Norwogonin은 PC12 세포에서 저산소증으로 인한 산화 스트레스와 세포 사멸을 약화시킵니다
Mar 18, 2022
자세한 내용은:ali.ma@wecistanche.com
추상적인
배경: Norwogonin은 골격 구조에 3개의 페놀성 수산기를 가진 천연 플라본으로항산화제활동. 그러나, 노르워고닌의 신경보호 효과는 불분명하다. 여기에서 우리는 PC12 세포에서 저산소증에 의해 유발된 산화 손상에 대한 노르워고닌의 보호 능력을 조사했습니다. 방법: MTT assay와 Annexin V-FITC/PI 염색으로 세포 생존율과 세포사멸을 조사하였다. 활성 산소 종(ROS) 함량은 DCFH-DA 분석을 사용하여 측정되었습니다. 젖산탈수소효소(LDH), 말론디알데히드(MDA),항산화제효소 수준은 상용 키트를 사용하여 결정되었습니다. 관련 유전자 및 단백질의 발현은 각각 실시간 정량적 PCR 및 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다. 결과: 우리는 norwogonin이 세포 생존력을 증가시키고 LDH 방출을 감소시키며 세포 형태의 변화를 개선함으로써 PC12 세포에서 저산소증으로 인한 손상을 완화한다는 것을 발견했습니다. Norwogonin은 또한항산화제ROS 소거, MDA 생성 감소, SOD(Superoxide Dismutase), CAT(Catalase) 및 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)의 활성 유지, HIF{0}} 및 VEGF의 발현 수준 감소. 또한, wogonin은 caspase-3, cytochrome c 및 Bax의 발현 수준을 억제하면서 Bcl-2의 발현 수준과 Bcl-2/Bax의 비율을 증가시켜 세포 사멸을 예방했습니다. 결론: Norwogonin은 ROS를 억제하여 PC12 세포에서 저산소증으로 인한 손상을 약화시키고항산화제효소, 미토콘드리아 세포 사멸 경로 억제.
키워드: 노르워고닌,항산화 활성, 저산소증, 산화 스트레스, 세포 사멸
배경
호기성 유기체는 에너지를 생산하기 위해 산소(O2)가 필요합니다. 저산소증은 조직에서 세포 기능을 유지하기 위한 산소 공급이 불충분한 상태로 정의되며 높은 고도와 같은 일부 생리학적 상황과 뇌졸중과 같은 많은 병리학적 상황에서 종종 발생합니다[2]. 뇌는 높은 산소 소비량, 풍부한 불포화 지방산 및 낮은항산화제용량 [3]. 저산소증이 뇌에 악영향을 미칠 수 있다는 증거가 증가하고 있습니다[4-6].
Jing Linlin, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia, Huiping Ma
중국 간쑤성 란저우 730050 PLA의 940번째 합동 병참 지원군 약학부
산화 스트레스와 세포 사멸은 저산소증으로 인한 손상에 기여하는 두 가지 요인으로 간주됩니다[7, 8]. 저산소증 노출은 산화 스트레스를 촉진하는 세포 내 활성 산소 종(ROS)의 생성을 증가시키는 것으로 보고되었습니다. 슈퍼옥사이드 음이온(O2-˙), 과산화수소(H2O2), 하이드록실라디칼(HO•)과 같은 과도한 ROS는 지질, 막, 단백질, DNA를 공격하여 구조적, 기능적 세포 변화를 일으켜 세포 손상을 일으킵니다. 9].
동시에, 과잉 생산된 ROS는 미토콘드리아 투과성 전이 기공(mPTP) [10]의 개방을 촉진하고 미토콘드리아 막의 탈분극과 시토크롬 c의 방출을 유도하는 pro-apoptosis 단백질을 외부 미토콘드리아 막으로 전달합니다 [11]. 이러한 변화는 궁극적으로 미토콘드리아 의존적 세포자멸사를 유발합니다[12]. 그래서 믿어진다.항산화제과도한 ROS를 억제하거나 제거할 수 있는 능력을 가진 이 약은 산화 스트레스와 저산소증에 의해 유도된 세포자멸사를 약화시켜 보호 효과를 발휘할 수 있습니다. 많은 연구들이 그것을 증명했다.항산화제비타민 C[13], 이소플라본[8], 니트록사이드 라디칼[14]과 같은 보충제는 시험관 내 및 생체 내에서 저산소증으로 인한 손상을 제한할 수 있습니다. 플라보노이드는 유비쿼터스 식물 이차 대사 산물의 크고 다양한 부류입니다. 그들은 항상 우수한 자연으로 간주됩니다항산화제자유 라디칼을 제거하고 지질 과산화를 억제하는 능력이 있습니다.
