라디칼 소거 및 노화 방지 속성에 대한 NMR 기반 대사체학 프로파일링 파트 2
Jun 06, 2022
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2.5. 주성분 분석에 의한 허브 추출물의 분류
다변수 데이터 분석(MVDA)을 사용하여 테스트한 허브 잎 사이의 대사 산물 변이를 추가로 분석했습니다. 패턴 인식 방법인 PCA(주성분 분석)는 샘플 간의 연관성에 대한 주요 이해를 제공하는 감독되지 않은 MVDA입니다. PCA 점수 도표는 허브를 클러스터로 분리하는 것을 보여 주는 반면, 로딩 도표는 분리를 제공하는 대사 산물을 강조 표시했습니다[85,{1}}]. PCA 모델은 R2X(cum)와 Q2(cum) 사이의 변동이 0 미만인 좋은 적합도(R2X=0.997)와 높은 예측 가능성(Q2=0.993)을 나타냈습니다. .3, 따라서 각 허브 추출물이 관찰된 그룹 분리에 동등하고 고르게 기여했음을 나타냅니다. 이 관찰은 Wheelock et al. [87].
주성분 분석 점수 플롯은 선택된 허브가 그림 4A와 같이 현저한 이상값 없이 두 개의 클러스터로 분리되었음을 보여줍니다. 주성분(PC)1이 가장 큰 표본 변동을 보였고 PC2가 그 뒤를 이었습니다. PC1과 PC2는 각각 29.7%와 24.9%의 분산 백분율에 기여했습니다. 따라서 약 54.6%의 총 분산이 이 PC에 의해 설명되었습니다. 로딩 컬럼 플롯의 결과는 허브를 PC1의 긍정적인 측면(V.negundo 및 C.longa)과 PC1의 부정적인 측면(P. 마이너스, P. indica, O.javanica 및 C. caudatus)(그림 4B).
PC1의 로딩 컬럼 플롯의 데이터는 주로 플라보노이드 그룹과 페놀산인 페놀 화합물이 선택된 허브의 분리를 담당한다는 것을 발견했습니다. 케르세틴(1), 케르세틴-3-O-람노사이드(2), 케르세틴-3-O-글루코사이드(3), 케르세틴-3-O-글루쿠로나이드(4), 케르세틴{11}} O-아라비노푸라노사이드(5), 루틴(6), 엠브리세틴 유도체(7), 카테킨(8), 에피카테킨(9), 이소르함네틴(10), 아스트라갈린(11), 클로로겐산(12), 갈산(13), 쿠마르산(14), 아스코르브산(15), 포름산(21), 푸마르산(22), 3-메틸크산틴(26) 및 아피게닌(28) 함량은 P. 마이너스, P. 인디카에서 대부분 높았다. , C. caudatus 및 O.javanica는 플롯의 부정적인 면에 위치했기 때문입니다. 대조적으로, V.negundo와 C.longa는 추출물에 세로토닌(27)과 D-리모넨(29)의 존재에 의해 다른 허브와 구별되었습니다.
2.6. 부분 최소 제곱 분석(PLS)을 사용한 생체 활성과 대사 산물 간의 상관 관계
측정된 생체 활성과 테스트한 허브에서 발견되는 대사 산물 사이의 연관성을 이해하기 위해 감독된 MVDA 방법론으로서 PLS를 구현하여 독립 변수 데이터(대사 산물의 NMR 화학적 이동)를 종속 변수 데이터와 상호 연관시켰습니다. DPPH, ABTS 및 ORAC 분석뿐만 아니라 항엘라스타제 및 항콜라게나제 활성의 억제였습니다. 이 방법론은 PLS가 시험된 생체 활성을 대사 산물과 연결하여 예측을 위한 모델을 제공할 수 있다는 큰 성과를 가지고 있기 때문에 적용되었습니다[88]. PLS 분석을 통해 라디칼 소거 활성과 같은 생체 활성과 시료 내 대사 산물과의 노화 방지 특성 간의 관계를 설정할 수 있습니다. 따라서 생리 활성 마커 역할을 하는 대사 산물이 제안될 수 있습니다.
