니코틴은 프로그래밍된 세포 사멸에 의해 Tacrolimus로 유발된 신장 손상을 악화시킵니다
Mar 23, 2022
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유지 장, Sheng Cui, Kang Luo, Jun Ding
소개
새로운 면역억제제의 발견에도 불구하고, 타크로리무스(TAC)는 고형장기 이식에서 면역억제 요법의 초석으로 남아 있습니다. 그러나 TAC를 장기간 사용하면 부작용(예: 신독성, 신경독성, 감염, 악성종양, 당뇨병, 위장 장애)의 위험이 증가합니다[1]. 이 중 급성신장부상또는 만성 TAC 신독성은 폐 이식 수혜자의 46%[2]와 신장 이식 수혜자의 22.4%[3]에서 보고되었습니다. 급성인 동안신장부상TAC 용량 감소 또는 완전한 중단 후 가역적인 것으로 간주되며, 동종이식 손실을 초래하는 만성 신독성은 비가역적입니다. 만성 TAC 신독성은 사구체병증, 구심성 세동맥의 유리질증 및 줄무늬 세뇨관간질 섬유증(TIF)이 특징입니다[4]. 이 임상적 딜레마의 정확한 기전은 아직 알려지지 않았지만, 우리는 최근 산화 스트레스 유발 염증, 변형 성장 인자 1(TGF- 1) 및 프로그램된 세포 사멸이 중요한 역할을 할 수 있음을 입증했습니다[5]. 흡연은 삶의 질을 저하시키는 중요한 공중 보건 문제이자 사회적 재정적 부담입니다. 역학 보고서에 따르면 현재 전 세계적으로 10억 명 이상의 흡연자가 있으며 담배 사용으로 인해 매년 600만 명이 사망합니다. 이러한 비율은 특히 개발도상국이나 미개발 국가에서 증가하고 있습니다[6]. 흡연이 다양한 암, 심혈관계 질환(심근경색 및 뇌졸중), 폐쇄성 폐질환의 위험인자라는 것은 잘 알려져 있습니다. 신장에서 흡연은 당뇨병, 고혈압, 다낭성 환자에서 신장 기능 장애의 중증도를 증가시킵니다.신장질병, 그리고 신장 이식 후 [7]. 또한 흡연은 기존의 만성 신장 질환(CKD)이 없는 건강한 인구에서도 새로운 신장 손상을 일으킬 수 있습니다[8]. 이 연구는 다음을 평가하고자 했습니다: (1)니코틴담배 흡연의 주요 독성 성분인 (NIC)는 TAC로 인한 신장 손상을 악화시킵니다. 그렇다면 (2) 어떤 메커니즘이 NIC(니코틴)-가속 신독성.
cistanches Herba는 신장 기능을 완화할 수 있습니다
결과
NIC의 효과(니코틴)기본 매개변수에
표 1은 NIC의 영향을 간략하게 보여줍니다.(니코틴)실험 그룹의 기본 매개 변수에. 둘 다 NIC(니코틴)및 TACincrease UV(polyuria), NIC에 의해 더욱 증가(니코틴)및 TAC 처리. 둘 다 NIC(니코틴)TAC도 BW 손실을 방지하지 못했습니다. 소변 단백질 배설, Scr, BUN 및 Cys-C는 두 NIC 모두에서 현저히 높았습니다.(니코틴)및 VH 그룹과 비교한 TAC 그룹; 이 수준은 두 약물의 조합으로 더욱 증가했으며, 이는 NIC가(니코틴)TAC로 인한 신장 기능 장애를 가속화합니다. 그룹 간에 유의미한 SBP 차이는 없었습니다. 4주간의 TAC 치료는 혈중 TAC 농도를 11.{4}}±og ng/mL로 증가시켰지만 NIC는(니코틴) did not influence blood TAC concentration(12.8±15 ng/mL,p>o.o5 vs. TAC). 또한, NIC로 정상 랫트 치료(니코틴)그 결과 혈청 및 소변 코티닌 농도가 각각 56.5±17ng/mL 및 8;6±192.6ug/일 증가합니다. 이러한 혈청 및 소변 코티닌 농도는 활성 흡연자인 인간에서 관찰되는 농도와 유사합니다[13].