현재, 인간 건강에 대한 유익한 효과로 인해 이러한 부류의 화합물에 점점 더 많은 관심을 기울이고 있습니다. 플라보노이드는 항염증, 항통각수용성 및 신경보호 활성 등과 같은 광범위한 약리학적 작용을 소유하는 것으로 나타났으며, 이 모두는 항산화 활성에 기인할 수 있습니다[15]. 많은 연구에서 플라보노이드가 저산소증으로 인한 부전에 탁월한 보호 효과를 나타내는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 루틴은 저산소증에 의해 유발된 망막 신경절 세포 사멸에 대한 강력한 신경 보호 효과가 있습니다[16]. 최근 연구에서는 루틴이 H9c2 세포에서 산화 스트레스와 세포자멸사를 억제하여 염화코발트에 의한 저산소증 손상을 완화할 수 있음을 보여줍니다[17]. 또한, Liu et al은 nobiletin(3',4',5,6, 7,{13}}hexamethoxy flavone)이 H9c2 세포에서 Akt/GSK{14}} 경로의 활성화를 통해 심근 I/R 손상을 약화시킨다고 제안합니다. [18]. 또한, 아카세틴은 Nrf2 신호 전달 경로의 AMPK 매개 활성화를 통해 저산소증/재산소화 유도 손상에 대해 쥐의 심근세포와 H9C2 심근모세포를 보호할 수 있습니다[19].
Norwogonin(5,7,8-트리하이드록시 플라본, 그림 1)은 인플루엔자와 암 치료에 사용되는 전통 중국 허브인 Scutellaria baicalensis Georgi(중국어로 "Huang Qin")의 뿌리에서 분리된 약리학적 활성 플라본입니다. [20, 21]. 그러나 천연 식물에서 낮은 수준으로 인해 노르워고닌의 생물학적 활성에 대한 연구는 제한적입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 여러 가지 노르워고닌 합성 방법이 보고되고 있다[22, 23].
우리의 이전 연구는 또한 4단계로 크리신에서 노르워고닌을 얻는 간단한 방법을 확립했습니다[24]. 이러한 연구는 노르워고닌의 생물학적 활성에 대한 추가 평가에 긍정적인 영향을 미쳤습니다. 연구에 따르면 노르워고닌은 항산화제[25], 항암제[26, 27], 항바이러스제[28], 항균 활성[29]을 소유하고 있을 뿐만 아니라 시안화물로 인한 ROS 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌습니다[30]. 그러나, 노르워고닌이 저산소증으로 인한 손상에 대한 보호 능력이 있는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 본 연구의 목적은 PC12 세포에서 저산소증으로 인한 산화 스트레스 및 세포자멸사에 대한 노르워고닌의 보호 효과를 조사하는 것이었습니다.
행동 양식
재료 및 시약
Norwogonin(순도 98% 이상)은 이전에 보고된 방법[24]에 따라 합성되었습니다. 루틴(순도 96% 이상)은 Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd.(Xian, Shannxi, China)에서 구입했습니다. Norwogonin과 rutin을 DMSO(sterile dimethyl sulfoxide)에 녹여 -20도에서 보관하고 사용 직전에 세포 배양액에 희석하였다. Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 스트렙토마이신 및 페니실린은 Solarbio co., Ltd.(Beijing, China)에서 구입했습니다.
malondialdehyde (MDA), lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) 및 glutathione peroxidase (GPx) 키트는 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, China)에서 얻었습니다. 2',7'-디클로라이드-하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 및 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,{10}} 디페닐테트라졸륨 브롬화물) 테트라졸륨(MTT)은 Sigma-Aldrich Co(St. Louis, MO, USA)에서 입수했습니다. 저산소증 유발 인자{13}}(HIF{14}}), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), B 세포 림프종{15}}(Bcl{16}}), Bcl{17 }} 관련 X 단백질(Bax), Caspase{18}}, Cytochrome C 및 -actin은 모두 Abcam(Cambridge, UK)에서 구입했습니다. 2차 항체는 ZsBio Company(Beijing, China)에서 구입했습니다.