biplot은 Mediani et al.에 의해 보고된 바와 같이 PLS 분석의 결과로 스코어와 로딩 플롯이 혼합된 것입니다. [80]. 라디칼 소거 활성(그림 5A) 및 노화 방지 특성(그림 5B)에 대한 부분 최소제곱 바이플롯은 모든 샘플이 주목할만한 이상치 없이 잘 분리되고 클러스터링되었음을 보여주었습니다. PC1은 V. negundo, O.jaoanica 및 C.longa로부터 P. 마이너스, C.caudatus 및 P. indica의 잎을 분리하였다. biplot의 급진적 소거 활성 및 노화 방지 특성을 기반으로 모델은 각각 {{10}}.988 및 0.966의 우수한 적합도(R'Y) 값을 나타냈습니다. 한편, 라디칼 소거 활성 및 노화 방지 특성에 대한 예측 가능성(Q4)은 각각 0.984 및 0.951로 나타났습니다.
라디칼 소거 활성의 PLS biplot(그림 5A)에서 볼 수 있듯이, 생물학적 활성(DPPH, ABTS 및 ORACassay)은 biplot의 긍정적인 면으로 지시되었으며, 이는 가장 활동적인 영역이자 P.minus, P에 가장 가깝습니다. 인디카 및 C.caudatus. 대조적으로 V. negundo, O.javanica, C. longa는 활성이 가장 적은 영역으로 간주되어 DPPH, ABTS, ORAC assay에서 멀리 떨어져 있는 biplot의 음의 면을 향하여 음의 상관관계를 보였다. 생물학적 활성으로. 이 상황에서 P. mimus, P. indica 및 C.caudatus는 활성이 가장 낮은 허브와 떨어져 클러스터링되어 이러한 허브가 더 강한 라디칼 소거 효과를 나타냄을 나타내므로 이러한 허브 추출물이 더 높은 수준의 페놀 화합물. 가장 활성이 높은 3가지 허브 중 P. 마이너스가 DPPH 및 ABTS 분석과 더 강하게 상관관계가 있는 것으로 나타났고, ORAC 분석이 그 뒤를 이었습니다.
이 발견은 수행된 라디칼 소거 활동의 시험관 내 결과와 일치했습니다. 결과는 P. 마이너스가 다른 허브와 비교하여 강력한 자유 라디칼 소거 효과를 나타냄을 보여주었습니다. 따라서 결과는 P. 마이너스가 활성 산소종 박멸제에 대해 가장 활성인 허브임이 밝혀졌습니다. P. 마이너스의 라디칼 소거 활성에 기여한 중요한 2차 대사산물은 케르세틴, 케르세틴{0}}O-람노사이드, 카테킨, 이소르함네틴, 아스트라갈린 및 아피게닌으로 확인되었습니다.오테플라보노이드이러한 모든 대사 산물은 P. 마이너스 및 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 분석에 더 가깝게 위치했습니다. Mediani et al.의 이전 연구[80] 또한 동결 건조된 식물 샘플이 더 많은 양의 -포도당, -포도당, 카테킨 및 클로로겐산을 나타냈으며, 이는 허브의 강력한 DPPH 라디칼 소거 능력에 기여했을 수 있습니다. 그러나 P.minus의 높은 라디칼 소거 효과는 추출물의 미확인 대사 산물에 의해 기여할 수도 있습니다.
노화 방지 특성에 대해서도 유사한 결과가 발견되었습니다. 그림 5B는 노화 방지 특성의 PLS에서 얻은 바이플롯을 나타냅니다. 생물학적 활성(항 엘라스타제 및 항 콜라게나제 활성)은 가장 활동적인 영역이고 P.minus, P. indica 및 C.caudatus에 더 가까운 biplot의 긍정적인 쪽에 투영되었습니다. 대조적으로, V.negundo, O.javanica 및 C.longa는 가장 활성이 적은 영역으로 간주되고 항엘라스타제 및 항콜라게나제 활성에서 더 멀리 떨어진 biplot의 음의 측에 지시되었다. 이것은 생물학적 활성에 대해 음의 또는 약한 상관관계를 보여주었다. 이 상황에서 P.mimus, P.indica 및 C. caudatus는 활성이 가장 낮은 허브에서 떨어져 클러스터링되어 이러한 허브 추출물이 더 큰 엘라스타제 및 콜라게나제 억제를 나타냄을 나타냅니다. 가장 활동적인 3가지 허브 중 P. 마이너스는 다른 허브에 비해 이러한 노화 방지 특성과 강한 상관 관계가 있음이 다시 밝혀졌습니다.
