)는 CLP 4일 전에 마우스의 복강에 전달되었습니다. 간단히 말해서, 마우스를 이소플루란 흡입으로 마취시켰다. 200μl의 아데노바이러스(2x1011 pfu, miR-214, anti-miR-214 또는 Ad-GFP 발현)가 포함된 카테터를 복강내 주사를 통해 정상 마우스에 투여했습니다. PTEN 억제제(VO-OHpic, 복강내, Sigma-Aldrich; Merck KGaA)는 아데노바이러스 투여 30분 전에 10 µg/kg의 단일 용량으로 복강내 주사를 통해 항-miR-214를 투여받은 CLP 마우스에 투여되었습니다. .
신장 기능 평가. 마우스 심장에서 혈액 샘플을 채취한 다음 혈청을 수집하기 위해 원심분리(실온에서 3,{2}} xg에서 15분 동안)를 수행했습니다. 혈액 요소 질소(BUN) 및 혈청 크레아티닌(Cr)의 혈청 수준은 Hitachi 7600 자동 분석기(Hitachi, Ltd.)를 사용하여 결정되었습니다. ELISA는 수준을 분석하는 데 사용되었습니다.신장 손상분자-1(KIM-1, 카탈로그 번호 RKM100, R&D Systems,Inc.) 및 소변 샘플에서 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL, 카탈로그 번호 DY3508, R&D Systems, Inc.).
혈청 염증 사이토카인에 대한 분석.혈청 TNF-(카탈로그 번호 H052) 및 IL-6(카탈로그 번호 H007)은 제조업체의 지침에 따라 상업용 ELISA 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)를 사용하여 검사되었습니다.산화 스트레스 마커 측정. 해당 분석 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)를 사용하여 말론디알데히드(MDA)의 수준을 측정하고 제조업체의 지침에 따라 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 활성을 테스트했습니다.
조직학 및 관 손상 점수. 모든 마우스는신장CLP 후 24시간 동안 마취하에 관류. 그만큼신장표본은 4˚C에서 72시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정되었습니다. 그런 다음 조직 샘플을 단계별 에탄올 용액에서 탈수하고 파라핀에 포매하고 4μm 섹션으로 잘라냅니다. 마이크로톰을 사용하여 절편(4μm)을 절단하고 조직학적 검사를 위해 실온에서 헤마톡실린(5분) 및 에오신(1분)으로 조직 절편을 염색했습니다. 슬라이드는 현미경(BX51, Olympus Corporation)을 사용하여 평가되고 등급이 매겨졌습니다.신장tissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75%(13).
투과 전자 현미경(TEM).신선한신장인산완충식염수로 세척하고 1mm 입방체로 자르고 2.5% 글루타르알데히드에 4℃에서 24시간 동안 순차적으로 고정하였다. 절편을 4˚C에서 2시간 동안 1% 사산화 오스뮴에 담그고 등급이 지정된 에탄올에서 탈수하고 에폭시 수지에 매립했습니다. 마지막으로, 초박형 섹션(60 nm)을 20˚C에서 60분 동안 uranyl acetate와 lead citrate로 이중 염색했습니다. 관찰은 전자 현미경 필름 4489(ESTAR 두꺼운 베이스; Kodak)를 사용하여 80kV에서 투과형 전자 현미경(Tecnai; Hitachi, Ltd.)에서 수행되었습니다.
면역조직화학(IHC).신선한신장조직을 4% 파라포름알데히드(4˚C에서 72시간 동안)에 고정하고 파라핀에 포매했습니다. 표본을 4 µm 두께로 절단하고 자일렌에서 탈파라핀화했습니다. 조직 절편을 PBS로 세척한 후 항원 검색을 위해 10mM 시트레이트 완충액(pH 6.{25}})에서 4분 동안 끓인 다음 실온에서 PBS 중 10% 염소 혈청으로 차단했습니다. 1시간 동안 1차 항체(항-LC3B; 1:400; 카탈로그 번호 4412; Cell Signaling Technology, Inc.)를 지침에 따라 첨가하고 4°C에서 12시간 동안 배양했습니다. 2차 항체(염소 항토끼 HRP; 1:2,{18}}; 카탈로그 번호 BS13278; Bioworld Technology, Inc.)를 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션했습니다. DAB(100μl)를 첨가하고 광학 현미경(모델 CX31‑P, Olympus Corporation)으로 관찰한 염색으로 5분 동안 대조염색했습니다. 갈색으로 보이는 양성 염색의 강도는 Image‑Pro Plus 6.0 이미지 분석 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 결정되었습니다. 적분 광학 밀도(IOD)는 강도를 나타내기 위해 계산되었습니다. IOD 값은 단백질 발현이 증가함에 따라 증가했습니다.