Beyotime Institute of Biotechnology(Jiangsu, China)에서 apoptosis 분석 키트를 구입했습니다. 모든 화학물질과 용매는 분석 등급이었고 중국의 상업적 공급업체로부터 입수했습니다. 세포 배양 PC12 세포는 중국 과학 아카데미의 Cell Bank(TCR 9, Shanghai, China)에서 구입하고 10%(v/v) FBS, 100U/mL 페니실린 및 100U/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 유지했습니다. 5% CO2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37도. Norwogonin의 세포 독성을 평가하기 위해 PC12 세포(passage 4 ~ 6)를 nor wogonin의 다양한 농도(10- 8 , 10- 7, 10- 6, 10- 5, 10- 4 mol/L)로 사전 배양했습니다. 1시간 후 24시간 동안 배양하였다. 저산소증 노출 세포 저산소증 손상 모델을 유도하기 위해 PC12 세포는 가습 챔버에서 37도에서 24시간 동안 저산소증 환경(1% O2, 5% CO2 및 94% N2)에 노출되었습니다. Normoxic 대조군 세포를 24시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37도에서 배양하였다.
저산소증으로 인한 손상에 대한 노르워고닌의 보호 효과를 평가하기 위해 PC12 세포를 다양한 농도(1{17}}− 8, 1{21}}− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) 저산소증 치료 전 1시간 동안 노르워고닌을 투여합니다. 세포 생존력 세포 생존력은 이전에 기술된 바와 같이 MTT 분석에 의해 측정되었다[31]. 간단히 말해서, PC12 세포(1 x 105 cells/mL)를 96웰 배양 플레이트에 접종했습니다. 그런 다음 다른 농도의 노르워고닌을 웰에 첨가했습니다. 동일한 부피의 DMSO를 대조군 웰에 첨가하였다. 세포 배양 배지에서 DMSO의 최종 농도는 0.1%입니다. 정상 산소 또는 저산소 조건에서 배양한 후, 10 μL의 MTT(5.0 mg/mL)를 각 웰에 첨가한 다음, 37도에서 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음 MTT가 포함된 상층액을 제거하고 포르마잔 생성물을 100μL DMSO에 용해시켰다. 흡광도는 570 nm에서 SpectraMax i3 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 측정되었습니다. 결과는 대조군의 상대 백분율로 표시되었습니다. 유리 커버슬립에 파종된 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색 PC12 세포를 24시간 동안 배양한 후 위에서 설명한 것과 동일한 방식으로 노르워고닌으로 처리했습니다.
배지를 제거하고 유리 커버슬립을 차가운 PBS로 세척한 후 상온에서 메탄올로 10분간 고정한 후 차가운 PBS로 5분간 3회 세척하였다. 마지막으로 H염색 프로토콜에 따라 세포를 염색하였다[32]. 세포의 형태학적 변화를 확인하기 위해 OLYMPUS IX73 현미경(100x)을 사용하여 세포 분석을 수행했습니다. 디지털 이미지는 현미경과 관련된 DXM 1200 C 디지털 카메라(Nikon)를 사용하여 얻었다. ROS 함량 PC12 세포의 세포내 ROS 수준은 DCFH-DA 분석을 사용하여 결정되었습니다[33]. 간단히 말해서, PC12 세포(1 × 105 cells/mL)를 {{12}웰 플레이트에 접종했습니다. 저산소 처리 후, PC12 세포를 PBS로 세척한 다음 10μM DCFH-DA를 포함하는 배양 배지에서 37도의 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포는 Olympus 도립 형광 현미경(Tokyo, Japan)으로 관찰되었고, 여기 파장이 488 nm이고 방출 파장이 525 nm인 Bec ton Dickinson FACScan 유세포 분석기(BD Biosciences, CA, USA)로 분석되었습니다. ROS 수준은 대조군의 상대적 백분율로 표현되었습니다. LDH 누출, MDA 함량 및 항산화 효소 활성 PC12 세포(1 x 105 cells/mL)를 90mm 접시에 파종했습니다. 상기와 같이 저산소 처리 후, 각 접시로부터 50μL의 배양 상등액을 수집하고, 배지 내의 LDH 활성을 상업용 분석 키트(Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China)를 사용하여 검출하고 U/mL로 표시하였다. PC12 세포를 수확하고 차가운 PBS로 2회 세척한 후 균질화하였다. 총 단백질 농도는 BCA protein assay kit로 측정하였다. MDA 함량과 항산화 효소 활성은 상업용 분석 키트(Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China)를 사용하여 결정되었습니다.
