아릴 탄화수소 수용체 신호 경로의 조절이 후닌 바이러스 복제에 미치는 영향 2부
Jul 20, 2023
3. 결과 및 논의
3.1. AHR 경로는 JUNV 감염 중에 과도하게 나타납니다.
간은 JUNV 감염 동안 주요 표적 중 하나입니다[22]. 간세포 감염과 관련된 분자 메커니즘을 밝히기 위해 JUNV IV4454로 감염된 간 유래 인간 HepG2 세포에서 24시간 또는 48시간 동안 차별적으로 발현되는 유전자를 결정하기 위해 Affymetrix 마이크로어레이 스크리닝을 수행했습니다.
우리는 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA의 Transcriptome Analysis Console 소프트웨어를 사용하여 대조군과 비교하여 JUNV 감염 세포에서 차등적으로 발현된 유전자를 평가했습니다(그림 1a, b). 총 266개 및 313개의 차별적으로 발현된 유전자가 각각 24시간 및 48시간 pi에서 검출되었습니다(그림 1a,b).
Affymetrix 마이크로어레이 분석(조건당 n=3개의 독립 실험). 최소 1.6-배의 발현 변화와 차등적으로 발현될 확률 95%(p= 0.05)를 나타내는 숙주 유전자를 추가 분석을 위해 고려했습니다. 빨간색으로 표시된 유전자는 상향 조절되었고, 녹색으로 표시된 유전자는 하향 조절되었으며, 회색 유전자는 감염되지 않은 HepG2 세포와 비교하여 발현에 변화가 없었습니다. ( b ) 48 시간 pi에서 모의 감염 및 JUNV 감염 HepG2 세포 사이에서 차별적으로 발현 된 유전자. ( c ) 48 시간 pi에서 JUNV 감염 HepG2 세포에서 차별적으로 발현 된 유전자의 유전자 온톨로지 분석. (d) 감염 중에 영향을 받는 주요 신호 전달 경로를 보여주는 모의 감염 세포와 비교한 JUNV 감염 HepG2 세포의 경로 과다 표현 분석. 빨간색 막대는 AHR 경로를 강조 표시합니다. 파란색 파선은 p=0.05를 나타냅니다. p 값은 WebGestalt 소프트웨어(http://www.webgestalt.org, 2020년 7월 3일 액세스)에 의해 결정되었습니다.
숙주 유전자와 면역 사이에는 밀접한 관계가 있습니다. 숙주 유전자는 사람의 면역 체계의 발달과 기능을 크게 결정하며 다른 병원체에 대한 사람의 저항에 영향을 줄 수 있습니다.
여러 연구에서 특정 유전자 돌연변이가 면역 체계의 불균형을 초래할 수 있음이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 일부 사람들은 면역 체계가 과잉 반응하여 면역 체계가 류마티스, 전신성 홍반성 루푸스 및 기타 질병과 같은 신체 조직을 공격하는 질병으로 고통받을 수 있습니다. 또한 박테리아, 바이러스, 기생충과 같은 병원체에 대한 저항성은 유전적 차이와도 관련이 있습니다. 어떤 사람들은 병원체를 더 빠르고 더 완전하게 제거하는 더 효율적인 면역 체계를 가지고 태어납니다.
숙주 유전자와 면역 사이의 관계에 대한 연구는 우리에게 신체의 방어 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 제공했으며 또한 다양한 질병에 대한 신체의 반응을 더 잘 이해하는 데 도움이 되었습니다. 이것은 질병의 예방과 치료에 매우 중요합니다.
따라서 우리는 유전자 검사의 중요성에 주목하고 인간 유전자의 차이를 배우고 이해하여 면역 체계를 더 잘 보호하고 체격을 강화하며 튼튼한 몸을 만들어야 합니다. 이러한 관점에서 우리는 면역력을 향상시켜야 합니다. Cistanche는 비타민 C, 비타민 C, 카로티노이드 등과 같은 다양한 항산화 물질이 풍부하기 때문에 면역력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이러한 성분은 자유 라디칼을 제거하고 산화 스트레스를 줄일 수 있습니다. 면역 체계의 저항력을 자극하고 개선합니다.