이 발견은 이전에 수행된 노화 방지 특성의 시험관 내 결과와 일치했습니다. 결과는 P.minus가 엘라스타제 및 콜라게나제 효소를 억제하는 가장 활성적인 허브임을 보여주었다. P. 마이너스의 노화 방지 특성에 기여한 중요한 이차 대사 산물은 케르세틴, 케르세틴-3-O-람노사이드, 미리세틴 유도체, 카테킨, 이소르함네틴, 아스트라갈린 및 아피게닌으로 확인되었습니다. -포도당, -포도당, 푸마르산 및 지방산과 같은 다른 대사 산물도 생체 활성의 원인이 될 수 있습니다. 이 모든 대사 산물은 P. 마이너스 및 항 엘라스타제 및 항 콜라게나제 활성에 더 가깝게 위치했습니다.
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이들 선별된 허브의 구별은 특히 높은 라디칼 소거 활성 샘플과 일치하였다. 마이너스, P.India 및 C.caudatus는 2차 대사산물, 특히 flavonoid의 높은 농도로 인해 다른 것과 구별될 것으로 예상되며, 이러한 페놀 화합물의 존재는 또한 더 큰 엘라스타제 및 콜라게나제 억제 활성에 기여하는 것으로 여겨집니다. 이 허브 [67-79,{1}}].
자유 라디칼 소거 능력과 노화 방지 활성에 대한 식물 추출물의 생리 활성 화합물의 기여는 다양한 연구에 의해 문서화되었습니다[66,72,75,79,92-101]. 또한 플라보노이드(퀘르세틴, 캠페롤, 미리세틴, 에피카테킨, 카테킨)와 같은 대사산물과 레스베라트롤 및 프로시아니딘 B2와 같은 기타 페놀은 엘라스타제와 콜라게나제를 유의하게 억제하는 것으로 입증되었습니다[69-71,79].
본 연구에서는 예측(VIP) 값에서 변수 중요도에 대한 대사 산물 신호를 식별하고 검토하여 테스트된 생체 활성과 상관 관계가 있는 가장 중요한 대사 산물을 얻습니다. 이것은 확인된 대사 산물의 판별 가능성을 조사한 여기에 제시된 결과의 무결성을 높이기 위해 수행되었습니다.청교도 비타민 CGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}.5는 차별에 중요한 것으로 고려되었습니다[102]. 본 연구에서 라디칼 소거 활성 및 노화 방지 특성에 기여하는 모든 대사 산물은 VIP 값이 1.0 이상이므로 유의미한 식별 대사 산물로 분류할 수 있습니다(표 2). 두 개의 PLSbiplots 모델은 100개의 무작위 순열을 사용하여 검증되었으며, 적합도와 비교하여 여러 모델을 사용하여 원래 모델의 유효성(R2) 및 예측(Q2) 능력을 확인했습니다. R2는 모델 적합도가 유의하고 모델에서 Y 변수의 등급을 설명하는 반면 Q2는 Eriksson et al이 보고한 것과 유사한 모델 예측 품질을 제공했음을 보여줍니다. [103].
Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). 결과는 R의 모든 Y축 절편이< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>시스탄체R2 및 Q2 인터셉트 값은 각각 0.0367-0.0872 및-0.444 ~-0.492 범위에 있어 두 PLS 모델이 모두 유효함을 나타냅니다. 그리고 과적합을 나타내지 않았다. 따라서 이 두 PLS 모델은 우수한 성능 모델로 분류될 수 있으며 이러한 결과는 모델의 신뢰도를 높였습니다.
2.7. 이차 대사 산물의 상대적 정량화
선택된 허브에서 확인된 일부 2차 대사 산물의 상대적 정량화는 그림 6에 나와 있습니다. 이러한 대사 산물은 P. 마이너스와 같은 가장 활동적인 허브에서 대부분 더 높게 발견되었으며 biplots의 긍정적인 쪽에 위치했으며, 테스트한 거의 모든 생체 활성에 더 가깝습니다.시스탄체란 무엇인가이러한 결과는 특히 P. 마이너스에 다량으로 존재하는 플라보노이드 그룹의 2차 대사산물이 이 허브의 자유 라디칼 박멸제 및 노화 방지 특성에 기여했을 수 있음을 보여주었습니다.