MDA의 함량은 nmol/mg 단백질로 표시되었습니다. SOD, CAT 및 GPx의 활성은 U/mg 단백질로 표시되었습니다. 세포 사멸(Annexin-V/PI 염색) 저산소 처리 후 PC12 세포를 채취하여 차가운 PBS로 2회 세척한 후 결합 완충액으로 현탁시켰다. 세포는 제조사(Beyotime, Shanghai, China)의 프로토콜에 따라 Annexin V-FITC 및 PI 용액으로 처리되었습니다. 데이터 수집은 Becton Dickinson FACScan 유세포 분석기(BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 정량적 실시간 PCR 분석 Trizol 시약(Takara, Dalian, China)을 사용하여 PC12 세포의 total RNA를 추출하고 PrimeScript TM RT 시약 키트(AK4301,
다카라, 다롄, 중국). HIF{0}}, VEGF, Bcl{1}}, Bax, caspase{2}}, cytochrome C 및 glyceraldehyde{3}}phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자를 암호화하는 cDNA를 정량적 real- 7300 실시간 검출 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)을 사용한 time PCR. 사용된 프라이머는 표 1에 나와 있습니다. PCR 사이클링 조건은 30초 동안 95도, 5초 동안 95도 및 31초 동안 60도의 40 사이클이었습니다. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 mRNA 수준을 계산하고 참조 유전자인 GAPDH로 정규화했습니다. 웨스턴 블롯 PC12 세포를 수확하고 RIPA 제제에서 균질화하였다. 총 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화되었습니다. 30ug의 샘플을 12% SDS-PAGE 전기영동에서 분리한 다음 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼습니다.
막을 실온에서 1시간 동안 TBST 완충액에 녹인 5% 무지방 분유로 차단하고 1차 항체: 항-HIF-1(1:300, ab179483, Abcam, UK), anti-VEGF(1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl{13}}(1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax(1:500, ab32503, Abcam, UK), 항 카스파제{21}}(1:300, ab44976, Abcam, UK), 항 시토크롬 C(1:1000, ab13575, Abcam, UK) 및 항 액틴(1:2000, ab8227) , Abcam, UK) 4도에서 밤새. 그런 다음, 막을 세척하고 2차 항체(1:2000, ZsBio, Beijing, China;)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. ECL(Enhanced chemiluminescence) 시약을 사용하여 면역반응성 밴드를 시각화했습니다. 밴드의 상대적 강도는 α-액틴 내부 대조군으로 정규화되었고 Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA)을 사용하여 분석되었습니다.