JUNV가 세포 환경에 미치는 영향을 더 자세히 연구하기 위해 WebGestalt 소프트웨어(http://www.webgestalt.org, 2020년 7월 3일 액세스)를 활용했습니다. 이 소프트웨어는 Wikipathways 데이터베이스를 저장소로 사용하여 Gene Ontology Analysis를 수행합니다. 그림 1c) 어떤 신호 경로가 대조군과 비교하여 차등적으로 변경되었는지 확인합니다(그림 1d).
차별적으로 발현된 유전자의 유전자 온톨로지 분석과 관련하여 JUNV 감염은 RNA 대사, 숙주 키나아제 및 지질 대사와 관련된 유전자의 발현에 영향을 미친다고 결론지었습니다(그림 1c). 이러한 생물학적 과정과 분자 기능이 복제 주기 동안 JUNV의 표적이 되는 것으로 보고되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다[23].
또한 Pathway Overrepresentation Analysis는 JUNV 감염이 다른 많은 경로(p < 0.05) 중에서 48h pi(그림 1d)에서 AHR 신호 경로를 풍부하게 한다는 것을 밝혔습니다. 특히, AHR 경로의 활성 증가를 입증하는 AHR 표적 유전자 CYP1B1의 발현 증가를 검출하였다.
지난 몇 년 동안 여러 연구에서 다양한 병리학적 시나리오에서 치료 목표로서 AHR의 중요성이 밝혀졌습니다. 따라서 활성을 조절하기 위한 다양한 소형 화합물이 개발되었습니다. 우리는 체외 JUNV 감염 동안 AHR 변조의 영향을 더 연구하기로 결정했습니다.
3.2. AHR의 약리학적 조절이 바이러스 복제에 영향을 미침
AHR이 JUNV 감염에서 수행하는 역할을 설명하기 위해 우리는 알려진 AHR 리간드 CH223191(길항제) 및 kynurenine(작용제)이 두 가지 다른 JUNV 약독화 균주 IV4454 및 Candid#1을 사용하여 체외 감염에 미치는 영향을 테스트하기로 결정했습니다. Huh-7 및 Vero 세포를 사용하여 치료 및 감염을 수행하였다. 이 마지막 세포주는 인터페론 I형(IFN-I)을 발현하고 분비할 수 없기 때문에 이를 사용하면 잠재적인 AHR 매개 숙주-바이러스 상호 작용에서 IFN-I 발현의 중요성을 결정할 수 있습니다.
먼저, CH223291과 kynurenine의 서로 다른 농도에 대한 세포 독성을 MTT 분석(그림 2a,b) 및 광학 현미경 관찰(그림 2c,d)을 통해 평가했습니다.
CH223191과 관련하여 세포 독성 효과와 관련된 세포 생존력 및 형태학적 변화의 감소는 80 μM의 농도에서만 검출되었습니다(그림 2a,c). 한편, kynurenine은 테스트한 모든 농도에서 세포 독성 효과를 유발하지 않았습니다(그림 2b,d).
JUNV 감염 동안 AHR 약리학적 조절의 효과를 조사하기 위해, 세포 배양물을 비히클(DMSO), CH223191 또는 키누레닌으로 처리한 다음 바이러스 수율을 측정하기 위해 JUNV로 48시간 동안 감염시켰다. 간략하게, Vero 및 Huh-7 세포는 소분자 CH223191(2.5, 5 μM, 10 μM 및 20 μM) 또는 키누레닌(5 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM) MOI 0.5에서 IV4454 및 Candid#1로 JUNV 감염 전후. 48시간 후, 상청액을 수확하고 PFU 분석을 위해 Vero 세포를 감염시키는 데 사용했습니다(그림 3).
AHR 봉쇄는 가장 낮은 농도의 CH223191을 테스트한 경우에도 용량 반응 방식으로 바이러스 입자 생산을 크게 줄였습니다. 중요하게도, 이 결과는 JUNV-약독화 균주 모두를 사용했을 뿐만 아니라 감염된 세포주(Vero 및 Huh7) 모두에서도 관찰되었습니다. JUNV에 감염된 Vero 및 Huh-7 세포의 CH223191 처리는 바이러스 플라크의 수를 각각 93% 및 97% 감소시켰습니다(그림 3a,b). 이러한 결과는 AHR 신호 전달 경로가 JUNV 감염 동안 중요한 세포 인자임을 강력히 시사합니다(그림 3a,b). 한편, JUNV 접종 전후의 키누레닌 투여는 바이러스 대조군과 비교하여 얻은 바이러스 역가를 크게 변화시키지 않았습니다(그림 3c,d).