플라보노이드의 효과에 기여할 수 있는 다양한 구조의 플라보노이드와 비교할 때 B-고리의 하이드록실화 패턴이 노화 효소 활성에 대한 대사 산물의 억제 효과에 대한 중요한 요인 중 하나일 수 있다는 점에 주목했습니다[80] . Sim et al.[104] 또한 단백질과 mRNA 수준 모두에서 이러한 플라보노이드의 억제 효과는 B-고리의 그룹 수가 증가함에 따라 강력해졌으며 MMP에 대한 일부 플라보노이드의 구조-활성 연관성을 조사했습니다-1 UV-Airradiated 인간 진피 섬유아세포에서 유전자 발현.
3. 재료 및 방법
3.1. 화학물질 및 시약
중수소화 메탄올-d4(CH3OH-d4), 비중수소화 KH2PO4, 산화중수소나트륨(NaOD), 트리메틸실릴프로피온산-d4나트륨염(TSP), 에탄올 및 메탄올은 Merck Millipore International(Darmstadt, Germany)에서 공급했습니다. 케르세틴, 인산염 완충액, 2,{11}}디페닐{12}}피크릴히드라질(DPPH), 2,{14}}아지노비스({15}}에틸-벤조티아졸린{17}}술폰산)[ABTS ],Trolox,과황산칼륨,2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)[AAPH, 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG),HEPES 완충제, 엘라스타제 효소,N-메톡시 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide 및 deuterium oxide(D2O)는 Sigma(Aldrich, Germany)에서 공급했습니다.
3.2. 식물 재료 및 샘플링
Felda Sungai Koyan Satu, Raub 및 Pahang에서 O.jacanica, P. 마이너스 및 C.longa의 신선한 잎을 수집했습니다. V.negundo 잎은 Universiti Putra Malaysia의 Institute of Bioscience에서 얻었습니다. P. indica의 신선한 잎은 Universiti Putra Malaysia의 University Agriculture Park에서 수확되었고 C. caudatus 잎의 신선한 잎은 Selangor의 Serdang에 있는 Agricultural Institute에서 수집되었습니다. 이 허브의 바우처 표본은 Universiti Putra Malaysia, Institute of Bioscience의 식물 표본관에 배치되었으며 각 표본은 식물학자가 검증했습니다.안티에이징 시스탄체모든 잎은 대사 산물 함량의 신뢰성을 보장하기 위해 화창한 날 아침에 일관되게 수확되었습니다. 각 허브에 대한 개방 필드의 플롯은 6개 부분으로 분리되었으며 각 샘플은 각 세그먼트에서 6개의 복제물로 수집되었습니다.
3.3.샘플 준비
일단 수확한 신선한 잎은 흐르는 수돗물로 세척하여 모든 잔류물을 제거하고 실험실 티슈 페이퍼로 건조하고 액체 질소로 즉시 동결하여 모든 효소 반응을 중지하고 동결 건조 전에 대사 산물을 보존했습니다. 그런 다음 샘플을 LABCONCO(Kansas City, MO, USA) 동결 건조기에서 일관된 중량 및 수분 함량이 10% 미만에 도달할 때까지 건조했습니다. 건조된 시료는 모두 실험실용 블렌더를 이용하여 고운 분말로 분쇄하고 실험실용 시험체(ENDECOTTS LTD.London, England)로 300 um 크기로 체과하여 균일한 크기를 얻었다. 분말 샘플은 빛 노출과 습기로부터 보호하기 위해 알루미늄 포장에 진공 포장되어 분석 전에{3}}도 보관되었습니다.
3.4. 추출
Mediani et al.에 의해 설명된 추출 절차. [105] 약간의 수정이 뒤따랐다. 간단히 말해서, 각 분말 샘플 10g을 호박색 원뿔형 플라스크에 60% 에탄올 100mL에 담그고 제어된 온도(40도 미만)에서 초음파 배쓰 초음파기(WiseClean, 모델 WUC-D10H, 서울, 한국)를 사용하여 1시간 동안 초음파 처리했습니다. . 검체는 Whatman 여과지 1호로 여과하고 잔사는 2회 재추출하고 1차 추출이 완료된 후 여과하였다. 그런 다음 추출물을 모으고 회전 증발기를 사용하여 진공 하에 40도에서 농축시켰다. 그런 다음 파생된 점성 물질을 LABCONCO 동결 건조기를 사용하여 동결 건조하여 물을 완전히 제거하고 나중에 사용할 때까지{12}} 도에서 보관했습니다. 마지막으로, 건조된 조 추출물은 수행된 모든 조사에 필요한 농도로 희석되었습니다.