통계 분석
결과는 최소 3번의 독립적인 실험에서 파생된 평균 ± SD로 표시되었습니다. 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Student-Newman-Keuls 사후 테스트를 사용하여 분석되었습니다. < 0.05의="" p-값은="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">
결과
저산소증으로 인한 손상에 대한 Norwogonin 보호 PC12 세포
먼저, 노르워고닌의 증식 활성을 배제하기 위해 정상 PC12 세포에 대한 세포독성을 MTT 분석을 사용하여 결정하였다. 그림 2a에서 볼 수 있듯이 1 × 10-8 -1 × 1{12}}- 5 mol/L 농도의 노르워고닌 처리 후 세포 증식은 크게 변하지 않았습니다(P > 0.05 ). 그러나 Norwogonin의 농도를 1 × 10-4 mol/L로 증가시키면 세포 생존율이 유의하게 감소하였다(P < 0.05).="" 결과는="" 노르워고닌이="" 1="" ×="" 10-="" 8="" -1="" ×="" 10-="" 5="" mol/l="" 농도에서="" pc12="" 세포에="" 대한="" 독성="" 또는="" 증식="" 활성을="" 나타내지="" 않음을="">
그런 다음 우리는 저산소증으로 인한 PC12 세포 손상에 대한 노르워고닌의 보호 효과를 조사했습니다. Fig. 2b에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여 저산소증군의 세포 생존율은 58.71%로 감소하였다(P < 0.{23}}1).="" 저산소="" 처리와="" 비교하여="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" 및="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" 노르워고닌="" 용량="" 의존적으로="" 보호된="" pc12="" 세포="" 생존율을="" 각각="" 58.71에서="" 62.79%(p="">< 0.05),="" 66.68%(p="">< 0.01)="" 및="" 69.88%(p="">< 0.01)로="" 회복하여="" 저산소증으로="" 인한="" 손상에="" 대해="" 세포를="" 회복했습니다.="" 1="" ×="" 10-="" 6="" mol/l="" 루틴을="" 사용한="" 전처리도="" 보호="" 효과를="" 나타내어="" 저산소="" 처리에="" 비해="" 세포="" 생존율을="" 63.78%로="" 크게="" 증가시켰습니다.="" 1="" ×="" 10-="" 5="" mol/l="" 노르워고닌으로="" 전처리한="" 생존율은="" 63.43%로="" 감소했으며,="" 이는="" 저산소증="" 그룹보다="" 여전히="" 유의하게="" 높습니다(p="">< 0.05).="" 이러한="" 결과는="" 노르워고닌이="" 1="" ×="" 10-="" 8="" -1="" ×="" 10-="" 5="" mol/l="" 농도에서="" 유의한="" 세포="" 보호를="" 보였고="" 가장="" 효과적인="" 농도는="" 1="" ×="" 10-="" 6="" mol/l임을="" 입증했습니다.="" 그런="" 다음="" 이="" 용량을="" 다음="" 실험에서="" 최적="" 용량으로="">
Norwogonin의 보호 능력은 또한 형태학적 변화에 의해 확인되었습니다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 저산소증 처리를 하지 않은 PC12 세포는 규칙적인 형태(방추형), 균일한 크기로 잘 성장하였다. 저산소증 노출 후, PC12 세포는 수축, 둥근 모양, 박리 및 감소된 세포 밀도를 나타냈다. 저산소증 노출 전 노워고닌이나 루틴으로 전처리한 세포는 더 잘 성장했고, 박리 세포의 수가 줄어들었고, 세포 모양이 정상적으로 회복되었다. 게다가, 노르워고닌의 보호 능력은 세포막 완전성의 손실과 관련된 LDH 누출에 의해 확인되었습니다. 도 2d에 나타낸 바와 같이, 배양 배지에서의 LDH 활성은 저산소 노출 후에 현저하게 증가하였다(P <>
노르워고닌 또는 루틴으로의 전처리는 LDH 누출을 극적으로 감소시켰으며, 이는 노르워고닌과 루틴이 세포막 완전성을 회복했음을 시사합니다. Norwogonin은 PC12 세포에서 저산소증으로 인한 산화제 스트레스를 억제합니다. ROS와 MDA는 저산소증으로 인한 세포 산화제 스트레스의 두 가지 중요한 지표입니다. 도 3a 및 b에서 볼 수 있는 바와 같이, 저산소증 노출 후 PC12 세포에서 ROS 및 MDA 함량이 상당히 증가된 것으로 관찰되었다. Norwogonin 또는 루틴 전처리는 ROS와 MDA의 생성을 유의하게 억제했습니다.
SOD, CAT 및 GPx와 같은 항산화 효소는 세포의 산화 스트레스에 대한 주요 방어 시스템으로 간주됩니다. 도 3c-e에 도시된 바와 같이, 저산소증 노출은 PC12 세포에서 SOD, CAT 및 GPx의 활성을 유의하게 억제하였다. 노르워고닌이나 루틴으로 치료하면 이러한 변화가 역전되고 항산화 효소의 활성이 회복되었습니다. 이러한 모든 결과는 노르워고닌이 저산소증에 의해 유발된 산화 스트레스로부터 PC12 세포를 보호한다는 것을 나타내었다.