역전사 정량적(RT‑q) PCR. 총 RNA는신장 조직TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 사용한 모델 유도 후. TaqMan 역전사 키트(cat. no. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.)의 지침에 따라 RNA는 cDNA로 역전사되었습니다. 다음 열순환 조건이 사용되었습니다(miR-214): 95˚C에서 5분 동안 초기 변성; 95˚C에서 30초간 변성, 60˚C에서 30초간 어닐링, 72˚C에서 30초간 신장을 40회 반복합니다. RT‑qPCR은 ABI Prism 7500 Sequence Detection System(PerkinElmer, Inc.) 및 표준 SYBR Green PCR 키트(Toyobo Life Science)를 사용하여 수행되었습니다. U6은 miR-214의 내부 대조군으로 사용되었습니다. 프라이머 서열은 다음과 같습니다: miR-214, 정방향, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' 및 역방향, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, 정방향, 5'‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3' 및 역방향, 5'‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3'. 이 실험은 6번 반복되었습니다. 결과는 2‑ΔΔCq 방법을 사용하여 분석되었습니다(14). LC3, p62, PTEN, AKT 및 mTOR의 mRNA 발현 수준은 RT-qPCR을 통해 평가되었습니다. ‑actin을 이러한 유전자의 내부 참조로 사용하여 2‑ΔΔCq를 사용하여 대상 유전자의 상대적 발현을 측정했습니다. 표 1에 나타낸 프라이머 서열은 Sangon Biotech Co., Ltd.에서 합성하였다.
웨스턴 블로팅. 신장조직을 RIPA 용해물(Beyotime Institute of Biotechnology)과 혼합하여 균질액을 만들고 가시적인 조직이 관찰되지 않으면 용해를 중단했습니다. 샘플을 13,{1}} xg에서 -4˚C에서 10분 동안 원심분리하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 상등액을 회수했습니다. 간단히 말해서, 단백질 농도는 마이크로 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 결정되었습니다. 단백질 샘플(샘플당 80μg)은 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 환원하여 분리한 다음 4˚C에서 밤새 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 옮겼습니다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 실온에서 2시간 동안 5% 탈지유에서 차단한 후, 막을 1차 항체와 함께 밤새(4˚C에서) 배양했습니다. 다음 1차 항체(모든 Cell Signaling Technology, Inc.)가 사용되었습니다: Light chain 3B(1:1,{13}}; cat. no. 4412), p62(1:1,{18}}, cat . no. 4412), Anti‑PTEN(1:1,{22}}, cat. no. 9188), anti-phosphorylated (p)‑AKT(Ser473)(1:1,{27}}, cat. . no. 4060), anti‑AKT(1:1,{31}}, cat. no. 9272), anti‑p‑mTOR(Ser 2448)(1:1,{36}}, cat. no. 5536), 항-mTOR(1:1,{40}}, 카탈로그 번호 2972) 및 ‑액틴(1:2,{44}}, 카탈로그 번호 4970). 세척 후 막을 HRP 결합 항토끼 이차 항체(1:3,{49}}, cat. no. A0208, Beyotime Institute of Biotechnology)와 함께 (실온에서 2시간 동안) 배양했습니다. Immobilon Western(MilliporeSigma)으로 단백질 밴드를 검출하고 Total‑Lab TL120 소프트웨어(Nonlinear Dynamics, 2.01)를 사용하여 분석했습니다. 단백질의 발현은 ‑액틴으로 정상화되었습니다.
통계 분석. GraphPad Prism 9.{1}}(GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 모든 데이터는 분포에 따라 연속 변수에 대한 평균 ± 표준 편차 또는 중앙값(사분위수 범위)으로 표시되었습니다. 기준 특성 및 결과는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정 또는 Kruskal-Wallis 검정 후 Dunn 검정을 적절하게 사용하여 비교되었습니다. 피<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
결과
시점 CLP 후 24시간. 이전 연구에서는 생화학적(즉, LC3 및 p62) 분석이 CLP 6-8시간 후 패혈증의 진행과 함께 자가포식 플럭스가 억제된다는 것을 보여주었다고 보고했습니다(6,15,16). 본 연구에서 자가용해소체의 수는신장수술 후 24시간 이내에 CLP 처리 마우스가 증가했습니다. 또한, 마커 분석신장 손상그것을 보여주었다신장 기능CLP 후 24시간 동안 가장 심각하게 손상되었습니다. 따라서 다음 실험에서는 CLP 후 24시간 시점을 선택하였다.
신장 조직에서 miR-214에 대한 조절 효과. RT‑qPCR 분석을 사용하여 CLP 처리 마우스에서 miR‑214 발현을 검출했습니다. miR-214 발현은신장가짜 그룹과 비교하여 CLP 수술 24시간 후 조직(1.47배, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">신장가짜 그룹(둘 다 P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE는 신장/신부전을 개선할 것입니다
패혈증 마우스의 신장 기능 장애에 대한 miR-214의 효과.모든 마우스를 희생시켜 혈액, 소변 및신장CLP 수술 24시간 후 샘플. BUN과 Cr은 중증도를 나타내는 중요한 지표입니다.신장장애(17). 또한, NGAL 및 KIM-1은 다음의 특정 바이오마커로 확인되었습니다.신장 손상그리고 그들의 증가된 표현은 초기신장AKI(17)의 관 손상. 그림 2A-D에서 볼 수 있듯이 BUN, Cr, KIM-1 및 NGAL 수치는 sham 그룹에 비해 CLP 수술 후 유의하게 증가했습니다. 그러나 Ad‑miR‑214는 CLP 그룹에 비해 BUN, Cr, KIM‑1 및 NGAL 수준을 유의하게 감소시켰습니다(모든 P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">신장 기능매개변수. 그러나 PTEN 억제제 전처리 후 Ad‑miR‑214의 보호 효과가 향상되었습니다. 결과는 miR-214가 패혈증 마우스에서 신장 기능 장애를 약화시킨다는 것을 보여줍니다.
신장 염증 및 산화 스트레스에 대한 miR-214의 효과.그림 3A와 B에서 볼 수 있듯이, CLP는 TNF-와 IL-6의 수치를 유의하게 높인 반면, Ad-miR-214는 이들 마커 수치를 유의하게 감소시켰습니다. 에 비해
패혈증 마우스에서 신장 자가포식에 대한 miR-214의 효과.본 연구에서는 LC3의 변화를 조사했습니다.신장IHC 염색을 통해 조직. 도 6에 나타난 바와 같이, 양성 염색의 LC3 강도는 sham 그룹에 비해 CLP 그룹에서 유의하게 증가하였다(P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR‑214는 AKT/mTOR 경로를 활성화하여신장 조직에서 PTEN을 억제하여 자가포식.자가 포식에 대한 CLP의 효과신장LC3‑II/I 및 p62의 수준을 평가하여 조직을 조사했습니다. PTEN/AKT/mTOR 신호 전달 경로는 자가포식에서 중요한 역할을 합니다(18). miR-214가 PTEN‑AKT/mTOR 경로에 미치는 영향을 알아보기 위해 LC3‑II/I, p62, AKT, p‑AKT, mTOR, p‑mTOR 및 PTEN의 단백질 수준을 western blotting과 RT‑를 통해 분석했습니다. qPCR 분석. 그림 7A-C에서 볼 수 있듯이 이러한 단백질의 변형은 LC3-II/LC3-I 비율이 증가하고 p62 수준이 감소하면서 빠르게 발생합니다(둘 모두 P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">신장 tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). 이러한 결과는 CLP에 의해 자가포식이 유도되고 miR-214의 과발현이 이를 부분적으로 억제할 수 있음을 보여주었다.