3.5. DPPH 라디칼 소거 활성
샘플의 라디칼 소거 활성은 Brand-Williams 등의 수정된 방법에서 개발된 Kong 등[1{4}}6]이 개발한 기술에 따라 결정되었습니다. [107]약간 수정되었습니다. 간단히 말해서, 다양한 농도(0~500ug/mL)의 메탄올 중 50uL 샘플 추출물을 195uL 새로 제조된 0.2m메탄올산2,{10}}디페닐{11}피크릴히드라질(DPPH) 용액과 함께 첨가하고 보관했습니다. 모든 테스트 샘플은 96 웰 플레이트에서 준비되었습니다. 탈색 과정은 어둠 속에서 60분간 배양한 후 분광광도계(Biotek EL 800 microplate reader, Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 515 nm에서 기록하고 양성 대조군과 블랭크 샘플과 비교했습니다. 라디칼 소거 활성의 백분율은 하기 식에 따라 측정하였다:
여기서 A 대조군은 식물 추출물이 없는 대조군의 흡광도이고 단순은 식물 추출물의 흡광도입니다.
안정한 자유 라디칼 DPPH의 50%를 소거한 식물 추출물 또는 양성 대조군 농도는 에 대한 라디칼 소거 활성 백분율의 선형 그래프를 사용하여 IC로 계산되었습니다.
식물 추출물/양성 대조군 농도. 낮은 ICso는 더 높은 항산화 활성을 나타냅니다. 모든 실험은 Trolox와 케르세틴을 양성 대조군으로 사용하여 6회 반복 실행했습니다.
3.6.ABTS 라디칼 소거 분석
ABTS 라디칼 소거 분석의 경우 Arnao et al.[1{5}}8]이 설명한 절차에 따라 일부 수정을 가하여 분석을 수행했습니다. 제조된 스톡 용액은 7mM ABTS 플러스 용액 및 2.45mM 과황산칼륨 용액이었다. 작동 용액을 준비하기 위해 두 원액을 같은 양으로 혼합하고 실온에서 16시간 동안 암실에서 반응시켰다. 그런 다음, 작업 용액을 증류수로 희석하여 분광 광도계(UV{10}}PC 분광 광도계, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 734 nm에서 흡광도가 0.700±0.005 단위가 되도록 했습니다. ABTS 플러스 솔루션입니다. ABTS plus 용액은 모든 분석에 대해 새로 준비되었습니다. 이 ABTS 플러스 용액(900μL)을 100μL의 허브 추출물과 2분 동안 반응시켰다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 판독했습니다. 3.1 ug/mL ~ 50 ug/mL Trolox를 포함하는 표준 곡선을 개발하고 그 결과를 mg Trolox 등가 항산화 용량/g 샘플(mg TEAC/g 샘플)로 표시했습니다.
3.7. ORAC 라디칼 소거 분석
퍼옥실 라디칼 소거 효능을 측정하기 위한 ORAC 분석은 Huang et al. FLUOstar OPTIMA 마이크로플레이트 형광 판독기(BMG LABTECH, Ortenberg, Germany) 사용. 각 허브 추출물과 Trolox(표준)는 75mM 인산완충액(PBS) pH 7.4에서 제조되었습니다. 96-웰 블랙 마이크로플레이트에 총 150μL의 플루오레세인(PBS에 용해된 10nM)을 첨가한 다음 25μL의 Trolox, 식물 추출물 또는 PBS를 공백으로 첨가했습니다. 이러한 용액을 3중 웰에서 피펫팅했습니다. 마이크로플레이트를 37도에서 15분 동안 인큐베이션하고 뚜껑으로 덮었다. 형광은 458 nm에서 여기 파장 및 520 nm에서 방출 파장으로 측정되었습니다. 배경 신호는 90초마다 측정하여 결정했습니다.
그 후, 25 uL 새로 준비된 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)(AAPH, PBS 중 240mM)를 온보드 인젝터로 도입했습니다. 형광의 감쇠는 동일한 여기 및 방출 파장을 사용하여 최대 90분까지 수행되었습니다. 샘플의 곡선 아래 영역(형광 대 시간)에서 블랭크의 곡선 아래 영역을 뺀 값을 표준 곡선(25-400 μM Trolox)과 비교하여 평가했습니다. Trolox와 관련된 ORAC 값은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다.
