나노 우유 단백질-점액 복합체: 특성화 및 항암 효과 2부
Mar 19, 2022
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3. 재료 및 방법
3.1. 재료
Plantago ovata(서브골) 껍질과 Ziziphus Spina-Christi(Nabeq)의 숙성 열매는 이집트 기자에서 구입했습니다. 농축 우유 단백질(MP, 81.3% 단백질)은 Fonterra사(Auckland, New Zealand)에서 구입했습니다. MPC의 카제인 및 유청 단백질은 대부분 고유하고 유사한 미셀 형태로 우유에서 발견되는 것과 유사합니다. 사용된 모든 화학 물질은 분석 순도였습니다.
3.2.Isabgol Husk Mucilage(IHM) 및 Nabeg Mucilage(NabM)의 제조
Isabgol husk mucilage(IHM) 및 Nabeq mucilage(NabM)는 El-Maksoud et al. [5]. 간단히 말해서, 1.2g을 100mL의 증류수에 용해시켜 isabgol husk의 현탁액을 제조하고 아세톤 용액으로 정제하였다. 생성된 겔은 사용할 때까지 냉장고(4-5도)에 보관하였다.
NabM의 경우 잘 익은 Nabeq 과일을 수돗물로 철저히 씻어 흙을 제거했습니다. 신선한 과일을 씨에서 분리하고 작은 조각으로 자른 후 증류수와 1:10(w/v)의 비율로 혼합하였다. 혼합물을 실험실 블렌더(Toshiba Mixie, Japan)를 사용하여 블렌딩하고 냉장고에서 12시간 동안 방치하였다.
그런 다음 점액질 추출물을 2000rpm에서 30분 동안 원심분리하고 모슬린 천을 통해 여과했습니다. 생성된 점성 가용성 점액을 아세톤으로 침전시켰다. 얻은 조 점액은 사용할 때까지 냉장고에 보관했습니다.
분석 목적으로 점액질은 40도의 공기 오븐에서 건조되고 볼 밀 MM400(Retsch, Germany)를 사용하여 분쇄됩니다. 차전자피 점액분말(PHMP)과 Nabeq 점액분말(NabMP)의 화학적 조성이 측정되었습니다. 수분, 단백질, 지방, 회분, 조섬유 및 총 탄수화물 함량은 PHMP가 8.49, 0.34,0.21,2.13,1.53,87.44%였고 NabMP가 9.18,4.72,2.05,2.69,1.70,78.26%였다. , 각각. 생성된 분말은 추가 분석이 있을 때까지 서늘한 온도({26}}도)에서 보관되었습니다.
3.3. 유단백-점액복합체(MPMC)의 제조
IHM 및 NabM이 있는 우유 단백질(MP) 복합체는 Morr et al.에 따라 약간의 수정을 거쳐 준비되었습니다[44]. 농축 우유 단백질은 증류수(1{8}}%)로 재구성되었습니다. 생성된 우유 단백질 콜로이드를 IHM 및 NabM과 1:3(o/o) 비율로 혼합했습니다. 혼합물의 pH를 1{13}}로 조정하고 10분 동안 방치했습니다. 그 후, 0.1 N HCl을 사용하여 pH를 3.5로 낮추고 추가로 10분 동안 방치하였다. 그 다음, 0.5M NaOH를 사용하여 pH를 pH 4.6으로 조정하여 여과지 상에서 여과하여 MPMC를 수집하였다: MP 및 생성된 MPMC를 Novalyphe-NL500 동결건조기를 사용하여 24시간 동안 -45℃에서 동결건조에 의해 건조시켰다. , Savant Instruments, Holbrook, NY, USA.
3.4. 물리화학적 및 기능적 특성
3.4.1.pH 측정
10% 용액에서 생성된 생성물의 pH는 보정된 pH 미터(HANNA, HI 902 m, 독일)를 사용하여 측정하였다.
3.4.2.벌크 밀도(BD), 탭 밀도(TD) 및 Carr's Index의 결정
MPMC 분말을 50mL 측정 실린더에 최대 25mL까지 붓고, 탭하지 않은 부피에 해당하고, 탭핑된 부피에 해당하는 분말의 부피 변화가 더 이상 나타나지 않을 때까지 5-10번 두드립니다.
벌크 밀도, 탭 밀도 및 Carr 지수는 다음 방정식을 적용하여 결정되었습니다[45].