표 1. NIC의 효과(니코틴)기능적 매개변수
NIC의 효과(니코틴)만성 TAC 신독성의 조직병리학
만성 TAC 신독성은 줄무늬 TIF 및 사구체병증을 포함한 독특한 조직학적 특징이 특징입니다. 조직학적 염색과 전자현미경을 통해 우리는 TAC로 인한 사구체 손상이 사구체 기저 비후와 족세포 족돌기의 소실에 의해 나타난다는 것을 발견했으며(그림 IA, IC 및 D), 이는 소변 단백질 배설 증가와 관련될 수 있습니다. 정량적 분석에서 두 NIC 모두(니코틴)TAC는 NIC에서 관찰된 추가 증가와 함께 부분적 메산지움 영역을 증가시켰습니다.(니코틴)및 TAC 그룹. 만성 TAC 신독성의 주요 변화는 tubulointerstitial 지역에 국한되었으며, tubulointerstitial fibrous 침착, tubular atrophy 및 striped fibrosis로 묘사됩니다(그림 1B, 1E 및 F). 그림은 NIC의 TIF 점수가(니코틴)플러스 TACgroup은 NIC보다 높았습니다.(니코틴)그룹 또는 TACgroup.
그림 1. 과요오드산-Schiff(PAS)의 대표적인 현미경 사진(A), Masson trichrome(B), 투과 전자 현미경(CF) 및 사구체 손상 및 세뇨관 간질 섬유증(TIF)의 정량 분석, (C) 사구체 기저막 비후(화살표), (D) 족세포 발의 소실 과정(화살표), (E) 세뇨관 간질의 팽창 및 광범위한 콜라겐 침착(산란), (F) 위축된 세관(화살표).VH, 비히클; NIC(니코틴), 니코틴; TAC, 타크로리무스. 피
NIC의 효과(니코틴)만성 TAC 신독성에서 profibrotic cytokine 발현
본 연구에서는 profibrotic cytokine TGF{0}} 및 CTGF의 발현과 ig-h의 세포외 기질(ECM) 성분을 비교하고자 했습니다. 실험군 사이. TIF 조사 결과와 일치, NIC(니코틴)TAC에 의해 유도된 pro-fibrotic TGF{2}}와 CTGF 및 ECM ig-h3의 과발현 증가(그림 2)
그림 2. 면역 블로팅 분석의 대표적인 현미경 사진(A) 형질전환 성장 인자 1(TGF-B1), (B TGF- -유도 유전자-h(ig-h3) 및 (C) 결합 조직 성장 인자(CTGF)에 대한. 단백질 발현에 대한 값은 다음과 같습니다. 차량(VH) 그룹을 100% 참조로 사용하고 -actin으로 정규화합니다.(니코틴), 니코틴;TAC, 타크로리무스. 3p
NIC의 효과(니코틴)만성 TAC 신독성에서 염증에 대하여
TAC로 인한 신장 손상에서 염증에 대한 NIC의 효과를 정의하기 위해 우리는 면역 블로팅 및 면역 조직 화학에 의한 염증 유발 매개체 및 파이로프토시스 관련 유전자의 발현을 연구했습니다. 그림 3은 TAC 처리가 pyroptosis 관련 사이토카인(IIL-1, IL{5}}, NLRP3) 및 MCP-1의 발현을 상향 조절하여 ED-1-양성을 나타냄을 보여주었습니다. 세포 침윤, 그리고 NIC의 병용 치료에 의해 추가 증가가 발견되었습니다.(니코틴)그리고 TAC.
그림 3. 외배엽 이형성증에 대한 면역조직화학의 대표적인 현미경 사진-1 (ED-1)(A) 및 전염증성 사이토카인에 대한 면역블롯팅 분석(B). VH, 차량; NIC(니코틴), 니코틴; TAC, 타크로리무스; MCP-1, 단핵구 주화성 단백질-1;IL, 인터루킨; NLRP3, NOD 유사 수용체 피린 도메인 함유 단백질3. 피
NIC의 효과(니코틴)만성 TAC 신독성에서 산화 스트레스
그림 4와 같이 만성(니코틴)TAC 처리는 산화제와 항산화 효소 사이의 불균형과 밀접한 관련이 있습니다[12,14. Immunoblotting 분석에서는 NIC가 TAC로 유도된 NOX-2 및 NOX-4 발현을 상향 조절했지만 SOD1 및 SOD2 발현은 억제하는 것으로 나타났습니다. 또한, 산화 스트레스 지표인 8-OHdG의 혈청 및 소변 수준은 VH 그룹에 비해 NIC 및 TAC 그룹에서 더 높았고 NIC + TAC 그룹에서 가장 높았습니다. 이러한 발견은 이 모델에서 산화 스트레스에 대한 NIC와 TAC의 시너지 효과를 암시합니다.
그림 4. 일련의 산화 스트레스 관련 단백질(A) 및 혈청(B) 및 요(C)의 면역블롯팅 분석의 대표적인 현미경 사진8-하이드록시-2'-데옥시구아노신(8-OHdG) 농도. VH, 차량; NIC(니코틴), 니코틴; TAC, tacrolim-us; SOD, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; NOX,NADPH 산화효소.Bp
NIC의 효과(니코틴)만성 TAC 신독성에서 예정된 세포 사멸에 대하여
유형 I(아폽토시스) 또는 유형 II(자가포식) 프로그램된 세포 사멸은 만성 TAC 유발 신장 손상의 발병기전에 관여합니다[1s]. TUNEL assay를 이용하여 대부분의 TUNEL 양성 세포나 세포사멸체가 tubular atrophy와 전형적인 TIF가 진행되는 tubular 상피세포와 interstitial vascular endothelial cell에 국한되어 있음을 관찰하였다(Fig. 5A). 정량적 분석은 두 NIC 모두(니코틴) TAC는 VH 그룹과 비교하여 TUNEL-양성 세포를 유의하게 증가시켰습니다. 이것은 NIC + TAC 그룹에서 더 두드러졌습니다. 분자 수준에서 NIC의 추가(니코틴)TAC 처리된 쥐에게 Bcl{1}}/Bax의 상당한 조절 장애와 세포 사멸을 향한 절단된 caspase{2}} 발현을 초래했습니다(그림 5B). 또한, 전자 현미경은 TAC 처리가 NIC, TAC 및 NIC에서 초기 자가포식 액포(AVi), 분해성 자가포식 액포(Avd) 및 미토파지(선택적 자가포식의 한 형태)와 같은 자가포식 구획의 풍부한 형성을 유도함을 보여주었습니다. 플러스 TAC 그룹(그림 6). 정량적 면역블롯팅은 TAC 처리된 쥐의 신장에서 볼 수 있는 p62, LC3B, PINK1 및 Parkin 단백질의 과발현이 NIC에 의해 추가로 증가되었음을 보여주었다(그림 6G 및 6H).
그림 5. TdT 매개 dUTP-비오틴 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 분석의 대표적인 현미경 사진(A) 및 세포사멸 조절 유전자에 대한 면역 블로팅 분석(B).니코틴처리는 타크로리무스 처리된 랫트 신장에서 TUNEL-양성 세포(화살표)를 증가시킨다.VH, 비히클; NIC(니코틴),니코틴; TAC, 타크로리무스; Bcl, B-세포림프종; Bax, Bcl{1}}관련 X. p
NIC의 효과(니코틴)만성 TAC 신독성에서 미토콘드리아 기능장애에 대하여
투과전자현미경으로 우리는 두 NIC가(니코틴)TAC는 미토콘드리아 크기와 수 감소, 조직화되지 않은 크리스타, 공포화, 융합, 미토파지 형성 및 2개 또는 3개의 딸 소기관 분열로 분할된 미토콘드리아 구조를 파괴했습니다(그림 6). 정량적 분석 결과는 NIC가(니코틴) 치료는 NIC 또는 TAC 단독 치료에 비해 미토콘드리아의 수와 크기를 더욱 감소시켰습니다. Immunoblotting 분석은 Nicor TAC에 의해 유도된 미토콘드리아 관련 단백질(OPA1 및 Drpi)의 조절장애가 NIC 및 TAC의 동시 투여에 의해 악화되었음을 보여주었습니다(그림 6).
그림 6. 자가포식 및 미토콘드리아 형태의 대표적인 투과 전자 현미경 사진(AF), 면역블롯팅 분석(G, H), 각 처리군의 미토콘드리아 수 및 크기 정량. (A) 타크로리무스(TAC) 및/또는 신장에서의 자가포식 형성니코틴(NIC) 처리된 쥐(화살표), (B) 'TAC 및/또는 NIC의 미토콘드리아 신장을 포함하는 자가포식 구획(니코틴)처리된 쥐(미토파지, 화살표); (C) 정상 미토콘드리아; (D) TAC 및/또는 NIC의 신장에서 감소된 미토콘드리아 수(니코틴)처리된 쥐;(E) TAC 및/또는 NIC 처리된 쥐의 신장에서 보이는 미토콘드리아 융합(원),(F) 미토콘드리아가 TAC 및/또는 NIC 처리된 쥐의 신장에서 2개 이상의 딸 소기관으로 분할됨(분열, 원) . VH, 비히클, LC3B, 경쇄 3B, PINK1, 10번 염색체에 의해 유도된 키나제 1에서 결실된 포스페이트 및 장력 상동체, OPA, 시신경 위축 단백질; Drp, dynamin-related protein.p
피세틴~에 대한신장
NIC의 효과(니코틴)만성 TAC 신독성에서 소포체 스트레스
그림 7에서 보는 바와 같이, Nicor TAC는 거친 소포체(ER)에서 리보솜의 탈과립화, 분리되고 확장된 수조, 퍼옥시솜 공포화를 유도한 반면, 매끄러운 ER 구조는 거의 정상을 유지했습니다(그림 7B). Immunoblotting 분석에 따르면 NIC는(니코틴)또는 TAC는 CHOP, Bip, IRE-1 및 ATF-6를 포함한 ER 스트레스 관련 유전자의 발현을 증가시켰지만 이들의 발현은 둘의 조합에 의해 더욱 증가되었다(그림 7C).
그림 7. 투과 전자 현미경 검사법(A, B)의 대표적인 현미경 사진 및 내포체(ER) 스트레스 관련 유전자의 면역 블로팅 분석(C).(A) 정상적인 거친 ER(화살표), (B) 리보솜 탈과립, 분리 및 확장된 수조, 거친 ER의 소포 확장니코틴(NIC) 및/또는 tacrolimus(TAC) 처리된 쥐 신장. VH, 비히클, CHOP, C/EBP 상동 단백질, Bip, 결합 면역글로불린 단백질; IRE-1c,이노시톨 필요 단백질-1c; ATF, 활성화 전사 인자. 피< o.01="" vs.vh,="">
논의
흡연은 건강한 인구와 기저 질환(예: 당뇨병, 고혈압)이 있는 환자 모두에서 CKD 진행에 대한 중요한 수정 가능한 위험 요소입니다. 임상 시험에서는 흡연이 요중 알부민 배설을 증가시키고 신장 기능에 악영향을 미친다는 것을 보여줍니다[16]. 또한, 금연은 CKD 및 제2형 당뇨병 환자에서 단백뇨를 개선하고 말기 신장 질환으로의 진행을 늦출 수 있습니다[1-,18]. 더욱이, 수혜자 또는 기증자 흡연은 거부 에피소드 및 만성 동종이식 신병증에 기여하여 신장 이식에서 동종이식 손실을 초래합니다[19,2o]. 이러한 흡연의 해로운 영향(NIC(니코틴))는 s/6 신장 절제술[2al 및 당뇨병성 신장병증[o])의 설치류 모델 연구에 의해 반영됩니다. 본 연구에서 우리는 NIC가(니코틴)악화된 TAC-유도된 부분적 메산지움 영역 및 TIF. 이러한 병리학 적 변화는 신장 기능 장애를 더욱 두드러지게 하고 요단백 배설을 증가시켰습니다. 이러한 결과 및 기타 보고서에 기초하여, 우리는 담배 흡연이 TAC 기반 면역억제제를 투여받는 이식 환자에서 신장 동종이식 손실을 가속화할 수 있다고 제안합니다.
염증은 진행 중인 신장 흉터에 선행하기 때문에 만성TAC신독성의 진행에서 중추적인 역할을 합니다. 유해한 자극에 대한 반응으로 증가된 전염증 매개체는 염증 세포를 모집할 수 있으며, 이는 차례로 화학 유인 물질, 접착 분자 및 TGF와 같은 전염증 및 섬유화 촉진 사이토카인을 과발현합니다- 1. 우리는 최근에 NLRP{2}}의존적이고 독립적인 inflammasome이 만성 TAC 신독성[s]의 발병기전에 관여한다는 것을 입증했습니다. 우리의 결과는 NIC 관리가(니코틴)TAC 처리된 쥐는 pyroptosis 관련 유전자(NLRP3, IL{3}} 및 I-18), 전염증 매개체 MCP-1 및 profibrotic cytokine TGF- 및 CTGF의 발현을 증폭하여 과도한 ED{7}}양성 세포 유입 및 ig-h 상향 조절; 이러한 반응은 사구체 및 세뇨관 손상의 심각성을 반영합니다. 우리의 발견은 Arany et al.[22] 및 Agarwal et al.[23]의 결과와 일치하며, 이는 NIC가 신장 염증 및 섬유증에 미치는 영향을 보여줍니다.
비록 NIC(니코틴)- 이 모델에서 만성 TAC 신독성의 악화는 다인성일 수 있으며, 산화 스트레스의 영향과 관련이 있을 수 있습니다. 만성 TAC 치료는 구심성 동맥병증 관련 저산소증과 밀접하게 관련되어 있으며, 이는 후속적으로 산화 스트레스와 연결되며, 이는 결과적으로 섬유증성 TGF{2}} 과발현을 활성화시켜 섬유증을 유발합니다. 이 구조는 항산화 요법(예: 코엔자임 Q10)이 만성 TAC 신독성에서 미토콘드리아 완전성의 보존을 통해 TGF{4}} 발현과 TIF를 약화시킨다는 관찰에 의해 뒷받침됩니다. 최근에 체외 연구의 압도적인 증거는 만성 NIC 노출과 다양한 신장 손상에서 산화 스트레스 사이의 상호 관계를 보여줍니다[o,25,26. 여기에서 우리는 NIC가 혈청 및 소변의 8-OHdG 수치를 증가시키고 산화 단백질 발현을 증가시키는 반면 항산화 단백질 발현을 억제하여 TAC 유발 산화 스트레스와 섬유증을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 실제로, 이 연구에서 TAC 처리된 신장의 NIC 악화는 산화 스트레스에 기인할 수 있습니다.
cistanche 발기 부전
또한 apoptosis(type I programed cell death)와 autophagy(type II programed cell death)가 NIC에 관여할 수도 있습니다.(니코틴)-가속된 만성 TAC 신독성. 이전에 설명한 바와 같이 NIC는 족세포 및 신장 근위 세뇨관 세포 사멸을 직접 유도합니다[27,28]. 또한 산화 스트레스[2g] 또는 TGF- 1[22]의 활성화를 통해 간접적으로 세포 사멸을 유도합니다.NIC(니코틴)또한 췌장 성상 세포 Bo], 신생아 마우스 심장 근육 세포 31], 혈관 평활근 세포 32]에서 자가포식을 유도할 수 있습니다. 따라서 산화 스트레스와 프로그램된 세포 사멸은 상호 연관되어 있습니다. TUNEL 분석과 전자 현미경을 사용하여 우리는 NIC가 TAC 처리된 쥐 신장에서 관상 상피 세포, 간질 혈관 내피 세포 및 자가포식 구획에서 TUNEL 양성 세포의 수를 유의하게 증가시키는 것을 분명히 관찰했습니다. 이러한 형태학적 변화는 쥐의 신장에서 세포자멸사 또는 자가포식 관련 유전자의 조절 장애를 동반하여 세포 사멸을 초래했습니다. 이 누적 증거는 NIC가(니코틴)스트렙토조토신(STZ) 유발 당뇨병성 신병증[o] 및 CKD 모델에서 이전에 보고된 바와 같이 그 자체가 산화 스트레스 및 예정된 세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라 신장에 대한 TAC의 부작용을 촉진하여 신장 기능 장애 및 구조적 손상을 초래합니다. s/6 신장절제술) B3].