3.8.엘라스타제 억제 분석
Elastase 억제 활성은 Ndlovu et al. [75]. 샘플 웰에는 25μL 0.1M HEPES 완충액(pH7.5), 25μL 허브 추출물(100ug/mL) 및 25μL 엘라스타제 효소(1ug/mL)가 포함되어 있습니다. 블랭크 웰에는 75μL HEPES 완충액만 포함되어 있고 음성 대조군 웰에는 50μL HEPES 완충액 및 25μL 엘라스타제 효소가 포함되어 있습니다. 양성 대조군 웰은 25μL HEPES 완충액, 25μL N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro(10ug/mL) 및 25μL의 엘라스타제 효소를 함유했습니다. 용매 대조군 웰에는 25μL HEPES 완충액, 25μL의 10% 메탄올 및 25μL 엘라스타제 효소가 포함되어 있습니다. 허브 추출물에 대한 빈 대조군(시험된 모든 추출물의 색상 대조군에 대해)에는 150μL HEPES 완충액과 25μL의 허브 추출물이 포함되어 있습니다. 그런 다음 마이크로웰 플레이트를 실온에서 20분 동안 인큐베이션했습니다. 이어서, 100μL 기질(N-메톡시숙시닐-Ala-Ala-Pro-Val-p-니트로아닐리드, 1mM)을 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 25도에서 추가로 40분 동안 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 후, 405 nm에서 분광광도계(Biotek EL800microplate reader)를 사용하여 흡광도를 판독했습니다. 허브 추출물의 억제율은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다.
여기서 A 대조군은 엘라스타제 및 용매를 사용한 완충제의 흡광도이고 Atest는 완충제, 엘라스타제 및 허브 추출물 또는 N-메톡시숙시닐-Ala-Ala-Pro-클로로의 흡광도입니다.
3.9. 콜라게나제 억제 분석
콜라게나아제 억제 활성은 Madrone et al. [92]. 테스트는 50mM TES 버퍼(pH7.4, 0.36mM CaCl2)에서 실행되었습니다. Clostridium histolyticum(ChC-EC.3.4.23.3)의 콜라게나제 효소를 0.8 units/mL의 농도로 제조했습니다(TES 완충액 스톡 용액에 용해됨). 합성 기질 N-[3-(2-푸릴) 아크릴로일]-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA)는 TES 완충 스톡 용액에서 2mM의 농도로 제조되었습니다. 최종 반응 혼합물의 총 부피 15{33}} μL에는 46.3 μL TESbuffer, 60 μL FALGPA(0.8 mM FALGPA 최종 농도), 18.7 μL 콜라게나제 효소(0.1 units/mL 최종 농도) 및 25μL 허브 추출물( 100ug/mL). TES 완충액에 있는 허브 추출물과 효소를 실온에서 15분 동안 배양한 후 기질을 첨가하여 화학 반응을 시작했습니다. 음성 대조군은 TES 버퍼로 수행되었습니다. 기질을 첨가한 후, 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 분광광도계(Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 340 nm에서 흡광도를 즉시 판독하고 다른 것에 대해 연속적으로 측정했습니다. 20분 양성 대조군은 12.5ug/mL의 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 사용하여 수행되었습니다. 샘플의 억제율은 다음과 같은 방정식을 사용하여 계산되었습니다:
여기서 A 대조군은 TES 완충액의 흡광도이고 Atest는 TES 완충액, 콜라게나제 효소 및 식물 추출물 또는 FALGPA의 흡광도입니다.