(1)BD=질량/ 미개척 부피
(2)TD=질량/탭 부피
(3)Carr 지수( 퍼센트 )= (TD-BD)/TD×100
3.4.3. 수분 흡수 지수(WAI) 및 수용성 지수(WSD)
MP와 MPMC의 수용성과 흡수율은 Yagc와 Gogus가 기술한 방법에 따라 약간의 수정을 가하여 조사하였다[46]. 샘플({1}}.5g)을 원심분리관에서 25도의 증류수 10mL에 분산시켰다. 30분 동안 방치한 후, 5분마다 튜브를 뒤집어 샘플을 3500rpm에서 15분 동안 원심분리했습니다. 여과액을 알루미늄 판에 옮기고 105도에서 3시간 동안 건조시켰다. 남은 겔의 무게를 기록하고 WSI 및 WAI를 다음과 같이 결정했습니다.
(4)WAI(g/g)= 겔의 중량 증가/샘플의 건조 중량
(5) WSI 퍼센트=상청액의 건조 고형물의 중량 ×100/시료의 건조 중량
3.4.4. 우유 단백질 소화율
단백질 소화율은 Abd El-Ghany et al.에 따라 결정되었습니다. [47]. 간단히 말해서, MP 및 MPMC 샘플을 6.38 mg/mL의 농도로 증류수에 분산시키고 pH를 8.{5}}로 조정했습니다. 새로 준비된 효소 스톡 용액 1밀리리터(1.6mg/mL 트립신, 3.1mg/mL 키모트립신 및 1.3mg/mL ER 아미노 펩티다제1
(ERAP1)을 37도에서 단백질 현탁액과 혼합하였다. pH는 10분 후에 기록되었고 효소 활성은 카제인을 참조로 사용하여 결정되었습니다. 다음 방정식을 사용하여 단백질 소화율을 계산했습니다[47].
(6) 소화율= 210.46-18.10(pH)
3.5. PHM 및 NabM의 페놀 분획
HPLC 분석을 사용한 점액질 샘플의 페놀 화합물은 Elsayed et al. [48]. 간단히 말해서, 점액 추출물은 Agilent 1260 시리즈 HPLC 시스템(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 분석되었습니다. C18 컬럼(1{11}}0 mm x 4.6 mm id, 5 um)을 사용하여 분리를 통과했습니다. 이동상은 (A) 물 0.2% H3PO4, (B) 메탄올 및 (C) 아세토니트릴을 0.6mL/min의 유속으로 함유했습니다. 구배 용리는 다음 계획에 따라 이루어졌습니다. 0-11 min(96% A., 2% B);11-13 min(50% A, 25% B);{19}}min(40 퍼센트 A, 30퍼센트 B),17-20.5분(50퍼센트 B, 50퍼센트 C), 20.{27}}분(96퍼센트 A, 2퍼센트 B).검출 파장(UV 검출기, 284 nm)는 284 nm로 설정되었습니다. 주입 크기는 20 μL이었고 컬럼 온도는 30도를 유지했습니다. 화합물은 머무름 시간을 정품 표준의 머무름 시간과 비교하여 알려졌습니다. 보정 곡선을 사용하여 화합물 양을 평가했습니다.
3.6.MP 및 MPMC의 총 페놀 및 플라보노이드 함량
폴리페놀 함량은 약간의 수정과 함께 Folin-Ciocalteu 방법에 의해 결정되었습니다[5]. 간단히 말해서, 1{8}} mg의 MP 또는 MPMC를 포함하는 2.8mL의 밀리-Q워터를 2mL의 2% 탄산나트륨 및 0.1mL의 50% Folin-Ciocalteau 시약과 혼합했습니다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 반응 혼합물의 흡광도는 분광 광도계(Hitachi, Model 100-20)를 사용하여 블랭크로서 탈이온수에 대해 750 nm에서 측정되었습니다. Gallic acid(GA)를 표준 페놀 화합물로 사용하여 7점 표준 곡선(0-200mg/L)을 작성했습니다. 결과는 단백질 그램당 갈산 밀리그램 당량(GAE/g)으로 표시되었습니다.
플라보노이드함량은 Abedelmaksoud et al. 일부 수정[5]. 간단히 말해서, 10mg MP 또는 MPMC를 포함하는 2.8mL 밀리-Q 물을 010% 염화알루미늄 6수화물 1mL 및 1M 칼륨 아세테이트 0.1mL와 혼합했습니다. 실온에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 반응 혼합물의 흡광도를 415 nm에서 탈이온수에 대해 블랭크로 측정했습니다. 케르세틴은 7점 표준 곡선({13}} mg/L)을 사용하여 표준으로 사용되었습니다. 총 플라보노이드 함량은 밀리그램 케르세틴 당량(QE/g)으로 표시되었습니다.