대체로 결과는 AHR이 JUNV 시험관내 감염 동안 중요한 세포 인자라는 것을 처음으로 입증했으며, 바이러스 복제 주기를 촉진함으로써 프로바이러스 역할을 암시합니다.
3.3. AHR 변조는 JUNV 단백질 발현에 영향을 미칩니다
JUNV 감염에 대한 AHR 변조의 효과를 더 연구하기 위해 간접 면역 형광 분석을 수행했습니다. JUNV NP 단백질은 Arenaviridae 계열 내에서 가장 풍부한 구조 및 기능 단백질입니다. 따라서, 소수의 연구만이 상이한 JUNV 약독화 균주의 NP 발현 패턴을 보고했다는 점에서 NP를 흥미로운 염색 표적으로 선택하였다. 우리의 첫 번째 단계는 우리의 세포 모델에서 두 JUNV 균주의 NP 분포를 결정하여 서로 다른 세포주의 허용성과 이러한 세포 배양에서 두 감쇠 균주의 바이러스 보급을 비교하는 것이었습니다(그림 4).
NP 국소화는 독점적으로 세포질이었고 Vero 및 Huh-7 세포주에서 두 균주 모두에 대해 유사한 균질한 큰 구두점 축적 패턴을 나타냈습니다(그림 4).
다음으로 우리는 JUNV 감염 세포 배양에서 NP 발현에 대한 AHR의 약리학적 조절의 영향을 면역형광으로 평가했습니다.
간략하게, 세포를 유리 커버슬립 위에 파종하고, 비히클(DMSOCH223191(10uM) 또는 키누레닌(40uM)으로 전처리한 후, 48시간 동안 모의 감염 또는 JUNV 감염시켰다. 그 후, 세포를 고정하고 면역형광을 통해 처리하였다. 분석(그림 5).
CH223191 투여는 세포 배양과 JUNV 균주 모두에서 NP 양성 세포의 수를 현저히 감소시켰습니다(그림 5). 이러한 관찰은 그림 3a,b에 표시된 이전 결과와 상관관계가 있습니다. AHR 봉쇄는 JUNV에 감염된 세포의 비율뿐만 아니라 바이러스 병소의 크기도 줄였습니다. CH223191로 전처리되고 IV4454 또는 Candid#1로 감염된 Vero 세포 배양은 병소 크기가 각각 57.14%(SD ± 7.98) 및 41.17%(SD ± 9.05) 감소한 것으로 나타났습니다. 또한 길항제를 전처리하고 IV4454와 Candid#1을 감염시킨 Huh-7 세포 배양액은 병소 크기가 각각 28.57%(SD ± 8.70), 12.50%(SD ± 9.30) 감소한 것으로 나타났다. 한편, 키누레닌 처리는 무처리 감염된 세포와 비교하여 NP-양성 세포의 백분율(도 5) 또는 병소 크기(나타내지 않음)를 변화시키지 않는 것으로 관찰되었다.
또한 더 자세한 현미경 검사에서 Huh-7-감염된 세포 배양에 비해 감염된 Vero 세포 배양에서 바이러스 병소가 더 큰 것으로 나타났습니다. 초점당 JUNV에 감염된 Vero 세포의 평균은 35개 세포로 구성되는 반면, 초점당 JUNV에 감염된 Huh-7 세포의 평균은 6개 세포로 구성되는 것을 관찰했습니다. 이 예상되는 관찰은 IFN 능력 세포가 JUNV 증식에 부과하는 제한된 바이러스 환경과 일치합니다[24].
3.4. AHR 억제로 JUNV 바이러스 수준 감소
마지막으로, AHR 차단이 JUNV RNA 수준에 영향을 미치는지 평가하기 위해 Vero 및 Huh-7 세포를 비히클, CH223191(10μM) 또는 키누레닌(40μM)으로 처리한 다음 모의 또는 JUNV에 감염시켰습니다. 48시간 그 후, 세포 단층을 수확하고 RT-qPCR을 위해 처리하여 ahr, cyp1a1 및 np RNA 수준을 모니터링했습니다(그림 6).
CH223191- 처리 및 JUNV 감염 세포는 비히클 처리-JUNV 감염 샘플에 비해 ahr mRNA 수준이 낮은 경향을 나타내는 것으로 관찰되었습니다(그림 6a,b). 반대로, kynurenine의 투여는 비히클 처리 된 JUNV 감염 샘플과 비교하여 JUNV 감염 세포에서 ahr mRNA 수준의 향상 경향을 나타 냈습니다 (그림 6a, b). 이러한 결과에 따라 CH223191로 처리하면 Huh-7 세포에서 cyp1a1 mRNA 수준이 감소하는 경향을 보인 반면, kynurenine으로 처리하면 반대 효과가 나타났습니다(그림 6c). JUNV RNA 수준과 관련하여 AHR 길항제 CH223191로 처리하면 비히클 처리된 JUNV 감염 샘플과 비교하여 감염된 세포에서 바이러스 RNA 수준이 감소한 반면, 키누레닌 처리 및 JUNV 감염 세포는 바이러스 RNA 수준이 증가하는 경향이 있는 것으로 관찰되었습니다. RNA 수준(그림 6d,e).
이 작업에서 우리는 체외 JUNV 감염이 간 유래 세포 배양에서 AHR 신호 전달 경로의 활성화를 유도한다는 것을 처음으로 보여주었습니다. Microarray 분석 데이터는 AHR 신호 전달 경로가 JUNV 감염 세포 배양에서 48 h pi에서 과발현됨을 보여주었습니다.
여러 연구에서 AHR 활성화가 세포 생리학에 다양한 영향을 미쳐 증식 및 면역 선천적 반응에 영향을 미칠 수 있다고 보고했습니다[6,25]. 사실, 지난 10년 동안 AHR 활성화는 사이토카인 분비에 IFN 조절 활성을 발휘하는 효과를 갖는 것으로 기술되었습니다[26,27]. 중요한 것은 AHR 상향 조절 신호가 IFN-I 항바이러스 면역 반응을 감소시킬 수 있다는 것입니다[28]. 이와 관련하여 우리는 in vitro JUNV 감염 동안 AHR 길항제 및 작용제 작은 상업 분자를 사용하여 Vero 및 Huh-7 세포 모델과 같은 비적격 및 유능한 IFN 세포 배양에 대한 AHR 신호 전달 경로 변조의 영향을 평가했습니다. 두 개의 다른 감쇠 균주.
다양한 접근을 통해 CH223191의 약리학적 억제를 통한 AHR 음성 조절이 JUNV에 대한 항바이러스 활성을 가짐을 확인하였다. AHR 봉쇄 후 JUNV in vitro 감염이 억제된 것으로 나타났습니다. AHR 길항제로 처리한 JUNV 감염 세포 배양에서 바이러스 단백질 발현의 중요한 감소가 관찰되었습니다. 또한, AHR 봉쇄는 이 작업에서 연구된 JUNV의 약독화된 IV4454 및 Candid#1 균주 모두의 세포외 감염성 바이러스 입자 생산을 감소시켰습니다. 또한, CH223191- 처리된 세포에서 바이러스 RNA 수준이 감소하는 경향이 관찰되었습니다. 흥미롭게도 이러한 결과는 Huh-7 및 Vero 세포주 모두에서 관찰되었으며 동등한 크기를 보여 JUNV 감염 동안 AHR pro-viral 역할이 IFN-I 신호 전달 경로와 독립적일 수 있음을 시사합니다. 이러한 결과는 다른 바이러스 모델에 대한 우리의 이전 관찰과 일치합니다[13]. JUNV 복제 주기의 어느 단계가 AHR 봉쇄의 영향을 받는지 밝히기 위해서는 더 많은 연구가 필요할 것입니다.
인위적 리간드에 의한 AHR 활성화를 보여주는 연구는 부적절한 환경 착취 및 바이러스 감염 심각도와의 상호 작용과 관련된 인식이 높아짐에 따라 특별한 관심을 받았습니다[2]. JUNV 벡터 설치류가 다루는 서식지 지역은 넓은 지역으로 구성되어 있습니다. 그러나 현재 AHF는 주로 농촌 활동이 수행되는 제한적이고 제한된 지역에만 영향을 미칩니다[29]. 또한 농업 종사자는 AHF 질병 동안 심각한 증상을 겪을 위험이 있는 주요 인구입니다. 우리의 현재 작업은 AHR 작용제에 대한 설치류/인간 노출이 JUNV 감염의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다.
지난 수십 년 동안 arenavirus에 대한 항바이러스 연구에 많은 노력을 기울였으나 [30] 현재 AHF와 Arenaviridae의 다른 병원성 구성원에 의해 유발된 인간 질병의 치료에 사용할 수 있는 특정 항바이러스 화학 요법은 없습니다. 특히, 라사 바이러스(LASV)는 서아프리카 지역에서 매우 높은 사망률을 보이는 심각한 인간 위협을 나타내는 라사 열병(LF)의 병원체입니다[31]. 현재 LF에 대한 유일한 대체 치료법은 guanosine analog ribavirin의 off-label 사용인데 증상 발현 6일 이내에 투여를 시작해야만 LF 환자에서 부분적으로 효과가 있는 것으로 입증되었습니다[32,33]. 또한 리바비린은 부작용을 유발할 수 있어 위험이 높은 환자에게만 권장됩니다. 그 다음, arenavirus 출혈열의 치료를 위한 새롭고 효과적인 항바이러스제에 대한 실질적인 수요가 있습니다. AHR은 고려할 새 호스트 대상을 나타냅니다. 실제로 다양한 암 치료에 AHR 억제제(BAY2416964, IK-175 및 HP163)와 관련된 몇 가지 진행 중인 임상 시험이 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 시험은 초기 단계에 있으며 AHR 약리학적 표적의 항바이러스 가능성에 초점을 맞추지 않습니다. 눈에 띄게, 바이러스 증식 주기에 필요한 세포 인자에 대한 약물은 AHR과 관련된 기능인 여러 인간 병원체에 공통적인 숙주 표적에 영향을 미치는 광범위한 스펙트럼 억제제를 얻을 수 있는 기회를 제공하여 항바이러스 개발에 대한 관심을 다시 얻었습니다.
결론적으로, 본 연구의 결합된 결과는 JUNV에 대한 잠재적인 치료 표적으로서 AHR 신호 전달 경로 조절의 관련성을 강조한다. AHR 리간드를 원하는 조직 및 세포에 전달하여 가능한 오프 타겟 AHR 변조 효과를 최소화하는 것과 같은 중요한 문제를 극복하기 위해 AHR 표적 요법을 구현하기 위한 향후 연구가 필요할 것입니다.
저자 기여:
개념화, CCG; 방법론, MAP, AEADL 및 ABM; 소프트웨어, FG; 검증, MAP 및 FG; 공식 분석, MAP 및 MFT; 조사, MAP 및 MFT; 자원, EBD 및 CCG; 데이터 큐레이션, FG; 쓰기 - 원본 초안 준비, MAP 및 MFT; 쓰기 - 검토 및 편집, EBD 및 CCG; 감독, CCG; 프로젝트 관리, CCG; 자금 조달, EBD 및 CCG 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.
자금 조달:
이 작품은 Universidad de Buenos Aires(UBA)(보조금 번호 20020170100363BA)와 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas(CONICET)(보조금 번호 PIP11220170100171CO)의 지원을 받았습니다. EBD와 CCG는 CONICET의 Research Career 회원입니다. MFT, AEADL 및 ABM은 CONICET의 동료입니다. MAP은 UBA의 동료입니다.
기관 검토 위원회 성명서:
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정보에 입각한 동의서:
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감사의 말:
유용한 조언과 토론을 해주신 실험실의 모든 구성원에게 감사드립니다.
이해 상충:
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 자금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 데이터 수집, 분석 또는 해석, 원고 작성 시; 또는 결과를 게시하기로 결정했습니다.
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