3.10.'H-NMR 측정을 이용한 대사산물 프로파일링
선택된 허브의 H-NMR을 사용한 대사산물 프로파일링은 Kim et al. [47] 약간의 수정이 있습니다. 미정제 허브 추출물(25mg)을 mL 미세원심분리 튜브로 옮겼습니다. 0.1% 트리메틸 실리프로피온산 나트륨 염(TSP)을 함유하는 Dao(pH 6.{7}})의 메탄올-d4 및 KHPO4 완충액의 혼합물을 총 부피가 { (1:1) 비율에서 {1{18}}}}.7mL. 허브 추출물이 들어 있는 미세원심분리기 튜브를 실온에서 1분 동안 와동시킨 다음 15분 동안 초음파 처리했습니다. 그런 다음 혼합물을 5678g에서 1{33}}분 동안 원심분리하여 용해되지 않는 물질에서 상등액을 분리했습니다. 다음으로, 0.6mL의 투명한 상층액을 NMR 튜브에 넣고 'H-NMR 분석하였다. 'H-NMR의 분석은 499.887MHz의 주파수에서 작동하고 스펙트럼이 26도에서 기록된 500MHz Varian INOVA NMR 분광계(Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)를 통해 수행되었습니다. 모든 단일 스펙트럼은 3.53분의 획득 시간과 20ppm의 너비로 64개의 스캔으로 구성되었습니다. 데이터는 Chenomx 소프트웨어(v.6.2)(Chenomx Inc, Edmonton, AB, Canada)를 사용하여 분석하여 일관된 설정으로 위상 및 기준선 보정을 수행했습니다. 다변수 데이터 분석은 SIMCA 소프트웨어(버전 13.0, Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 수행하였다. 3.11. 'H-NMR 스펙트럼의 버킷팅
H-NMR 스펙트럼의 Bucketing은 Chenomxsoftware(v.6.2, Edmonton, AB, Canada)를 사용하여 구현되었습니다. 모든 스펙트럼은 동일한 매개변수를 사용하여 0.5-10.0 pprn 영역에서 비닝되었습니다. 매개변수에는 §0.04의 스펙트럼 폭이 포함되어 각 NMR 스펙트럼에 대해 총 245개의 통합 영역을 얻었습니다. δ4.{11}}.90 및 δ3.{14}}.35에서 각각 물 및 잔류 메탄올-d에 대한 화학적 이동이 제거되었습니다. 그런 다음 균일하게 비닝된 데이터는 다변수 데이터 분석(MVDA)을 거쳤습니다.
3.12. 대사 산물의 상대적 정량화
확인된 대사 산물은 LH-NMR 스펙트럼의 비닝(binning) 후 신호의 평균 피크 면적을 기반으로 계산된 상대적 정량화를 위해 조사되었습니다.
3.13. 통계 분석
6회 반복의 모든 결과는 평균 ± 표준 편차로 표현되었습니다. 라디칼 소거 활성, 엘라스타제 및 콜라게나제 활성 억제, 대사산물의 상대적 정량화 측정을 위해 Minitab 16(Version 16, Minitab Inc., State College, PA, USA)을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 분산 분석(ANOVA)을 적용하여 p가 있는 평균 간의 유의한 차이를 조사했습니다.<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">
4. 결론
MVDA와 결합된 H-NMR 분석의 적용은 선택된 허브의 대사 산물의 변화를 조사하는 데 성공적이었습니다. PCA 점수 플롯은 클러스터에 따른 허브의 뚜렷한 분리를 보여주었습니다. 이 연구는 P. 마이너스가 DPPH와 ABTS 분석을 통해 가장 높은 라디칼 소거 효과를 가지며 가장 높은 항노화 활성을 나타냄을 보여주었다. PLS 분석의 두 가지 이중 그림은 P. 마이너스에서 확인된 대사 산물과 테스트된 생체 활성 사이에 강한 연관성이 발견되었기 때문에 이 결과를 더욱 검증했습니다. P.minus의 급진적 소거 활성 및 노화 방지 특성에 기여하는 것으로 여겨지는 활성 대사 산물에는 케르세틴, 케르세틴{3}}O-람노사이드, 미리세틴 유도체, 카테킨, 이소르함네틴, 아스트라갈린 및 아피게닌이 포함됩니다. 따라서 이러한 대사산물은 P. 마이너스의 강력한 라디칼 소거 효과와 높은 노화 방지 특성에 대한 책임이 있다고 가정할 수 있습니다. 이러한 대사 산물은 주로 플라보노이드 그룹, 특히 플라보놀에서 유래했습니다. 따라서 P. 마이너스의 대사 산물은 노화 증상을 지연시키고 노화 관련 만성 질환 치료에 사용할 수있는 유망한 자유 라디칼 박멸제 및 노화 효소 억제제가 될 수 있음을 시사 할 수 있습니다. 이러한 발견은 노화 방지제의 잠재적인 천연 공급원이자 천연 자유 라디칼 박멸제로서 P. 마이너스의 효능을 확립하는 데 도움이 될 것입니다.
이 기사는 Molecules 2019, 24, 3208에서 발췌했습니다. doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules