서로 다른 에너지 상태에서 C2C12 근육모세포에 대한 α-케토글루타레이트 보충의 효과에 대한 NMR 기반 대사체학 분석

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1. 소개

골격근은 인체에서 가장 큰 기관으로 정상적인 생활 활동을 유지합니다.장기간의 운동 훈련또는 병리학l 질병의 과정은 근육 손상을 유발합니다또는불충분한 근육 에너지 공급, 이때 근력과 기능의 회복이 특히 중요하다. 골격근 비대를 촉진하고 스포츠 성능을 향상시키기 위해 다양한 영양 보충제가 사용되었습니다[1]. 유기 탄소 및 질소 대사의 교차점이자 동시에 TCA 주기의 중요한 중간체로서 -Ketoglutarate(AKG)는 임상 및 동물 실험에서 근육 성능을 향상시키는 다발성 효과를 보여주었습니다[2-9]. 예를 들어 AKG는 장 점막 손상[8]과 염증[9]을 줄이고대장암의 발달[4] 및 간 섬유증[5], 성장 촉진[6], 이환율 및지연 노화[7]. 이전 연구에서는 AKG 보충이 고관절 전치환술을 받는 환자의 외상 모델에서 비경구 투여로 근육 손실을 완화할 수 있고[2], Akt/mTOR 신호 경로를 통해 근육 비대 및 단백질 합성을 촉진할 수 있음을 입증했습니다[10,11]. Duchenne 근이영양증의 경우 AKG 보충은 PHD3/ADRB2- 매개 경로를 통해 근육 위축 및 기능 장애를 예방할 수 있습니다[12]. 우리의 이전 연구는 또한 AKG 보충이 C2C12 근모세포의 증식을 크게 촉진하고 무포도당 배지에서 배양된 C2C12 근관의 위축을 완화할 수 있음을 보여주었습니다[13]. 포도당이 골격근의 정상적인 생리 기능을 유지하는 주요 에너지원이라는 점을 감안할 때, 근육 성능 향상을 위한 AKG 보충의 효과는 골격근의 포도당 수준에 크게 의존합니다. 다른 에너지 상태 사이의 골격근에서 AKG 유발 효과의 차이는 불분명합니다.

AKG는 아미노산, 비타민,유기산그리고에너지 대사글루타메이트 탈수소효소에 의해 AKG가 글루타메이트로 전환되고, 이어서 글루타민 합성효소에 의해 암모니아로 글루타메이트가 아미드화됩니다. AKG는 TCA 회로와 산화적 인산화를 통해 세포 성장을 위한 에너지를 제공하고 세포막의 수용체 OXGR(G 단백질 결합 수용체)과 상호 작용하여 세포 대사 및 신호 전달을 촉진합니다[14,15]. 또한 AKG는 미토콘드리아 산화 대사를 조절하고 초기 배아 세포 상태 전이와 생식 세포 발달을 매개함으로써 허용되는 후성유전적 상태를 촉진할 수 있습니다[16]. 또한 운동 유발 AKG는 부신의 수용체 OXGR1을 자극하여 지방 조직에서 열 생성 및 트리글리세리드 분해를 제어하고 대사에 유익한 효과를 생성할 수 있습니다[17].

그러나 다양한 에너지 상태에서 골격근의 AKG 유도 대사 변화와 기본 대사 메커니즘을 밝히기 위한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 최근에는 영양 보충의 유익한 효과를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 체계적으로 밝히기 위해 대사체학 분석이 사용되었습니다. 유전자 전사의 하류 산물로 작용하는 대사산물의 교대는 전반적인 대사 변화를 직관적으로 반영할 수 있습니다. 생체액, 조직 및 세포에서 대사산물 수준의 변화를 정량적으로 검출하는 데 특히 적합한 기술로서 고분해능 1H 핵 자기 공명(NMR) 분광법이 대사체 분석에 광범위하게 적용되었습니다. 중요한 것은 NMR 기반 대사체 프로파일링이 높은 재현성, 편견 없는 정량 측정, 편리한 시료 준비와 같은 몇 가지 장점을 가지고 있다는 것입니다[18,19]. 이전에 우리는 C2C12 근모세포에 대한 크레아틴 보충의 효과와 에너지 결핍으로 손상된 근모세포에 대한 알라닐-글루타민 보충의 효과를 모두 밝히기 위해 NMR 기반 대사체학 분석을 수행했습니다[21].

2. 결과

2.1. AKG 보충을 통한 C2C12 근모세포의 증식 및 분화

AKG 보충 유무에 관계없이 정상 성장 배지에서 배양된 C2C12 근모세포 세포는 Nor-A 및 Nor로 분류된 반면, AKG 보충 유무에 관계없이 저혈당 성장 배지에서 배양된 세포는 Low-A 및 Low로 분류되었습니다. 이전 연구[10]와 일치하게, 2mm 농도에서 AKG 보충을 한 Nor-A 세포는 Nor 세포에 비해 현저하게 향상된 세포 생존력을 나타냈습니다(그림 S1).

따라서, AKG에 의한 근모세포의 증식 및 분화 변화를 평가하기 위한 실험에서는 AKG 농도 2mm를 사용하였다. Nor 세포와 비교하여 Low 세포는 에너지 결핍으로 인해 증식률이 크게 감소했습니다(그림 1A). AKG 보충은 두 가지 에너지 상태에서 근육모세포의 형태가 크게 다르지는 않았지만 저혈당 배지에서 배양한 Low 세포의 증식률을 향상시켰을 뿐만 아니라 이전 연구[10,12]. 근아세포의 4개 그룹(그룹의 경우 n=4): Nor, 563.8 ± 10.4; Nor-A, 624.0 ± 10.8; 낮음, 493.8 ± 14.5; 낮은 A, 547.0 ± 11.7(그림 1B). Low-A 세포는 Nor 세포와 통계적으로 다른 세포 수를 나타내지 않았으며, 이는 AKG 보충이 저혈당 배양 조건에서 근모세포의 세포 수를 회복할 수 있음을 나타냅니다(그림 1B).

그림 1, 정상 배양 조건과 낮은 조건에서 C2C12 근아세포의 증식 및 분화 능력. 포도당 배양. (A) 근모세포 형태. (B) 패널 A에 해당하는 셀 번호(n=4). (C) MTS 세포 증식 검정(n=5)에 의해 분석된 Nor 세포에 대한 세포 생존율. (D) 웨스턴 블롯에 의해 분석된 근모세포에서의 MyoD1 발현. 항-GAPDH 항체를 사용하여 각 레인의 단백질 양을 표준화했습니다. (E) 패널(D)(n=4)에 해당하는 통계 분석. * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

또한, 4개 그룹의 세포 증식률을 정량적으로 비교하기 위해 MTS 분석을 수행하였다(도 1C). 저혈당 세포는 Nor 세포에 비해 확연히 감소된 증식률을 보였고, 이는 저혈당 배지가 세포 증식에 ​​불리함을 나타냅니다. 의미심장하게도, AKG 보충은 각각 Nor 및 Low 세포에 비해 Nor-A 및 Low-A 세포의 증식률을 향상시켰습니다. Low-A 세포는 Nor 세포보다 낮은 증식 능력을 보였으며, 이는 AKG 보충이 저혈당 배지에서 배양된 세포의 증식을 부분적으로만 회복시켰음을 의미합니다.

.근원성 분화 1(MyoD1) 단백질의 발현은 일반적으로 세포의 분화 능력을 특성화하는 데 사용됩니다. 따라서 우리는 4개의 세포 그룹 간에 MyoD1의 발현을 정량적으로 비교했습니다(그림 1D). Low 세포는 Nor 세포에 비해 분화 능력이 크게 저하되었습니다. 의미심장하게도, AKG 보충은 Nor-A 및 Low-A 세포에서 MyoD1 발현이 약 30% 증가한 것으로 나타난 바와 같이 정상 배지와 저포도당 배지 모두에서 배양된 세포의 분화 능력을 상향 조절했습니다. 특히, Low-A 세포는 Nor 세포와 통계적으로 유의하게 다른 MyoD1 발현을 나타내지 않았으며, 이는 저혈당 배지에서 배양된 세포의 분화 능력을 회복하기 위한 AKG 보충의 높은 효율을 의미합니다.

또한, 우리는 C2C12 근육모세포의 4개 그룹에 대한 근관 분화 능력을 분석했습니다. AKG 보충 유무에 관계없이 정상 및 저 포도당 분화 배지에서 배양 된 근육 아세포의 융합을 통해 근관이 형성되었습니다 (그림 S3). C2C12 근관의 형태는 저혈당 배양이 세포의 근관 분화 능력을 손상시켰으며, AKG 보충은 정상 배지와 저-포도당 배지 모두에서 배양된 근모세포의 근세포 분화를 촉진할 수 있음을 보여주었습니다.

2.2. C2C12 근육모세포의 수성 추출물의 NMR 스펙트럼

일반적인 850MHz 1H NMR 스펙트럼은 C2C12 근육모세포의 Nor, Nor-A, Low 및 Low-A 그룹에서 파생된 수성 추출물에 기록되었습니다(그림 2A). 총 34개의 대사산물이 할당되어 표 S1에 요약되어 있습니다. 대사산물의 공명 할당은 2D 1H-13C HSOC 및 1H-H TOCSY 스펙트럼을 사용하여 확인되었습니다(그림 S4 및 S5). NMR 스펙트럼의 육안 검사는 AKG 보충으로 근아세포를 배양하면 Nor-A 및 Low-A 세포에서 세포내AKG가 상당히 축적되는 것으로 나타났습니다(그림 2B).

그림 2, C2C12 근육모세포의 Nor, Nor-A, Low 및 Low-A 그룹에서 파생된 수성 추출물에 기록된 평균 850 MHz lH 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼. (A) 네 그룹의 평균 NMR 스펙트럼 비교. 수직 눈금은 모든 1H NMR 스펙트럼에서 일정하게 유지되었습니다. 물 영역(4.7-5.2ppm)이 제거되었습니다(B) α-Ketoglutarate(AKG) 피크의 국소 증폭 영역. 파란색/녹색/노란색/빨간색 선: Nor/Nor-A/Low/Low-A 그룹의 스펙트럼 영역. AKG, α-케토글루타레이트; PC, O-포스포콜린; GPC, sn-글리세로-3-포스포콜린UDP-글루코스, 우리딘 2인산 글루코스: CTP, sn-글리세로-3-포스포콜린; NAD 플러스, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 AXP 아데닌 모노/디/트리포스페이트.

2.3. 세포 대사 프로필 탐색을 위한 다변량 데이터 분석

우리는 C2C12 근육모세포의 4개 그룹의 대사 프로파일링을 위해 NMR 스펙트럼 데이터에 대한 다변량 데이터 분석을 추가로 수행했습니다. 먼저 그룹화 추세를 살펴보고 근모세포 그룹 간의 대사 차이를 밝히기 위해 처음 두 구성 요소(PC1, PC2)를 사용하여 3개의 감독되지 않은 PCA 모델을 설정했습니다. ThePCA 점수 도표는 저혈당 배지에서 배양된 세포의 대사 프로필이 정상 배지에서 배양된 세포와 뚜렷하게 구별되었음을 보여줍니다(그림 3A). 저포도당 배지에서(그림 3B,C). 그러나 Nor-A와 Nor 그룹 사이의 대사 차이는 Low-A와 Low 그룹 사이의 차이보다 더 컸으며, 이는 근모세포의 대사 프로파일에 대한 AKG 보충의 효과가 세포의 에너지 상태에 크게 의존한다는 것을 의미합니다.

그림 3. 'HNMR 스펙트럼에 대한 다변량 분석은 Nor, Nor-A, Low 및 Low-A 그룹의 C2C12 근육모세포에서 파생된 수성 추출물에 기록되었습니다. (AC) Low 및 Nor 그룹, Low-A 및 Low 그룹, Nor-A 및 Nor 그룹의 PCA 스코어 플롯; (DF) Low 및 Nor 그룹(R2: 0.999, 02: 0.996), Low-A 및 Low 그룹(R2: 0.918: 02: 0.761), Nor-A 및 Nor 그룹(R2: 0.927: 02: 0.838). 생략 부호는 95% 신뢰 한계를 나타냅니다.

또한, 우리는 근모세포의 4개 그룹 간의 대사 분리를 설명하기 위해 3개의 감독 OPLS-DA 모델을 확립했습니다(그림3D-F). 예상대로 OPLSDA 모델은 상관 직교 변수 정보를 예약하고 상관 관계가 없는 직교 변수 정보를 필터링하여 네 그룹 간의 대사적 차이를 최대화했습니다. 또한, 우리는 확립된 OPLS-DA 모델의 유효성을 나타내는 OPLS-DA 모델(그림 S6)의 신뢰성을 평가하기 위해 무작위 순열 테스트(n=200)를 수행했습니다.

2.4. 차별적이고 중요한 대사 산물의 식별

C2C12 근육모세포의 4개 그룹 간의 대사산물 수준을 정량적으로 비교하기 위해 식별된 대사산물의 상대적 수준을 상대 적분을 기준으로 계산했습니다(표 S2). 극적으로 AKG 보충은 Nor-A 및 Low-A 그룹에서 세포내 AKG 수준을 증가시켰지만 Nor 및 Low 그룹에서는 크게 변화시키지 않았습니다. 우리는 p<0.05(그림 4)의 기준으로 차등 대사산물을 식별하기 위해 Student's t-test를 수행했습니다. Nor vs. Low의 비교는 18개의 향상된 대사 산물(류신, 이소류신, 발린, 아세테이트, 글루타메이트, 글루타민, 메티오닌, 아스파르테이트, 리신, 크레아틴, PC(O-포스포콜린)타우린, 티로신을 포함하여 29개의 차등 대사 산물을 확인했습니다(그림 4A). , 페닐알라닌, 히스티딘, NAD 플러스, 포르메이트, AXP) 및 11개는 Metabo를 거부했습니다. 라이트(글루타티온, 피로글루타메이트, 포스포크레아틴, 베타-알라닌, GPC, 글루코스, 글리신, 아세테이트, 트레오닌, GTP, UDP-글루코스). 7개의 증가된 대사 산물(에탄올, AKGbeta-알라닌, PC, 타우린, 글리신 및 GTP)과 3개의 감소된 대사 산물(글루타민, 라이신 및 미오이노시톨)을 포함하는 Low-A 대 Low 식별 차등 대사 산물(그림 4B)의 비교. Nor-A 대 Nor의 비교는 6개의 상향 조절된 대사 산물(AKG, 피로글루타메이트, 글루타민, 리신, 포도당, 젖산염) 및 12개의 하향 조절된 대사 산물(알라닌, 아세테이트, 글루타티온)을 포함하는 18개의 차등 대사 산물(그림 4C)을 확인했습니다. 메티오닌, 포스포크레아틴, PC, 미오이노시톨, 글리신, 트레오닌, GTP, UDP-포도당 및 AXP).

그림 4. C2C12 근육모세포의 4개 그룹 간의 쌍별 비교를 통해 차등 대사산물의 상대적 강도를 확인했습니다. (A) 낮음 대 없음; (B) 로우 A 대 로우; (C) Nor-A 대 Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.n { 각 그룹에 대해 {13}}.

또한 OPLS-DA 모델을 사용하여 VIP > 1 기준으로 중요한 대사 산물을 식별했습니다(그림 5). Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs. Low의 OPLS-DA 모델에서 총 12, 10, 10개의 중요한 대사체가 동정되었다.

그림 5. 중요한 대사물의 VIP 점수는 C2C12근모세포의 4개 그룹 간의 쌍별 비교에서 확인되었습니다. (A) 낮음 대 없음; (B) 로우 A 대 로우; (C) Nor-A 대 Nor. 빨간색/파란색 글꼴은 대사물의 증가/감소 수준을 나타냅니다.

확인된 중요한 대사산물과 차등 대사산물의 조합은 특징적인 대사산물을 제공했습니다(표 1). Low vs. Nor, Low-A vs. Low, Nor-A vs. Nor의 쌍별 비교는 각각 10, 6, 10개의 특징적인 대사산물을 확인했으며, 근모세포에 대한 AKG 보충의 효과가 에너지와 밀접한 관련이 있음을 나타냅니다. 세포의 상태.

2.5. 현저하게 변화된 대사의 식별

경로 우리는 대사 경로 분석을 수행하여 C1C12 근육모세포의 4개 그룹 간의 쌍별 비교에서 확인된 대사 산물의 수준을 기반으로 크게 변경된 대사 경로(유의한 경로)를 확인했습니다(그림 S7, 표 2 및 표 S3). Nor vs. Low의 분석은 11가지 중요한 경로를 식별했습니다. (1) 알라닌, 아스파르트산염 및 글루타메이트 대사; (2) 글리신, 세린 및 트레오닌 대사; (3) 글루타티온 대사; (4) D-글루타민 및 D-글루타메이트 대사; (5) 전분 및 자당 대사; (6) 베타-알라닌 대사; (7) 타우린 및 하이포타우린 대사; (8) 페닐알라닌 대사; (9) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성; (10) 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사; (11) 히스티딘 대사. 이 중요한 경로는 에너지 대사, 산화 스트레스 및 TCA 주기 보충 플럭스와 관련이 있습니다.

Nor-A 대 Nor의 분석은 다른 6개 경로 6-11을 제외하고 처음 5개의 중요한 경로 1-5를 식별했습니다. 다르게, Low-A 대 Low의 분석에서는 6개의 중요한 경로만 확인했습니다. Low와 Nor의 비교에서 공유되는 두 경로 6-7. AKG 보충은 저포도당 배지에서 배양된 세포에서 경로 5(전분 및 자당 대사)를 크게 변경하지 않았지만 두 가지 다른 경로(베타-알라닌 대사 및 타우린 및 하이포타우린 대사)를 방해했습니다. 특성 대사 산물의 AKG 유도 변화를 시각화하기 위해 이러한 대사 산물을 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 데이터베이스를 기반으로 한 대사 지도에 투영했습니다(그림 6). KEGG는 대사 네트워크를 재구성하고 중요한 대사 경로를 강조하기 위한 주요 데이터 리소스 중 하나로 광범위하게 사용되었습니다. 변화된 특성 대사산물과 현저하게 변화된 대사 경로는 AKG 보충이 C2C12 근육모세포에 미치는 영향의 근간을 이루는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.