도 7A 및 D-F에 나타난 바와 같이, PTEN의 발현 수준(P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">신장 tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). 이러한 결과는 CLP가신장AKT/mTOR 경로를 억제하여 조직 자가포식을 억제합니다. Ad‑miR‑214는 PTEN을 억제하여 AKT/mTOR 경로를 활성화했습니다.신장조직. 그러나 CLP군과 비교하여 anti-miR-214는 mTOR의 발현을 유의하게 억제하지 않았다. 따라서 RT‑qPCR은 PTEN/AKT/mTOR 신호 전달 경로와 관련된 유전자의 mRNA 발현을 결정하는 데 추가로 사용되었습니다. RT‑qPCR 결과(Fig. 8)에 따르면, Sham 그룹에 비해 p62, LC3, PTEN의 mRNA 발현량이 현저히 증가한 반면, CLP 그룹에서 AKT와 mTOR의 mRNA 발현은 감소하였다. CLP 그룹인 Ad‑miR‑214, PTEN과 비교하여
억제제 및 Ad‑miR‑214 + PTEN 억제제 그룹은 LC3 및 PTEN의 mRNA 발현 감소를 나타내었지만 p62, AKT 및 mTOR의 mRNA 발현 증가(모든 P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). 따라서 자가포식에 대한 p62의 효과는 전사 후 수준이 아닌 전사 수준에서 발생할 수 있습니다. 현재 결과는 miR-214가 PTEN의 발현을 하향 조절하고 AKT/mTOR 신호 전달 경로를 활성화함을 보여주었습니다.
논의
본 연구에서는 과도한 자가포식이신장 기능패혈증 쥐에서. 이전 연구에 따르면 miR-214는 증식, 전이, 침습 증가와 관련이 있으며 세포 및 조직에 대한 종양 유전자로서의 기능이 있는 것으로 나타났습니다(19-22). 연구에 따르면 miR-214는 아폽토시스, 산화 스트레스 및 염증 인자 하향 조절을 통해 AKI에 대한 보호 역할을 한다고 보고합니다(21,23). 본 연구는 자가포식 조절에 miR-214가 잠재적으로 관여하는 것에 초점을 맞추어 패혈증 유발 AKI에 대한 miR-214의 보호 효과를 뒷받침하는 메커니즘을 추가로 조사했습니다. 결과는 산화 스트레스가신장CLP 수술의 투여 후. 한편, autophagy의 활성화는신장.LC3 II/I 증가 및 p62 감소신장CLP 수술로 치료한 후 관찰되었습니다. 예상대로 miR-214의 과발현이 크게 약화되었습니다.신장병적 손상 및신장패혈증으로 인한 기능 장애. 그러나 miR-214의 억제는 재보호에 반대되는 경향을 보였다. 또한 Ad‑miR‑214의 보호 효과는 PTEN 억제제에 의해 강화되었습니다.
정화조에서신장, 과도한 염증은 ROS 생성의 대규모 증가를 동반하며 많은 수의 ROS는 미토콘드리아 구조의 변화를 유발하고 미토콘드리아 기능을 손상시켜 신체를 악화시키는 악순환에 빠지게 합니다.신장손상 (24,25). 따라서 산화 스트레스는 패혈증 유발 AKI의 주요 병리학적 기전 중 하나일 수 있습니다. 본 연구는 과도한 산화 스트레스를 보여주는 추가 증거를 제공했으며, 이는 MDA 생산 증가 및 SOD 활성 감소로 나타났습니다.신장CLP 수술 후 조직. 또한 miR-214의 과발현이신장autophagic 억제에 관여하는 CLP 유발 산화 손상에 대해. 이는 miR-214가 산화 스트레스로부터 다양한 세포와 조직을 보호한다는 이전 연구와 일치합니다(26,27).
Autophagy는 패혈증 발병에서 '양날의 검' 역할을 합니다. Basal autophagy는 독성 산화 단백질을 제거하여 보호 효과를 발휘할 수 있지만 과도한 autophagy는 ROS 분출과 같은 심각한 스트레스 하에서 autophagic 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다(28,29) . autophagy는 패혈증에서 초기에 활성화되고 autophagic 세포 사멸로 인한 기능 장애의 후속 단계가 뒤따르며 패혈증 유발 산화 손상을 악화시키는 것으로 나타났습니다. 본 연구에서 PTEN 억제제 또는 miR-214의 과발현은 CLP 처리 마우스에서 항산화 재생신보호를 나타냈다. 그러나 miR-214의 억제는 항산화 재보호와 반대되는 경향을 보였다. 따라서 과도하거나 부적절한 자가포식은 다음을 유발할 수 있습니다.신장 손상; 둘 다 부적응적이며 결국 세포 사멸을 유발합니다. 따라서 적절한 수준의 자가포식을 유지하는 것이 패혈증 상태에서 산화 손상을 약화시키는 열쇠입니다.
CISTANCHE는 신장/신장 통증을 개선합니다
축적된 증거에 따르면 miR-214는 다양한 세포와 조직에서 자가포식을 억제합니다(31-33). 본 연구에서 miR-214의 과발현은 CLP에 의해 유도된 자가포식을 억제하는 것으로 밝혀졌습니다신장 조직,LC3‑II/I 및 p62와 같은 단백질 마커의 변화로 표시됩니다. 또한, 결과는 miR-214의 과발현이 과도한 자가포식을 억제함으로써 CLP-유도 산화 손상을 약화시키는 것으로 나타났습니다. 본 연구는 또한 miR-214가 조절하는 분자 메커니즘을 조사했습니다.신장패혈증 유발 AKI의 자가포식. PTEN/AKT/mTOR는 다음을 조절하는 중요한 신호 전달 경로입니다.신장autophagy(34,35)는 패혈증 유발 AKI에서 핵심 역할을 하며 PTEN은 PI3K/AKT/mTOR 신호 전달 경로의 음성 억제제입니다. 이전 연구에서는 miR-214가 다양한 모델에서 PI3K/AKT/mTOR 신호 전달 경로를 통해 자가포식을 조절할 수 있다고 보고했습니다(36-38). Ma et al(39)은 miR-214가 당뇨병성 신장에서 자가포식을 하향 조절할 수 있음을 발견했습니다. 따라서 CLP-유도된 AKI에 대한 miR-214의 효과가 PTEN/AKT/mTOR 경로의 조절에 관여할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 특히, 본 연구의 결과는 CLP 수술이 PTEN 수치를 유의하게 상승시켰지만 p‑AKT 및 p‑mTOR 수치를 감소시켰으며, 이는 CLP 수술이 AKT/mTOR 경로를 비활성화함을 나타냅니다. 또한 miR-214의 과발현은신장조직. 그러나 anti-miR-214는 웨스턴 블롯 분석에서 mTOR의 발현을 유의하게 억제하지 않았습니다. 따라서 RT‑qPCR은 PTEN/AKT/mTOR 신호 전달 경로와 관련된 유전자의 mRNA 발현을 결정하는 데 추가로 사용되었습니다. 본 연구에서는 miR-214가 PTEN의 발현을 하향 조절하고 AKT/mTOR 신호 전달 경로를 활성화하여 자가포식을 억제한다는 것을 확인했습니다. 그러나 의 메커니즘과 관련된 추가 세부 사항을 얻기 위해 더 철저한 연구가 수행되어야 합니다.신장패혈증 상태의 자가포식.
결론적으로, 본 연구의 결과는 miR-214가 패혈증 유발에 대한 보호 역할을 한다는 것을 시사했습니다.신장 손상산화 스트레스를 줄이고 PTEN/AKT/mTOR 경로의 조절을 통해 자가포식을 억제함으로써 본 연구 결과는 miR-214가 패혈증 유발 AKI에 대한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있음을 시사했습니다. 그러나 본 연구는 생후 6~8주된 생쥐를 사용하였기 때문에 성체 생쥐에서 miR-214의 기전에 대한 추가 연구가 필요하다.