또한, 미토콘드리아 기능 장애 및 ER 스트레스와 같은 산화 스트레스 유발 세포 내 소기관은 만성 TAC 신독성 완전성에 중요한 역할을 하고, ER 스트레스를 유발하고, 미토콘드리아 및 ER 스트레스 조절 유전자의 조절 장애를 일으키며, 이 두 가지를 병용 치료하면 효과가 악화됩니다. . 따라서 미토콘드리아 체력의 악화와 ER 스트레스는 NIC의 영향을 설명할 수 있습니다.(니코틴) TAC 유발 신장 손상
우리의 연구는 NIC가(니코틴)15mg/kg의 용량에서 산화 스트레스, 염증 및 예정된 세포 사멸을 통해 TAC 유발 신장 손상을 악화시키며, 이는 이전 연구[27,37,38]와 일치합니다. 그러나 다른 사람들은 반대 결과를 관찰했습니다. Sadis et al.Bg]는 NICat의 0.s mg/kg 용량이 콜린성 항염증 경로를 통해 허혈/재관류 손상으로부터 신장을 보호한다는 것을 보여주었습니다. Agarwal et al.의 또 다른 연구[23] NIC를 사용한 장기간의 경구 치료가 보고되었습니다.(니코틴)(28주) 자발성 단백뇨의 쥐 모델(Munich-Wistar-Frömter 쥐)에서 재생능력 보호 효과 부여. 신장에서 NIC의 역할에서 이러한 불일치에 대한 이유는 알려져 있지 않지만 NIC 용량, 약물 치료 기간 또는 설치류 모델에 따라 달라질 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 이 연구는 NIC가 만성 TAC 신독성 쥐 모델에서 TAC 유발 신장 손상을 악화시킨다는 것을 분명히 보여줍니다. 산화 스트레스의 악화와 예정된 세포 사멸은 NIC의 해로운 영향을 뒷받침하는 하나의 메커니즘일 수 있습니다. 우리의 연구 결과는 이식 수혜자들 사이에서 흡연의 영향에 대한 더 큰 통찰력을 제공합니다.
신장 기능의 cistamche
참조
1. Bentata Y. Tacrolimus:성인 신장 이식에서 2년 사용: 신독성에 대해 알아야 할 사항. 인공 기관 202044140-152.
2. Sikma MA, Hunault CC, van de Graaf EA, et al. 폐 이식 후 조기에 높은 타크로리무스 혈중 농도 및 신장 손상 위험. Eur J Clin Pharmacol 201773:573-58o.
3. Yagisawa T, Omoto K, Shimizu T, Ishida H, Tanabe K. 무시간 생검에서 동맥경화증은 타크로리무스 유발 만성 신독성의 위험 요소입니다. 신장학(Carlton)201s;2o Suppl2:s1-57.
4. Nankivell BJ, P'Ng CH, O'Connell PJ, Chapman JR. 종조직학의 렌즈를 통한 칼시뉴린 억제제 신독성: 사이클로스포린과 타크로리무스 시대의 비교. 이식 2016;1oo:1723-171.
5. Lim SW, Shin Y, Luo K, et al. tacrolimus로 인한 신장 손상에서 자가 포식 제거에 대한 Klotho의 효과. FASEB J 2o193:2694-2706.
6. Lim SS, Vos T, Flaxman AD, et al.A 21개 지역의 67개 위험인자 및 위험인자 클러스터에 기인하는 질병 및 부상 부담의 비교 위험 평가,199o{4}}o:에 대한 체계적인 분석 글로벌 질병 부담 연구 201o.Lancet 2o12;38o:{10}}o.
7. Formanek P, Salisbury-Afshar E, Afshar M. ESRD 및 CKD 초기 단계의 환자가 금연하도록 돕습니다. Am J Kidney Dis 2018;72:255-266.
8. Jain G, Jaimes EA.니코틴흡연자의 만성 신장 질환의 신호 및 진행. Biochem Pharmacol 2013;{1}}.
9. Zhang LY, Jin J, Luo K, et al.Shen-Kang은 타크로리무스 유발 신장 손상으로부터 보호합니다. 한국 JIntern Med 2019341078-1090.
10. Ibrahim ZS, Alkafafy ME, Ahmed MM, Soliman MM. 당뇨병과 당뇨병의 결합된 산화 스트레스에 대한 커큐민의 신장 보호 효과니코틴쥐에서. Mol Med Rep 2016;13:3O17-3026.