3.7. MP와 MPMC의 항산화 활성
MP와 MPMC의 총 자유 라디칼 소거능은 세 가지 다른 항산화 분석을 사용하여 평가되었습니다. }}El-Maksoud et al.[5]에 의해 이전에 기술된 바와 같이 술폰산(ABTS) 및 수산기 라디칼(HS) 라디칼.
3.8. MP 및 MPMC의 아미노산 프로필
단백질 샘플은 Peksa et al.에 따라 6 N HCl을 사용하여 산 가수분해되었습니다. [49. 자동 아미노산 분석기(AAA 400, INGOs Ltd.)를 사용하여 아미노산을 측정하였다.
3.9. 유변학적 특성
샘플은 Barnes[50]가 설명한 대로 약간의 수정을 가하여 준비했습니다. pH 7에서 2.5%(w/w) 용액의 점도는 Brookfield 점도계(DV-II plus Pro, Rheocalc Software, Germany)를 사용하여 25±1도에서 측정되었습니다. 응력(σ) 및 점도(n)는 전단 속도의 함수로 표시됩니다. 거듭제곱 법칙 모델의 일관성 지수(K)와 흐름 거동 지수(n)는 다음과 같이 계산되었습니다.
n 값은 뉴턴 유체의 경우 1이고 전단 묽어지는 유체의 경우 0에서 1까지, 전단 농축 유체의 경우 1보다 큰 값입니다[51].
3.10.시차주사열량계(DSC)
MP와 MPMC의 열적 특성은 시차주사열량계(PerkinElmer, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료(4-6 mg)를 알루미늄 판에 넣고 밀봉하였다. 그런 다음 각 팬을 10도/분의 가열 속도로 20mL min-I에서 건조 질소 가스의 흐름으로 350도까지 가열했습니다-1. DSC 써모그램의 흡열 피크로부터 변성 개시 온도, 최대 전이 온도 및 분해점을 추정하였다[52]. DSC 곡선에서 흡열 피크 아래 영역으로부터의 전이 엔탈피 값(AH)을 결정하고 빈 알루미늄 팬을 기준으로 사용했습니다.
3.11. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)
FTIR 분광광도계(QFA Flex, USA)를 이용하여 600~3500 cm-I의 적외선 스펙트럼을 25도에서 4 cm-I의 분해능을 이용한 감쇠전반사법으로 10 스캔/초로 측정하였다.
3.12. 투과 전자 현미경
MP와 MPMC의 미세구조는 80kV에서 투과전자현미경(JEOL, JEM 1400 Flash, Japan)을 사용하여 가시화하였다. 음성 염색법의 cryo-stage를 적용하였다[53].
3.13.MP와 MPMC에 대한 생물학적 연구
3.13.1.체외 항암 활성
본 실험에 사용된 모든 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 입수하였다. 이 분석에서는 2개의 인간 암 세포주, 즉 유선 선암종(MCF{0}}, ATCCHTB-22TM) 및 간세포 암종(HepG2, ATCC4 HB-8065TM)이 사용되었습니다. 비암성 피부 섬유아세포 BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) 및 상피 유방 MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) 세포주도 비교를 위해 테스트되었습니다. 세포주는 10% 소태아혈청(FBS, Gibco, Brazil), 100U/mL 페니실린, 100ug/mL 스트렙토마이신, 및 25ng/mL가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM/high glucose, HyCloneTM, USA)에서 성장했습니다. mL 암포테리신 B(Sigma, Oakville, ON, Canada) 및 가습 인큐베이터에서 5% CO로 37도에서 배양했습니다. 배양 배지를 매일 새로운 배지로 교체하였다. 세포가 70% confluency에 도달하면 0.25% Trypsin-EDTA(1X) Gibco, Canada를 사용하여 세포를 분리하고 새 배양 플라스크로 옮겼습니다. 두 번째 계대 후, 세포를 트립신 처리하고 2x10* 세포/웰의 농도로 {{21}웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 24시간 배양 후, 배지를 따라내고, 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음, 서로 다른 농도의 단백질 샘플(1, 5, 10 및 20ug/mL)을 포함하는 200μL의 배양 배지로 처리했습니다. 독소루비신 HCl(4 ug/mL)을 양성 대조군으로 사용하고, 보충되지 않은 배지로 처리한 세포를 음성 대조군으로 사용했습니다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고,항암샘플의 활성은 Repetto et al.에 따라 중성 적색 흡수 분석을 사용하여 결정되었습니다. [54]. 간단히 말해서, 배양 기간 후, 배지를 무혈청 배지에 용해된 150 uL의 중성 적색 염료(100 mg/mL)로 교체하고 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 PBS로 헹구고, 150 μL의 용출 배지(EtOH/AcCOOH, 50∶1)를 첨가한 후 10분 동안 부드럽게 흔들어 완전히 용해되도록 하였다. 흡광도는 microtiter plate reader(BioTek, 96 Well Plates, ELX808, USA)를 사용하여 540nm에서 측정하였다.
여기서 Ac는 대조군의 흡광도이고 As는 샘플의 흡광도입니다. 세포 독성(%)으로 나타낸 세포 사멸 백분율 및 세포의 50%를 사멸시키는 농도(IC50)가 각 샘플에 대해 계산되었습니다.
3.13.2.p53, Bax, Caspase-3 및 Bcl{5}} 단백질 수준 측정
주요 세포사멸 단백질 마커의 세포 수준은 MP 및 MPMC의 IC로 처리 후 24시간 후에 결정되었습니다. 간단히 말해서, Hep G-2, MCF-7, Bj-1 및 MCF{5}}F 세포를 6-웰에 5× 10* 세포/웰로 시딩했습니다. 접시. 37도에서 샘플과 함께 24시간 동안 배양한 후, 세포를 수집하고 용해한 다음 4도에서 10,{12}rpm에서 20분 동안 원심분리했습니다. 단백질 농도는 Bradford 분석에 의해 상등액에서 정량화되었습니다[55]. 제조업체의 지침에 따라 비색 분석 키트(Abcam, ab39401)를 사용하여 Caspase{16}} 활성을 분석했습니다[56]. 요약하면, 50 uL의 Caspase 기질에 10 mg 단백질을 첨가하고 37도에서 반응 완충액을 사용하여 최종 부피를 200 μL로 조정하고 혼합물을 암실에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 Caspase{24} } 405 nm에서 농도.
효소 연결 면역흡착 분석법 단순 단계를 사용하여 세포 용해물에서 pro-apoptotic marker p53, 관련 X(Bax) 및 anti-apoptotic marker B-cell lymphoma-2(Bcl-2)의 수준을 측정했습니다. 제조사의 지침(ab207225, ab119506, ab199080; Abcam, USA)에 따른 ELISA [57,58].
3.13.3.산화 스트레스 보호로 인한 DNA 손상
DNA 손상 분석은 이전에 Leba et al. [59] 약간의 수정이 있습니다. 간단히 말해서, 3μL의 리보뉴클레아제 억제제 플라스미드 RNH1(NM_203387) Human Tagged ORF Clone 10 ug/μL를 Fenton 시약(5mM의 H2O2 및 0.3mM)과 혼합했습니다. FeSO4 및 0.6mM EDTA), 인산 완충액(H2POA, 8.3mM, pH 7.4)을 사용하여 최종 부피를 25μL로 조정했습니다. 그런 다음, 용액을 37도에서 20분 동안 인큐베이션하였다. Fenton 시약에 의해 유도된 DNA 손상에 대한 MP 및 MPMC의 항산화 보호 능력을 평가하기 위해 5 ug/mL MP/NabM, MP/IHM 및 MP가 배양 전에 추가되었습니다. RNH1 플라스미드 DNA(3 μL, 10 ug/μL)를 DNA 보호 대조군으로 사용했습니다.
3.13.4.PCR 기반 게놈 DNA 손상 분석
Homo sapiens methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) 유전자는 표준 DNA 추출 키트를 사용하여 이전에 건강한 혈액 샘플에서 추출한 혈액 게놈에서 PCR을 사용하여 증폭되었습니다 [60]. MP 또는 MPMC가 보충된 Fenton 시약을 사용하거나 사용하지 않고 DNA를 10분 동안 인큐베이션했습니다. 198-bp 단편은 정방향 5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' 및 역방향 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3' 프라이머를 사용하여 증폭되었습니다. 처리된 DNA 50ng를 이용하여 다음 열순환기(94도에서 5분, 변성 25주기, 94도에서 30초, 60도에서 어닐링, 30초, 72도에서 30초)에 따라 PCR 증폭을 수행하였다. 5분 동안 72도에서 25회 주기 및 1회의 최종 확장 주기. PCR 반응 샘플을 아가로스 겔 전기영동(2%)에 적용했습니다.
3.13.5. RT-qPCR에 의한 유전자 발현 프로파일링
IC50에 노출된 HepG-2, MCF{3}}, Bj{4}} 및 MCF{5}}F 세포를 사용하여 주요 pro- 및 anti-apoptotic marker 유전자의 유전자 발현 분석을 수행했습니다. 72시간 동안의 데이터(표 3). 요약하면, 제조사의 지시에 따라 Total RNA Purification Kit(QIAGEN., Thorold, ON, Canada)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA
합성은 Aboul-Sound et al. [61]. 증폭 프로그램 및 PCR 앰플리콘 특이성은 이전에 문서화된 바와 같이 Rotor-Gene O 5-Plex HRM 열 순환기(Qiagen, Germany)를 Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit(Qiagen, Germany)와 함께 사용하여 수행 및 평가되었습니다. 다음 표준 프로토콜 [61]. 다음 프라이머가 사용되었습니다: Hs_P53_1 SG QuantiTect 프라이머 분석(QT00060235); Hs{10}}CASP{11}}SG Quant-tiTect 프라이머 분석(QT00023947); B세포 림프종 2 Hs{16}}BCL{17}}SG QuantiTect 프라이머 분석(QT00025011);Bcl{19}}유사 단백질 Hs_BAX{21}}SG QuantiTect 프라이머 분석( QT00031192); 및 18S rDNA 하우스 키핑(HK) 유전자 Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect 프라이머 분석(QT00199367). 18S 유전자에 대한 배수 변화를 결정하기 위한 PCR 열 순환 프로그램 및 유전자 발현 분석은 본질적으로 이전에 보고된 대로 수행되었습니다[61].
3.14.통계분석
얻어진 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. 통계는 SPSSsoftware 11.5(SPSS, Inc.Chicago, IL, USA)를 사용하여 달성되었습니다. Duncan의 다중 범위 검정을 사용하여 모든 샘플 간의 유의한 차이를 결정했으며 차이는 p에서 유의한 것으로 간주되었습니다.<>
4. 결론
결론적으로, 이 연구는 우유 단백질을다당류용액 pH의 분화를 통해 착화에 적합한 기술입니다. 생성된 우유 단백질 점액 복합체(MPMC)는 상당히 높은 페놀 및플라보노이드DSC 결과는 MP와 다당류의 복합체가 변성 온도의 변화에 따라 열적 안정성을 크게 증가시키는 것으로 나타났습니다. FTIR 분석을 수행하여 작용기를 식별하고 제조된 복합체의 유동 거동을 조사했습니다. 우유 단백질의 WSI 및 WAI는 NabM 또는 IHM과의 복합화에 의해 증가되었습니다. TEM을 사용하여 준비된 복합체의 미세 구조를 시각화했습니다. 한편, 생성된 유단백 복합체와 isabgol husk mucilage(HM) 또는 Nabeq mucilage(NabM)는 항산화 및 항암 효과에서 천연 우유 단백질을 능가할 것으로 예상됩니다. 요약하면, MPMC는 중성 적색 흡수 분석에 의해 입증된 바와 같이 모델 유방암 및 간암 세포주(각각 MCF7 및 HEPG2)에 대해 독특한 항암 특성을 발현했습니다.
MPMC는 둘 다 향상항산화제및 반확산 활동. 카스파제는 세포자멸사 유도와 관련된 주요 조절 단백질입니다. caspase 3 단백질 및 mRNA 전사체의 상향 조절(그림 9A, B)은 Bax 유도 시토크롬 c 방출과 함께 미토콘드리아 막이 붕괴되고 caspase 9의 활성화로 이어지는 세포 사멸 경로의 다른 단백질을 제어합니다. caspase 3. Bcl{9}} 발현의 감소와 함께 Casp3, p53 및 Bax의 상향 조절은 MPMC가 p53의 상향 조절이 Bax의 발현을 자극하고 차례로 시토크롬 c를 유도하는 세포자멸사 유도를 유도함을 보여주었습니다. 릴리스, caspase{11}} 및{12}} 활성화. 또한 Bcl{13}}은 시토크롬 c 방출을 억제하는 것으로 알려져 있습니다. 우리 연구에서 MPMC로 유도된 Bcl{15}} 하향 조절은 반대되지 않는 Bax 유도 시토크롬 c 방출과 후속적인 세포자멸사를 촉진하는 것으로 나타났습니다.
단백질-다당류 복합체의 항암 효과는 부작용을 최소화하면서 저렴하고 효율적인 암 치료법의 개발에 사용할 이러한 복합체의 적용 가능성에 대한 계몽을 제공합니다.
